Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo e continua a ser o mais prevalente. Interação entre PI3K /AMPK /AKT e MAPK é um efector crucial no crescimento e progressão do câncer de pulmão. Estas proteínas cinases de transdução de sinais servem como bons alvos terapêuticos para o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que compreende até 90% dos cancros do pulmão. Aqui, descrevemos se 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), um derivado triterpen�de activa de

Poncirus trifoliate

, pode exibir propriedades anticancerígenas, regulando esses sinais e modulam a ocorrência de resistência a múltiplas drogas em células NSCLC. Descobrimos que 21α-MMD inibiu o crescimento e colônia formação de células de câncer de pulmão sem afetar o fenótipo de células de pulmão normal. 21α-MMD também revogada a atividade metastático de células de câncer de pulmão através da inibição da migração e invasão celular, e induziu G

0 /G

1 célula parada do ciclo com o aumento da geração intracelular ROS e perda da integridade da membrana mitocondrial. 21α-MMD regulamentou as expressões de PI3K AKT AMPK e MAPK sinalização //o que nos levou a avaliar ainda mais a sua actividade na resistência a múltiplas drogas (MDR) em células de câncer de pulmão, especificando na P-glicoproteína (P-gp) /MDR1-associação. Empregando as células A549 paclitaxel-resistentes estabelecidos (A549-PACR), encontramos ainda que 21α-MMD induziu uma atividade de reversão MDR através da inibição da P-gp /expressões MDR1, função e transcrição com sensibilidade paclitaxel recuperou que pode dependente correlacionar a regulação da via /sinalização mTOR PI3K. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram, pela primeira vez, a avaliação mecanicista

in vitro

de 21α-MMD exibindo crescimento de inibição potencial com influência sobre MDR reversão em células de câncer de pulmão humano.

Citation : Aldonza MBD, Hong JY, Bae SY, Song J, Kim WK, Oh J, et al. (2015) Supressão de MAPK Sinalização e Reversão de MDR1-Associated multirresistência mTOR-Dependent por 21α-Methylmelianodiol em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 10 (6): e0127841. doi: 10.1371 /journal.pone.0127841

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 28 de agosto de 2014; Aceito: 21 de abril de 2015; Publicação: 22 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Aldonza et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão (2005 e 12172MFDS989) do Ministério da Food and Drug Safety e da Fundação Nacional de pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pelo o Governo da Coreia (MEST) (No. 2009-0083533)

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a a maioria de cancro comum em todo o mundo por décadas, e é responsável por cerca de 1,38 milhões de mortes a cada ano para homens e mulheres nos Estados Unidos sozinho. O prognóstico associado à doença é muito pobre atrasando o diagnóstico até estágios avançados final e opções de tratamento são limitadas, resultando em taxa de mortalidade quase 90% devido ao fracasso do tratamento causados ​​por progressão de metástase não detectado [1]. Os produtos naturais têm sido utilizados como agentes terapêuticos médicos há séculos com tantos como 70% de todas as drogas aprovadas para a quimioterapia clínica, bem como para o tratamento do cancro do pulmão, entre 1981 e 2002 que consiste de ou produtos naturais ou produtos químicos sintéticos e derivados baseados em produtos naturais. [2]. No entanto, o mecanismo pelo qual a maioria dos produtos naturais exibem o seu potencial terapêutico é menos bem compreendido. Triterpenóides foram tomando uma atenção crescente nos últimos tempos na terapêutica de câncer de pulmão por causa de sua quimiopreventivo relatados e potencial terapêutico tanto

in vitro

e

in vivo

[3,4]. 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD) é um triterpen�de natural e um isômero do 21-methylmelianodiols isoladas primeiro dos frutos do

Poncirus trifoliata

(Rutaceae), que tem sido muito utilizado na medicina oriental como um remédio para alergia inflamação. Em relatórios recentes, 21α-MMD exibidos actividades anti-inflamatórias funcionais [5]. No entanto, não houve nenhum relatório de avaliação ainda mais a sua anticancerígeno potencial e mecanismo de ação no câncer de pulmão.

Cancro vias de sinalização, incluindo fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /AKT /target da rapamicina em mamíferos associadas à sobrevivência (mTOR ) e mitogen-activated protein kinase (MAPK) e de câncer associado ao metástase vias AMPK têm um papel central na regulação das atividades funcionais induzidas por drogas como a apoptose induzida por danos no DNA, inibição do crescimento celular e anti-metastáticos utilitários /progressão [6 , 7], com actividade funcional fundamental pronunciada reguladora na proliferação de células do cancro do pulmão e sobrevivência [8]. Os mecanismos moleculares exatos responsáveis ​​pela maioria das atividades anticancerígenas induzida por triterpenóides envolvendo essas vias clássica ainda têm de ser elucidados em detalhes para incorporar novas estratégias terapêuticas para melhores resultados.

Outra causa fundamental da falha do tratamento de câncer de pulmão é a ocorrência de resistência a múltiplas drogas (MDR), o principal mecanismo pelo qual muitos cancros se tornam resistentes a um amplo espectro de agentes quimioterapêuticos. PI3K /AKT e MAPK sinalização têm sido amplamente envolvidos no desenvolvimento do cancro do pulmão na MDR. A estimulação destas vias torna as células de tumor de pulmão resistente a fármacos quimioterapêuticos citotóxicos, tais como paclitaxel, para impactar ainda mais a função celular [9,10]. A sensibilidade a diferentes quimioterápicos varia amplamente de paciente para paciente. No entanto, um mecanismo molecular pode ser apontado para projetar eficazmente justificativa combinação tratamentos quimioterápicos, ou seja, visando a MDR1 (ABCB1) gene codificado P-glicoproteína (P-gp), responsável por bombear para fora uma variedade de xenobióticos e substâncias endógenas de dentro para a região extracelular das células [11]. Evidências recentes têm enfatizado a interação entre a sinalização mTOR e P-gp /MDR1-mediada MDR no carcinoma hepatocelular e câncer colorretal [12,13]. Este tipo de associações levaram para caracterizar funcionalmente o potencial mecanismo de regulação de alvejar o PI3K /AKT e MAPK via e subsequente comprometimento da atividade de P-gp [14,15]. Além disso, uma série de estudos também sugeriram o desenvolvimento de medicamentos à base de flavonóides e triterpenóides que podem atingir esses sinais de forma subsequente um categoria dos inibidores de P-gp e aumentam a actividade de várias drogas anti-cancro, tais como o paclitaxel e doxorubicina [16 -18].

o objetivo deste estudo, portanto, foi identificar mecanicamente o modo de ação de 21α-MMD em células NSCLC humanas e relacionar ainda mais o seu mecanismo de regulação do crescimento celular e sinais relacionados com a sobrevivência, tais como o PI3K /AKT /AMPK e MAPKs com P-gp /ocorrência MDR-associados MDR1 em um fenótipo de câncer de pulmão. Caracterização dos mecanismos de ação da 21α-MMD pode levar a novos insights de desenvolvimento terapêutico para combater o crescimento, a atividade metastática, bem como a ocorrência de MDR em cancros do pulmão humanos.

Materiais e Métodos

Reagentes

de ácido tricloroacético (TCA), (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), sulfo-rodamina B (SRB), iodeto de propídio (PI ), ARNase A, paclitaxel, 5- fluorouracilo (5-FU), anticorpo monoclonal de murganho anti-actina-β anticorpo,-dicloro-hidro diacetato de fluoresceína (DCFH-DA), rodamina 123, violeta de cristal, N-acetil-L- cisteína (NAC), e outros reagentes, a menos que indicado de outra forma foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, EUA). RPMI 1640, soro fetal de bovino (FBS), solução de antibiótico-antimicótico e tripsina-EDTA foram adquiridos a partir de Invitrogen (Grand Island, NY, EUA). monoclonal de rato anti-fosfo-ERK (Tyr 204), anti-c-myc e anticorpo policlonal de coelho anti-ciclina A, B1 anti-ciclina, e anti-ciclina, anti -CDK2, anti-CDK4, anti-Rb e anti-fosfo-Rb, anti-ERK 1/2, MAPK anti-p38, anti-fosfo AKT, anti-Akt, anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Monoclonal de rato anti-fosfo-JNK /SAPK (Thr 183 /Tyr 185), anti-JNK /SAPK, anti-fosfo-p38 (Thr 180 /Tyr 182), anti-AMPK, anti-fosfo-AMPKα (Thr 172), anti-PI3K, e p85 anti-fosfo-PI3K (Tyr 458) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Alexa Fluor anti-IgG de coelho marcado com 488-galinha foi comprada a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Monoclonal de rato anti-P-gp e isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com anticorpo monoclonal anti-P-gp foi comprado de Abcam (Cambridge, MA, EUA). O éster etílico de tetrametilrodamina corante lipofílico catiónico (TMRE) foi adquirido a partir de Molecular Probes (OR, USA). ON-TARGETplusTM (SmartPool) mTOR e mexidos siRNAs foram adquiridos da Thermo Scientific-Dharmacon RNAi Technologies (Suwanee, GA, EUA). O composto de teste, 21α-MMD, foi isolado a partir dos frutos de

P. trifoliata

como previamente descrito [19] e fornecido pelo Dr. S. H. Lee, um co-autor, na Faculdade de Farmácia da Universidade Yeungnam, Coreia.

linhas de células e condições de cultura

células cancerosas do pulmão humano (A549, H460, H1299 H358 e H292) , células humanas normais de pulmão (L132 e MRC-5), células de cancro da mama humano (MDA-MB-231), células de tumor epitelial da mama ductal humano (T47D), células de cancro do fígado humano (SK-HEP-1), e gástrica humana células cancerosas (SNU-638) foram fornecidos pelo celular coreana Linha Bank (Seul, Coréia). As células A549 paclitaxel-resistente (A549-PACR) foram desenvolvidos por nosso grupo a partir de células A549 parental, através da exposição contínua a aumentar gradualmente concentrações de paclitaxel manter o crescimento contínuo e bem morfologia parental-like [20]. As células foram cultivadas em DMEM (para células MRC-5, células MDA-MB-231 e SK-HEP-1, células) e meio RPMI-1640 (para A549, A549-PACR, H358, H1299, H460, H292, T47D, e SNU -638 células) suplementado com 10% de FBS inactivado por calor e antibióticos e antimicóticos (PSF; 100 unidades /ml de penicilina G sódio, 100 ug /ml de estreptomicina, e 250 ng /mL de anfotericina B). As células foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO

2 numa atmosfera humidificada.

Ensaios de Proliferação de Células

A proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio colorimétrico MTT excepto para o rastreio preliminar da actividade anti-proliferativa de

P

.

trifoliata

compostos ativos que foi realizado por ensaio SRB. As células foram semeadas a uma densidade de 3-5 x 10

4 culas por po em placas de 96 poços com um volume total de 200 uL /​​poço e foram deixadas durante a noite para recolocar. Após 24 h de incubação as células foram tratadas com várias concentrações de 21α-MMD, H

2O

2, drogas, como combinação física ou no, ou controlo de DMSO continuamente nos cursos de tempo indicados. Após o tratamento, as células foram fixadas com solução de TCA a 10% e foram submetidas a ensaios SRB ou MTT. Para o ensaio de MTT, as células foram incubadas em MTT (0,5 mg /ml) contendo meio de cultura a 37 ° C durante 4 h. meio sobrenadante foi removido e DMSO (200 mL) foi adicionado a cada poço e misturou-se completamente para dissolver MTT. Para o ensaio de SRB, as células foram incubadas com solução de SRB a 0,4% durante 30 min. O SRB não ligado foi removido rapidamente por lavagem das cavidades cinco vezes com ácido acético a 1% e, em seguida, seco ao ar. 100 ul de tampão Tris (0,01 M, pH 10,4) e agitou-se suavemente durante 5 minutos num agitador mecânico. A absorvância foi medida a 570 nm para ensaio de MTT, enquanto 515 nm para ensaio de SRB com subtracção de fundo comum a 650 nm (dia zero ou replicar controlo) por Versamax leitor de microplacas (Molecular Devices Inc., Toronto, Canadá). Os valores de absorvância foram expressos como uma percentagem do que para as células de controlo não tratadas ou DMSO, e a concentração de fármacos testados o qual foi calculado pela fórmula% de viabilidade = ((Dia Ave. Abs.Drug-Ave.Abs.Zero) /(Ave. Abs.Control-Ave. Dia Abs.Zero)) x 100. os sub

50 valores IC foram calculados como a droga que inibe a proliferação celular em 50% em comparação com controlos utilizando análise de regressão não-linear (percentagem de sobrevivência em função da concentração) . Todos os experimentos foram realizados utilizando quatro repetições e repetida pelo menos três vezes de forma paralela em cada fármaco /concentração do composto.

Formação de Colónias Ensaio

monocamadas de células foram tratadas durante 20 horas com 21α- MMD a várias concentrações, em seguida, colhidas, contadas, e semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1500 células por poço. Depois de 1-1 semanas e meia, de colónias macroscópicas aderentes foram lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído a 2% e coradas com violeta de cristal (0,5% w /v) e, em seguida, contadas visualmente ou utilizando software de imagem J.

combinação da droga Análise

As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 culas por po em placas de 96 poços com concentrações crescentes de 21α-MMD, paclitaxel, e 5-FU sozinho ou em combinação na sua razão molar equipotente concomitantemente. actividade inibidora do crescimento das combinações foi medida pelo ensaio de MTT. Os efeitos combinados foram analisados ​​utilizando o método de análise do efeito mediano e pelo cálculo do índice de combinação (IC) utilizando a equação: IC = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, em que D

1 e D

2 são as concentrações do composto e da droga combinada que alcançaram o efeito esperado, e (D

x)

1 e (D

x)

2 são as concentrações que atingem efeitos semelhantes quando os compostos são usados ​​sozinhos. inibição de 50% foi escolhido como o indicador de eficácia. O IC foram calculados foi então comparados com valores de referência relatada [21].

análise do ciclo celular e a incorporação de BrdU Ensaio

Análise dos efeitos de 21α-MMD sobre a distribuição do ciclo celular foi realizada pelo método previamente descrito [22]. As células foram tratadas com ou sem 21α-MMD durante 24 h em 10% de meio suplementado com FBS. As células foram colhidas, lavadas duas vezes e fixadas em 70% durante a noite etanol frio a -20 ° C. As células fixadas com etanol foram sedimentadas, lavadas com PBS gelado e ressuspensas em solução de coloração contendo /mL de PI, 0,1% de Triton-X-100, 0,1% de citrato de sódio a 50 ug e 100 ug /ml de RNase. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente no escuro, as células activadas por fluorescência foram separadas e o conteúdo em ADN celular analisada por citometria de fluxo utilizando o citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) equipado com um laser de árgon e dados foram avaliados utilizando o software CellQuest 3.0.1 (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Pelo menos 20.000 células foram usadas para cada análise. A alteração na percentagem de distribuição de células em cada fase do ciclo celular foi determinada e os resultados são apresentados como histogramas. A proporção de células em diferentes fases do ciclo celular foi, em seguida, gravada com, pelo menos, triplicado, e expressos como média ± DP. Além disso, um ensaio de incorporação de BrdU colometric (Abcam) foi realizado para medir a taxa de síntese de ADN. Resumidamente, as células foram tratadas com ou sem 21α-MMD durante 24 h, no mesmo meio como acima. BrdU é adicionado a células cultivadas em microplacas seguido de 4 horas de incubação a incorporar BrdU no ADN das células em proliferação. sobrenadante de cultura foi removido, seguido pela fixação. As células foram então incubadas com um anticorpo anti-BrdU conjugado com peroxidase. BrdU ligado é detectado por uma reacção de substrato e quantificado por medição da absorvância a 350 nm.

Medição de intracelular ROS

ROS intracelular foi medido por citometria de fluxo (Becton Dickinson, FACSCalibur) tal como descrito anteriormente [ ,,,0],23]. Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de 1 x 10

4 células /mL em prato 60 milímetros estéril durante 24 h, e foram tratados com ou sem 21α-MMD durante 24 h para detectar ROS muda. As células foram colhidas e lavadas duas vezes e coradas com 1 mL de DCFH-DA na concentração de 10 uM, o qual foi utilizado como sonda para avaliar a produção de ROS. As células foram então incubadas a 37ºC durante 40 min e o comprimento de onda de excitação de pico de DCFH-DA oxidado a 488 nm com emissão a 525 nm foram analisadas por citometria de fluxo. produção de ROS foi expressa como média intensidade de fluorescência (MFI), calculado através do software de celular Quest. Detecção de ROS foi também examinada por microscopia de fluorescência. Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 células /mL em lamelas de pratos e incubadas durante a noite para fixação. As células foram então tratadas com várias concentrações de 21α-MMD ou NAC, individualmente ou em combinação, durante 24 h a 37ºC. As lamelas foram removidos dos pratos e as células foram coradas com 40? M DCFH-DA, durante 40 min. As células foram lavadas duas vezes com PBS para remover o excesso de corante. As lamelas foram montadas em lâminas de vidro e as imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência em uma ampliação de 200X.

Medição da mitocondrial potencial transmembrana (Δѱm)

Alterações no potencial mitocondrial foram avaliados utilizando a fluorescente TMRE corante potenciométrica. O corante lipofílico catiónico TMRE funciona por entrar na célula na forma de um éster o qual é subsequentemente hidrolisado e convertido para tetrametilrodamina, que é reversivelmente acumulada na matriz mitocondrial carregado negativamente dependendo transmembranar mitocondrial potencial exibindo acumulação potencial-dependente em mitocôndrias. Para analisar o Δѱm após o tratamento 21α-MMD, as células foram de crescimento a uma densidade de 1 x 10

5 células por poço, durante 24 h em 24 poços da placa de cultura estéril tratadas com ou sem 25 uM de 21α-MMD para 24 h. Vinte minutos antes do final do período de incubação, as células foram lavadas com PBS e TMRE corante a 100 nM foi carregado durante 10 min a 37ºC. As células foram tripsinizadas e recolhidas com PBS frio seguido pela medição da intensidade de fluorescência por citometria de fluxo (Becton Dickinson, FACSCalibur) e analisados ​​utilizando software CellQuest 3.0.1.

Migração e invasão celular Os ensaios

alterações na migração de células foram determinadas e Transwell ensaios sem a incorporação de Matrigel. Para o ensaio transpoço migração, as células foram semeadas sobre as câmaras superiores do placas de 24 transpo� com 200 mL de soro médio fome (sem FBS). Após o tratamento com vários agentes, as células foram deixadas migrar para fora do tempo estipulado para as câmaras inferiores contendo meio de 800 mL com 10% de FBS para induzir a quimiotaxia. células migradas foram visualizadas por coloração com violeta de cristal (0,5% w /v), após lavagem com PBS e fixação com metanol. As imagens foram recolhidas e analisadas usando Juli FL microscópio auxiliado com o software Imagem J. ensaio celular invasão foi realizada em placas de Transwell de 24 cavidades com (PVDF) de filtros de policarbonato (tamanho de poro de 8 um, Corning, EUA). Matrigel foi diluída para 1 mg /ml com meio de cultura sem soro e aplicado sobre o inserto nas câmaras superiores do com múltiplas cavidades para a placa do ensaio de invasão. As células na densidade de 2 x 10

4 culas por po foram semeadas para dentro da câmara superior da unidade 200 Transwell em meio de cultura isento de soro uL. A câmara inferior do aparelho foi adicionado 800 mL com meio de cultura suplementado com FBS a 10% para a indução de quimiotaxia. Depois de incubação com ou sem 21α-MMD (5 | iM; IC

50) durante 24 h a 37 ° C, o meio na câmara superior foi aspirado para fora, e uma haste de algodão foi utilizado para remover as células no lado superior da membrana. As células que invadiram a parte inferior da membrana foram coradas com violeta de cristal (0,5% w /v) e visualizado e teve sob Juli FL microscópio. Todos os resultados são expressos como a percentagem de células que migraram ou invadido, em comparação com o controlo (células não tratadas).

Rodamina-123 (Rho-123) Acumulação Ensaio

As alterações na função de efluxo P-gp em células A549-PACR foram determinados em paralelo às alterações na acumulação de Rho-123 corante. As células foram semeadas em pratos de 30 mm a uma densidade de 1 x 10

5 células por prato. As células foram pré-tratadas com várias concentrações de 21α-MMD para 24 e 48 h. 0,5% de DMSO foi usado como controle. Após o pré-tratamento, as células foram incubadas com 1 ug /mL de Rho-123 corante no meio de cultura a 37 ° C e 5% de CO

2 no escuro durante 90 min. Após a acumulação de Rho-123, as células foram tripsinizadas a partir da monocamada de células subconfluentes em placas de cultura, e o sedimento celular foi lavado duas vezes com PBS gelado. As células foram então analisadas utilizando imediatamente FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) equipado com um laser de árgon de 488 nm. A concentração de Rho-123 em cada amostra foi determinada a partir das medições de fluorescência por a construção de Rho-123 curva padrão. A concentração intracelular de Rho-123 foi normalizada pela quantidade de proteína e expressa como nmol de proteína /g. A fluorescência verde de Rho-123 foi medida utilizando um filtro passa-banda de 530 nm [24]. A função de efluxo de P-gp foi monitorada em termos de diminuição da exportação de Rho-123 com a incorporação de células A549 parentais utilizado como controle negativo.

Imunocitoqu�ica

P-gp localização, imunofluorescência, e observação de ADN fluorescente em células A549 /A549-PACR foram observadas utilizando Zeiss LSM 780 ApoTome microscópio (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). As células A549 /A549-PACR foram semeadas em 30 mm pratos com escorregas e incubadas durante a noite. As células foram pré-tratadas com várias concentrações de 21α-MMD ou meio isento de drogas durante 48 h. Todas as lavagens foram realizadas com PBS e todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente salvo indicação em contrário. As células foram lavadas duas vezes. Após incubação de tratamento, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (em PBS) durante 15 min e, em seguida, bloqueadas com BSA a 1% (em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente, as células foram incubadas com anticorpo primário de P-glicoproteína em 4 ° C durante a noite, depois lavou-se por duas vezes adicionais. Permeabilização com Triton X-100 não foi incluída uma vez que a proteína alvo, a P-gp, é uma proteína transmembranar. Após a incubação durante a noite, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC durante 2 h à temperatura ambiente. DAPI (0,5 ug /ml) foi usada para contracoloração os núcleos e armazenado a 4 ° C antes da microscopia.

Proteína Lisados, ensaio de Western Blot, e imunoprecipitação

As células foram semeadas em pratos estéreis de 100 mm durante 24 ou 48 h, e foram expostas a várias concentrações de 21α-MMD. Para determinar os níveis de expressão de proteínas alvo, foram preparados extractos de células inteiras. Tratadas ou células não tratadas foram lisadas e as quantificações de proteína foram determinadas usando o ensaio de Bradford [25]. As proteínas foram isolados por tampão de lise (Beyotime, China) [20 mmol /L de Tris (pH 7,4), 250 nmol /L de NaCl, 2 mmol L de EDTA /(pH 8,0), 0,1% de Triton X-100, 0,01 ug /mL de aprotinina , 0,005 ug /mL de leupeptina, 0,4 mol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e 4 mmol /L NAVO

4], seguido por centrifugação dos lisados ​​a 14000 rpm durante 10 min, utilizando Thermo Sorvall Legenda Micro 21R Centrifugador Refrigerated (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) para remover o material insolúvel e medido usando o Nanodrop 1000 espectrofotómetro (Thermo, EUA). As células foram rompidas por sonicação e extraiu-se a 4 ° C durante 30 min. Os homogenatos foram centrifugados a 14000 rpm durante 30 min para remover as mitocôndrias e outros fragmentos insolúveis e, em seguida, os sobrenadantes foram de novo centrifugadas como acima, para assegurar a remoção completa das mitocôndrias. Os sobrenadantes de lisados ​​de células inteiras foram recolhidos e mantidos a -80 ° C. A proteína total (100 ug) em cada ligado de células foi resolvido em várias percentagens de géis combinados com os pesos moleculares das proteínas alvo por electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato de dodecilo e sódio (SDS-PAGE) e foi electro-transferidas para membranas de PVDF de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com tampão de bloqueio (leite seco a 5% sem gordura em tampão fosfato salino-Tween 20 0,1%, PBST, pH 8,0) durante 2 h à temperatura ambiente e foram ainda incubadas com anticorpos específicos diluídos em TBST durante a noite a 4ºC . Depois de se lavar com TBST três vezes, as membranas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente. Visualização dos imunocomplexos foi realizada utilizando o PowerOpti-ECL-kit (Animal Genetics Inc., Coreia) e uma LAS 4000 Imager (Fuji Film Corp., Tóquio, Japão).

Extração de RNA e Real-Time reverso transcrição-PCR

RT-PCR e em tempo real de RT-PCR foram realizadas para avaliar MDR1 ARNm, ciclina e, e as expressões de genes de ARNm após o tratamento com CDK2 ou sem 21α-MMD ou siARN, como indicado. As células a uma densidade de 1 x 10

5 células /placa em placas de 100 mm foram tratados com 21α-MMD para vários intervalos de tempo. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e depois lisadas com reagente TRI para ARN inicial passo isolado. O ARN foi extraído por meio da adição de clorofórmio, e o ARN isolado foi precipitado com álcool isopropílico. Os sedimentos de RNA foram lavados com etanol 70%, seco ao ar, e, em seguida, dissolvido em água isenta de nuclease. A absorvância foi medida a 260 e 280 nm para determinar a concentração e pureza do ARN. O ARN total (1 a 2 ug) foi transcrito de forma reversa utilizando a transcriptase reversa de AMV e oligo (dT) 15 primers. Uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada numa mistura reaccional contendo cDNA, dNTP 0,2 mM, mistura, 10 pmol de iniciadores específicos para o alvo com sequências listadas como se segue: MDR1 (para a frente: 5′-3′-CCCATCATTGCAATAGCAGG; reverso: 5′ -GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′), mTOR (forward: 5′-ACTCGCTTCTATGACCAACTGA-3′; reversa: 5′-TTGAAGGTCTCAAACATGAT-3′), ciclina E (para a frente: 5′-CGGGTCCACAGGATGCGAAGGA-3′; reversa: 5′-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA- 3′), CDK2 (a seguir: 5′-3′-CATTCCTCTTCCCCTCATCA; reverso: 5′-3′-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG), e 0,25 U de polimerase de ADN Taq utilizando o sistema de PCR GeneAmp 2400 (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA) para amplificar o ADNc. O ciclo limite foram determinados (TC) valores. Os níveis de expressão de mRNA relativos foram normalizados para qualquer β-actina (para frente: 5′-AGGCACCAGGGCGTGAT-3′; reversa: 5′-GCCCACATAGGAATCCTTCTGAC-3′) ou GAPDH (forward: 5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′; reversa: 5′ -CCATCACGCCACAGTTTCC-3 ‘) como indicado, dividindo-o por os valores médios de Ct do controle interno para que a amostra (Δ-Ct). Os níveis de transcrição normalizados foram expressos relativamente à amostra obtida a partir do controlo de DMSO (ΔΔ – Ct), e o nível de expressão de ARN relativa foi apresentada como 2-Ct-Δ [26]. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de agarose a 2%. O gel foi corado com solução corante SYBR segura-10000 vezes diluído e visualizados sob um transiluminador de UV (Alpha ImagerYM, Alpha Innotech Corp., EUA). PCR em tempo real foi realizado utilizando um sistema MiniOpticon (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), utilizando-se 5 uL de produto da transcrição reversa, 10? L de iQTMsupermix (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), 0,5 mL de iniciadores e sondas em um volume total de 20 uL. Foram empregues condições termociclador padrão como segue: 95 ° C durante 5 min antes do primeiro ciclo, 95 ° C durante 10 seg, 56 ° C durante 30 segundos, repetido 40 vezes

transientes A transfecção de ARN interferente pequeno. (siRNA)

o silenciamento de mTOR com siRNA (25 nM) foi conseguido através de reagentes de transfecção DharmaFECT seguindo o manual de instrução para a transfecção transiente em células A549-PACR. Scramble siRNA (25 nM), usado como controle, também foi. O reagente mistura foi adicionada a cada poço por prato contendo 200 uL de meio isento de soro e isento de antibiótico para um volume total de 300 uL, e as células foram incubadas durante 4 h a 37 ° C. Um volume igual de meio foi então adicionada a cada poço. A seguir à transfecção durante 24 h após o plaqueamento, as células foram enriquecidas com 10% de FBS, incubadas durante mais 24 h, com 25 uM de 21α-MMD e as células foram recolhidas e submetidas a análise. O knockdown de expressão de mTOR foi examinada por immunoblotting tal como descrito acima, utilizando anticorpo anti-mTOR. A sequência de mTOR siRNA foi 5′- AAGAAUCAAAGAGCAGAGUGC-3′.

Análises Estatísticas

Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão para o número indicado de experiências realizadas independentemente e analisados ​​utilizando um teste t de Student por não-paramétrico de Mann-Whitney U-test para valores que não foram distribuídos normalmente, ANOVA de uma via, e Spearman testes de correlação se necessário, de software v5.01 GraphPad Prism (GraphPad software, La Jolla, CA, EUA). Valores com

p

. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Os efeitos anti-proliferativa dos compostos de

P

.

trifoliata

em linhas de células humanas de câncer

cumarinas e triterpenóides a partir dos frutos de

P

.

trifoliata

foram previamente descritos por exibirem efeitos anticancerosos potentes contra uma variedade de modelos de células de cancro [27-29]. Com base nessas informações, os

in vitro

atividade citotóxica de 13 compostos isolados a partir dos frutos de

P

.

trifoliata

contra MDA-MB-231, T47-D, SNU-638, SK-HEP-1, e linhas celulares de cancro humano A549 foram avaliados utilizando o ensaio de SRB. Como mostrado na Tabela 1, triterpenóides mostrou o mais promissor por inibição de um painel de células cancerígenas com IC

50 valores em menos de 50 intervalos de micro-molar. Entre os compostos de teste, 25-triterpenóides methoxyhispidol A, 21α-methylmelianodiol (21α-MMD, Figura 1A), e 21α, 25-dimethylmelianodiol exibiram a actividade anti-proliferativa mais activa. Os dados sugerem que a actividade anti-proliferativa de 21α-MMD é potente quando testados em células de cancro do pulmão humano A549, que dirigido para estudar ainda mais o seu mecanismo de acção num painel maior de modelos de células NSCLC.

( a) a estrutura química do 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), um triterpenoide natural isolado a partir do fruto de

P. trifoliata

. (B) MRC-5 e L132 linhas de células de pulmão humanas normais e A549, H460, H358, H1299, e linhas celulares de cancro de pulmão humano H292 foram semeadas em placa de 96 poços e foram tratadas com várias concentrações de 21α-MMD durante 24 h e O crescimento celular foi analisada através do teste de MTT e representados graficamente como percentagem de células viáveis. Os valores são comparados com o valor de controlo correspondente. (C) formação crescimento clonal de células do cancro do pulmão indicados foi realizada após um período de crescimento de 7 dias após uma única administração de várias concentrações de 21α-MMD. Imagens à esquerda indicadas são violeta de cristal colónias coradas enquanto à direita são gráficos que representam medições de contagem das colónias. (D e E) de microscopia de contraste de fase foi realizada sobre as células após exposição a 25 uM 21α-MMD para identificar alterações na morfologia e o ADN foi observado por DAPI (inferior esquerdo) e por PI (direita) coloração observada por microscópio confocal. células H1299 e A549 (F) foram incubadas com 5 ^ M 21α-MMD durante 24 h seguida por análise de invasão celular.