Abstract

Fundo

Os nossos estudos anteriores mostraram uma regulação de GRIM-19 em cânceres primários humanos cervicais, e restauração da regressão do tumor induzida GRIM-19. A indução de ubiquitinação proteína p53 supressora de tumor e a degradação por E6 oncoportein de alto risco de HPV-através da formação de um complexo estável com E6AP é considerada como um mecanismo fundamental para o desenvolvimento do tumor do colo do útero. Os objetivos deste estudo foram determinar o papel potencial do GRIM-19 no resgate da proteína p53 e induzindo a apoptose de células de câncer cervical.

Metodologia /Principais Achados

Os níveis de proteína de GRIM-19 e p53 foram detectados em tecidos cervicais normais de 45 pacientes que se submeteram a histerectomia para fins diferentes neoplasias, quer do colo do útero ou do endométrio, e os tecidos de câncer cervical de 60 pacientes com não-metastáticos carcinomas epiteliais escamosas razões. Coimmunoprecipitation e ensaio suspenso GST foram realizados para examinar a interacção de desagradável-19 com 18E6 e E6AP

in vivo e in vitro

respectivamente. A competição de 18E6 com E6AP na ligação GRIM-19 através da realização de ensaios de competição pull-down foi projetado para examinar o rompimento do complexo E6 /E6AP por GRIM-19. O Augment de E6AP ubiquitinação por desagradável-19 foi detectada in vivo e in vitro de ensaio de ubiquitinação. Os efeitos do GRIM-19 dependente de acumulação de p53 sobre a proliferação celular, ciclo celular, apoptose foram exploradas por MTT, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, respectivamente. A supressão do tumor foi detectado pelo modelo de rato de xenotransplante.

Conclusão /Significado

Os níveis de GRIM-19 e p53 foram simultaneamente até regulamentada em cancros cervicais. A restauração do desagradável-19 pode induzir a ubiquitinação e degradação de E6AP, e perturbar o complexo /E6AP E6 através da interacção de N-terminal do desagradável-19 com ambas E6 e E6AP, que protegida da degradação de p53 e promoveu a apoptose celular. estudos de xenoenxerto de tumor revelou também a supressão de degradação de p53 na presença de desagradável-19. Estes dados sugerem que GRIM-19 pode bloquear complexo /E6AP E6; e sinergicamente suprimir o crescimento de tumor cervical com p53

Citation:. Zhou Y, Wei Y, Zhu J, Wang Q, Bao L, Ma Y, et al. (2011) GRIM-19 interrompe E6 /E6AP Complexo de Resgate p53 e induzir a apoptose em cancros cervicais. PLoS ONE 6 (7): e22065. doi: 10.1371 /journal.pone.0022065

editor: Scott A. Coonrod, Universidade de Cornell, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Abril de 2011; Aceito: 14 de junho de 2011; Publicação: 12 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa): 2007CB914503 https://www.973.gov.cn, National Natural Science Foundation da China (No. 81.071.683, 81.001.168 81.072.127 e 91.029.710) http: //www.nsfc .gov.cn, “Décima Primeira Five-Year” Programa Nacional de Apoio Tecnológico (2008BAI57B03) https://kjzc.jhgl.org, Institutos Nacionais de Saúde concede CA105005, CA78282 e P30-CA134274 https://grants.nih.gov. projeto de Anhui Provincial Natural Science Foundation (20090413117, 11040606M178) https://www.ahkjt.gov.cn e Provincial Ciência Natural Projeto de Pesquisa de Anhui Provincial do Ensino Superior Universitário (KJ2010B375) https://www.ahedu.gov.cn/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

de alto risco papilomavírus humano (HR-HPV), como HPV18 e HPV16, não só é uma importante causa de câncer cervical [1], mas também os agentes patogénicos de um subconjunto de outros tumores, como cabeça e pescoço carcinomas escamosos [2], o cancro do pulmão [3] câncer aerodigestivo superior do trato [4] e câncer anogenital [5]. A expressão de oncoproteínas virais E6 em carcinomas cervicais HPV-positivos [6] pode interagir com a proteína E6-associado (E6AP) para formar E6 complexo /E6AP que induz especificamente a ubiquitinação e degradação rápida de p53, de transcrição nuclear factor X-caixa de ligação 91 (NFX1-91) e PDZ proteínas contendo o domínio, através da via do proteassoma [7], [8], [9], [10]. degradação p53 é um requisito essencial para a sobrevivência de tumores HR-infectadas pelo HPV; assim bloqueando E6 /E6AP complexo degradação mediador p53 pode ser uma abordagem atraente para o tratamento de cancros com infecção HR-HPV [11], [12], [13], [14].

GRIM-19 foi originalmente identificado como uma proteína supressora de tumor que estava envolvido na morte celular [15] por meio da associação e supressão da STAT3 [16], [17]; A sua expressão é regulada negativamente em renal, próstata e cancros cervicais [16], [17], [18], [19], [20]. Além disso, GRIM-19 suprime a remodelação induzida pelo oncogene do citoesqueleto e motilidade celular [21]; e progressão do ciclo celular, interagindo com supressor de tumor p16INK4a [22]. Assim, desagradável-19 exerce mecanismos distintos em uma variedade de tipos de células. Aqui nós relatamos que GRIM-19 induz a acumulação de p53 através de uma perturbação do complexo E6 /E6AP e uma indução de auto-ubiquitinação de E6AP em células de cancro do colo do útero. Este estudo demonstra uma função nova e um mecanismo molecular pelo qual GRIM-19 inibe HR-HPV tumorigênese induzida por proteger p53 da degradação.

Resultados

GRIM-19 e p53 são simultaneamente reprimidos na cervical cancros

Nossa anteriormente estudo demonstrou que GRIM-19 induz a regressão do tumor cervical em um rato modelo de xenotransplante, sugerindo um possível papel do GRIM-19 na regulação do crescimento do tumor [20]. Desde supressor de tumor p53, também é baixo expressa em tumores do colo do útero, que ainda examinado se existe uma correlação entre os níveis de desagradável-19 e p53. Os níveis de desagradável-19 e p53 foram significativamente (

P

0,01) menor nos tumores, e directamente correlacionados uns com os outros em 99% dos tumores cervicais (Fig. 1). Consistente com um baixo p53 nos tumores, um gene alvo p53 bem estudado, Puma, também foi regulada negativamente nos tumores em comparação com tecidos normais (Fig. 1). Estes resultados demonstraram que os níveis de GRIM-19 e p53 foram simultaneamente suprimida, sugerindo uma ligação potencial entre GRIM-19 e p53 no cancro cervical.

(A) Total de extractos celulares (50 ug) de tumores cervicais primários (T ) e tecidos cervicais normais (N) foram examinados quanto à expressão de desagradável-19, p53 e PUMA por Western blotting. Os resultados representativos de Western blot são mostrados. T1-T4 foi de pacientes individuais com câncer cervical. T1 e T2 foram diagnosticados como IIa fase; e T3 e T4 foram diagnosticados como estágio Ia carcinomas epiteliais escamosas. (B) A análise quantitativa da expressão da proteína, conforme medido pela densidade óptica de cada banda. A razão entre a densidade do desagradável-19, p53, PUMA através da GAPDH correspondente (45 casos de tecido normal e de 60 casos de tecido de tumor) foi calculada.

desagradável-19 aumenta os níveis de proteína p53 em células cervicais de tumor

Para investigar mais a relação entre GRIM-19 e p53, as células HeLa, quer com superexpressão (pG19) ou knockdown (siG19) do GRIM-19 foram utilizados, e os níveis de GRIM-19 e p53 foram avaliadas por transferência de Western (Figura 2A). Curiosamente, quando em comparação com o controlo correspondente (P /SICON) células, o p53 e os seus genes alvo PUMA e p21 aumentado em células HeLa /células pG19 (Fig. 2A, painéis esquerdos) e diminuiu em HeLa /células siG19 (Figura 2A, painéis direitos ). Além disso, duas outras linhas celulares de cancro do colo do útero, SiHa e CaSki, foram transfectadas com um plasmídeo de expressão desagradável-19 ou ARNcd segmentação desagradável-19 e em comparação com os respectivos controlos. Resultados semelhantes aos observados em células HeLa foram obtidos nestas células também (Fig. 2B). Além disso, testes em outras linhas de células tumorais sem HPV (A549 e HO8910) não revelaram os mesmos resultados como observado em HeLa (Fig S1). Assim, os níveis de GRIM-19 diretamente correlacionados com os de p53 em células cancerosas cervicais

. (A B) Os níveis de proteína de GRIM-19 e p53 em cancros cervicais primários. Western blotting com os anticorpos indicados foi realizada utilizando lisados ​​de linhas celulares indicadas. (C) Efeito de desagradável-19 sobre a expressão de ARNm de p53. O mRNA de 19 GRIM-(painel esquerdo) significativamente elevados em HeLa /células pG19 (*

p Art 0,01), o painel da direita mostra a expressão do mRNA do p53. As diferenças não são estatisticamente significativas. (D) desagradável-19 não afectou a actividade de p53-promotor. Utilizou-se um repórter p53-Luc. Os dados apresentados são a média de três experiências independentes com amostras em triplicado em cada ensaio. (E) desagradável-19 aumenta a semi-vida de p53. As células foram tratadas com CHX (100 ug /ml) durante os períodos de tempo indicados e os lisados ​​foram submetidos a transferência de Western com os anticorpos indicados. Os resultados representativos de um de três experiências independentes são apresentados (painel da esquerda). O restante valor para o p53 foi calculada como a razão entre os valores densitométricos de p53 através de GAPDH em cada amostra (painel da direita). Os demais valores médios de três experiências independentes foram representados graficamente. (F) GRIM-19 degradação p53 inibiu

in vivo

. Antes da colheita, as células foram tratadas com MG132 durante 4 h, e imunoprecipitação com anticorpo de p53 foi realizada. Western blot dos produtos IP foi realizada com o anticorpo ubiquitina. anticorpos GAPDH foram utilizados para determinar a carga comparável.

Para investigar se desagradável-19 p53 aumentado através da regulação da transcrição, os níveis de ARNm de p53 foram examinados por ensaio de RT-PCR quantitativo e repórter de luciferase foram realizados em células HeLa /células HeLa PCON e /pG19. O nível de mRNA p53 não foi afetada pela superexpressão de GRIM-19 (Fig. 2C). Além disso, a p53 repórter de luciferase conduzida pelo promotor não revelou alterações significativas na actividade do promotor de p53 em células HeLa /PCON e células HeLa /pG19 (Fig. 2D), o que sugere que não desagradável-19 está envolvida na activação da transcrição de p53.

em tumores cervicais, p53 é raramente mutante [23], e é rapidamente degradada por E6 /E6AP [6], [24], que em seguida examinado se aumento dos níveis de p53 é devido à meia-vida aumentada das proteínas . HeLa /pG19 e HeLa /células PCON foram tratados com níveis cicloheximida e proteína p53 foram monitorados ao longo do tempo. De facto, a semi-vida da proteína p53 foi significativamente (

P

0,01), prolongada em células HeLa /pG19 em comparação com células HeLa /PCON células (Figura 2E.).

In vivo

ensaio de ubiquitinação também mostrou que p53 ubiquitinada em células HeLa /pG19 foi drasticamente reduzida em comparação com HeLa /células PCON (Figura 2F).

Em conjunto, estes resultados sugerem que GRIM-19 restaurados os níveis de p53 através de estabilização de proteínas, em vez de transcrição-regulação em tumores cervicais.

GRIM-19 estabiliza a proteína p53 interagindo com proteínas E6 e E6AP

degradação p53

E6 /E6AP mediada é considerada como um mecanismo importante na iniciação e desenvolvimento de carcinomas cervicais [23], [25]. Desde GRIM-19 liga-se a 16E6 [26], a hipótese de que GRIM-19 interfere com complexo de E6 /E6AP, protegendo assim p53 da degradação. Usando ensaios de imunoprecipitação com lisados ​​celulares de células HeLa, encontramos a interação de GRIM-19 com E6AP

in vivo

(Fig. 3A). Em seguida, examinaram a interação GRIM-19-E6AP

in vitro

com ensaios suspensos GST. E6AP codifica três isoformas proteicas diferentes (I, II e III) que diferem nas suas caudas N-terminal, todos os quais têm a capacidade de estimular E6 mediada por degradação dependente de ubiquitina da proteína p53 [27]. Porque vários domínios funcionais de E6AP tinha sido previamente identificado [28], foram geradas três plasmídeos recombinantes expressando E6AP-III eliminações baseado em isoformas His-tag: pE6AP-Δ1 (1-286 aa), pE6AP-A2 (287-521 aa) e pE6AP-Δ3 (522-872 aa). locais de ligação E6 foram localizados entre os aa 287-521 de E6AP-III, enquanto que o domínio HECT pelos locais de ligação da ubiquitina foi localizado no segmento 522-872 AA (Fig. 3C) [29]. Descobrimos que apenas E6AP-Δ3 ligado a GST-tagged desagradável-19 por GST ensaio pendente (Fig. 3B-C), mas não o E6AP cataliticamente inactivo contendo uma mutação no Cys na posição 840 (Fig S2), estes resultados apoiado a nossa conclusão de que GRIM-19 pode ligar o domínio HECT de E6AP. Para mapear a região exata interagindo de GRIM-19 com E6AP, foram empregados marcado com GST GRIM-19 eliminações pGST-G19-Δ1, pGST-G19-A2 e pGST-G19-Δ3; E encontrou que os aminoácidos 1-35 da desagradável-19 eram suficientes para a ligação de proteínas E6AP (Fig. 3D).

os ensaios (A) Co-imunoprecipitação foram realizados para determinar a interacção entre desagradável-19 com E6AP

in vivo

. Os lisados ​​de células HeLa a partir de células foram imunoprecipitados com IgG normal e anti-desagradável-19 anticorpos e Western colocados a hibridar com anti-E6AP. Entrada (preIP) pista representa 10% do extracto utilizado na reacção de imunoprecipitação. HC = IgG cadeia pesada. (B) GST experimentos suspensos foram realizados para examinar a interação de deleções E6AP His-marcadas com GST-proteína fundida GRIM-19

in vitro

. (C) Diagrama esquemático da E6AP indicando vários domínios funcionais, incluindo os sítios de ligação para GRIM-19. (D) A interação de GST-GRIM-19 eliminações com E6AP. * Indica a posição da banda com o peso molecular correcto. (E) ensaios de co-imunoprecipitação foram realizados para determinar a interacção entre desagradável-19 com 18E6. Os lisados ​​celulares a partir de células HeLa transfectadas com o p18E6-Flag foram sujeitos a IP com os anticorpos indicados. Entrada (preIP) pista representa 10% do extracto utilizado na reacção de imunoprecipitação. LC = IgG cadeia leve. (F) A interação de GST-GRIM-19 eliminações com 18E6. * Indica a posição da banda com o peso molecular correcto. (G) mapeamento Exclusão dos sítios de ligação E6 ou E6AP no GRIM-19.

Nós relatamos a interação de GRIM-19 com 16E6 antes [26], nós, então, explorada a associação de GRIM -19 e 18E6. Devido à baixa expressão de E6 e pobre reactividade de anticorpos E6 disponíveis que têm sido relatados por um certo número de publicações [30], [31], [32], [33], que não conseguiu obter um blot satisfatória 18E6 ocidental do Os lisados ​​celulares. Portanto, um plasmídeo p18E6-Flag que expressa uma proteína marcada com Flag 18E6 foi construído. Através de ensaios de imunoprecipitação em células HeLa transfectadas com p18E6-Bandeira, encontramos 18E6 co-precipitada com GRIM-19

in vivo

(Fig. 3E). Para mapear a região exata interagindo de GRIM-19 com 18E6, empregamos o sítio de ligação de GRIM-19 com 18E6 usando marcado com GST GRIM-19 deleções (pGST-G19-Δ1, pGST-G19-A2 e pGST-G19- Δ3); E descobriu que os aminoácidos 1-35 de GRIM-19 foram suficientes para a ligação de proteínas 18E6

in vitro

(Fig. 3F).

Concluímos, portanto, que GRIM-19 pode ligar tanto 18E6 e E6AP

in vivo e in vitro

, que pode desempenhar um papel na proteína acumulação de p53.

GRIM-19 interrompe E6 /E6AP complexo e aumentar E6AP ubiquitinação e degradação

Dada que tanto 18E6 e E6AP-Δ3 pode interagir com os aminoácidos 1-35 de N terminal do GRIM-19 (Fig. 3G), determinou-se o 18E6 competia com E6AP na ligação GRIM-19 através da realização de ensaios de competição suspensos. Na presença da proteína GST-G19 purificado e aumentando a quantidade de E6AP-Δ3, a ligação do 18E6 à desagradável-19 diminuiu progressivamente à medida que E6AP-Δ3 aumentou (Fig. 4A). Embora E6AP-Δ2 falhou para interagir com GST-G19, é bem conhecido que esta região E6 abriga sítios de ligação a [28]. Portanto, nós testamos se GST-G19 e E6AP-Δ2 competir na ligação com 18E6. Na presença de E6AP-Δ2, GST-G19-bound 18E6 18E6 diminuiu em relação ao apresentado isoladamente (Fig. 4B). Além disso, não observamos uma associação de E6AP-Δ2 com GST-G19 na presença de 18E6, sugerindo que as proteínas não podem formar um complexo heterotrimeric de 18E6 /E6AP-Δ2 /GST-G19.

(A ) os ensaios competitivos foram realizadas para analisar a ligação do 18E6 à proteína de fusão GST-19-DESAGRADÁVEL na presença de quantidades crescentes de E6AP-Δ3 que variam de 0-6 ug. (B) suspenso experimentos para determinar a ligação do 18E6 para GST-GRIM-19 proteínas. Onde as proteínas E6AP-A2-indicados (10 ug) foram adicionados a reação Pull-down GST. (C) GRIM-19 aumentada E6AP degradação

in vivo

. Antes da colheita, as células foram tratadas com MG132 durante 4 h, e imunoprecipitação com anticorpo foi realizada E6AP. Western blot dos produtos IP foi realizada com o anticorpo ubiquitina. anticorpos GAPDH foram utilizados para determinar a carga comparável. (D)

In vitro

E6AP ensaio de ubiquitinação. ubiquitina recombinante humana, E1, E2 (UbcH5c), batereria-expressa e GST purificada e GTS-GRIM-19, E6AP (de tipo selvagem ou cataliticamente inativa CA mutante) de extrato de germe de trigo foram misturados para

in vitro

ensaio de ubiquitinação E6AP e imunotransferidas com anticorpo ubiquitina. (E) Os lisados ​​de células inteiras a partir de células HeLa que expressam os plasmídeos de expressão foram indicados Ocidental colocados a hibridar com os anticorpos indicados.

tem sido bem estabelecido que pode ter como alvo E6AP-se para ubiquitinação, que representa um mecanismo para controlar sua própria meia-vida [7], [34]. Em seguida, se explorar a expressão de desagradável-19 pode influenciar a degradação de E6AP, na presença de sobre-expressa desagradável-19, E6AP ubiquitinada significativamente aumentada em comparação com células HeLa /PCON células (Fig. 4C). Em ubiquitination ensaio in vitro mostraram que GRIM-19 aumentou a autoubiquitination do tipo selvagem E6AP, mas não o seu mutante CA dominante negativo por usando purifed E1 e E2 (UbcH5c), bactérias expressas GRIM-19, e do tipo selvagem E6AP e CA mutante E6AP traduzidos no sistema de gérmen de trigo extracto (Fig. 4D). De fato, encontramos proteína E6AP foi diminuída em células com superexpressão GRIM-19 (Fig. 4E, S1).

Em resumo, podemos concluir que GRIM-19 evita a degradação da p53, impedindo a formação do complexo E6 /E6AP e promove ubiquitinação e degradação de E6AP.

GRIM-19 atrasos G0 /G1 transição, inibe a proliferação celular e induz a apoptose, e promoveu acúmulo de p53 in vivo

Dado que induções de parada do ciclo celular e crescimento celular supressão são as principais funções de p53, que ao lado avaliou o efeito do desagradável-19 dependente de estabilização de p53 no ciclo celular. análises de distribuição de ciclo celular revelou uma transição G0 /G1 significativamente retardado em células HeLa /pG19 quando comparado com células HeLa /PCON células (Tabela 1). Além disso, tal como indicado pelo ensaio de MTT, a proliferação celular de células HeLa /pG19 foi significativamente (p 0,05). Suprimida no dia 3 e no dia 4 (Fig. 5A), em comparação com células HeLa /PCON

(A ) Um ensaio de MTT foi realizado nas células indicados. ensaio de MTT foi realizado como em Materiais e Métodos. Cada ponto de dados representa a média ± SE de 8 amostras. (B) As características morfológicas de HeLa /PCON e as células HeLa /pG19 foram examinadas por microscopia eletrônica de transmissão. condensação da cromatina, expansão e lacunas membrana nuclear alargadas, estrutura da membrana nuclear vaga, fraturas de membrana nuclear e expansão retículo endoplasmático foram indicados com setas. ER, retículo endoplasmático; NM, membrana nuclear. (C) O comprimento total e forma clivada da caspase-3 e PARP em células HeLa /PCON e células HeLa /pG19 foi determinada por análises Western blot. (D) de HeLa /Con e HeLa /G19 células foram transplantadas em ratinhos nus atímicos fêmeas de 6 semanas de idade (10 ratinhos para cada linha de células) e cultivadas durante 6 semanas. Os tumores foram colhidos, e os pesos foram medidos. Os dados apresentam a média de 10 tumores em cada grupo. (E) A expressão de desagradável-19, p53, p21, Puma, p27 e E6AP nos tumores derivados de ratinhos, tal como determinado por análises de Western blot, e os resultados representativos são apresentados. (F) um modelo de colaboração entre GRIM-19 e p53. Quando desagradável-19 está presente em níveis elevados, que interage com o complexo de E6 /E6AP, promove a sua ubiquitinação, assim, prevenir a degradação de p53. A perda de 19 GRIM-permite que o ataque do complexo E6 /E6AP em p53 e sua degradação através do proteassoma.

Como promover a apoptose celular é outra função chave do p53, foi realizada a apoptose celular incluindo ensaios de microscopia electrónica de transmissão (TEM) e transferência de Western com anticorpos de caspase 3 e PARP. Uma gama de características de apoptose primeiros foram indicados em células HeLa /pG19, incluindo a condensação da cromatina nuclear, ampliou gap membrana nuclear, estrutura da membrana nuclear vaga, fraturas de membrana nuclear e expansão retículo endoplasmático; No entanto, estes fenómenos não foram observadas em células HeLa /PCON (Fig. 5b setas). Além disso, a clivagem de caspase 3 e PARP foi aumentada em células HeLa /pG19 em comparação com células HeLa /PCON células (Fig. 5C).

Descobrimos também os pesos dos tumores nos murganhos transplantados com células HeLa /pG19 foi significativamente reduzida em comparação com as dos grupos de controlo (

P

0,05) (Fig. 5D). Sombrio 19 e p53, em conjunto com p21, p27 e proteínas PUMA foram significativamente aumentada, mas E6AP foi diminuída em tumores derivados de células HeLa /pG19 em comparação com tumores de células HeLa /PCON (fig. 5E).

Finalmente, com base nas nossas observações, um modelo para 19 desagradável-apoptose celular induzida por disrupção do complexo E6 /E6AP e estabilizar p53 foi especulado (Fig. 5F). Este modelo sugere que a presença de desagradável-19 promove a auto-ubiquitinação e degradação de E6AP por interacção com estas proteínas e contribui para a estabilização de p53, a paragem do crescimento e apoptose.

Discussão

alto risco papilomavírus humanos (RH-HPV), como HPV18 e HPV16, estão associados com 99,7% dos cânceres cervicais [35], que são os tumores ginecológicos mais comuns nos países em desenvolvimento [36]. As oncoproteínas virais E6 e E7 são expressas em carcinomas cervicais HPV-positivos [6], ao passo que a proteína E2 virai reprime a transcrição de oncogenes E6 /E7 e ativa a replicação do DNA viral, juntamente com a helicase E1 viral [37], [38], [39]. A degradação mediada E6 /E6AP de p53 é considerado um mecanismo mais importante na iniciação e desenvolvimento de cânceres cervicais [6], [11], [12], [25], [40], [41]. Estudos recentes sugeriram que a interferência do complexo de E6 /E6AP pode matar tumores cervicais, aumentando o nível de proteína p53 [11], [12], [40]. Em nosso estudo, nós apresentamos uma nova abordagem para evitar a degradação da p53 pela restauração do GRIM-19 que interrompe o complexo /E6AP E6.

Tem sido relatado que GRIM-19 pode suprimir a atividade transcricional de STAT3 por meio protéica crescimento interacção proteína, e inibir o cancro [16], [17]. STAT3 foi mostrado para inibir a expressão de p53 através de uma repressão transcricional das vias de sinalização induzida por oncogenes src em certas linhas celulares de roedores [42]. Alguns estudos em linhas celulares de cancro mostraram uma correlação entre altos de atividade STAT3 e gene p53 mutações constitutivas, embora as relações de causa e efeito não foram estabelecidas [43]. Em certa cabeça e pescoço carcinomas escamosas, estado de p53 tem sido demonstrado para baixo regular NF-kB e a expressão do gene da STAT3 induzida por [44]. Nós mostramos em nossa publicação anterior que GRIM-19 perda correlaciona-se com uma elevada actividade de STAT3 em cancros cervicais primários [20]. Embora essas observações sugerem a possibilidade de que a perda de GRIM-19 promove a atividade alta STAT3, que poderia, em última instância transcrição regulam negativamente a expressão da p53, nossos estudos não revelaram (fig 2C . D) quaisquer mudanças na expressão de repórter de luciferase dirigido por p53 humana promotor e de ARNm de p53 endógena. Portanto, STAT3 desregulamentação pode não ter consequências directas para a expressão da p53 em nosso modelo. Assim, dois desagradável-19 vias independentes: 1) uma activação da STAT3 e 2) uma regulação para baixo da p53 ocorrem em simultâneo de HPV transformado carcinomas cervicais para a promoção da tumorigénese após a perda de expressão desagradável-19. Mais importante ainda, a interferência com a expressão STAT3 usando RNA

i

ou a sua função utilizando abordagens negativas dominantes (Fig S3) não alterou significativamente as GRIM-19 efeitos na estabilização de p53. Portanto, p53 estabilização de proteínas por GRIM-19 parece ocorrer independentemente da STAT3.

Neste artigo, nós também testou se GRIM-19 inibe a degradação de p53 na ausência de E6. células negativas Dois HPV e HO8910 A549 que ambos contendo p53 do tipo selvagem [45] foram examinadas quanto à sua expressão de p53, após sobre-expressão de desagradável-19. Embora desagradável-19 foi capaz de aumentar a degradação de E6AP nestas duas células, os níveis de proteína de p53 permaneceram inalterados (Fig S1), o que sugere que desagradável-19 é capaz de prevenir a degradação de p53 E6-dependente.

relatórios recentes têm demonstrado que a desagradável-19 pode interagir com outras proteínas fisiológicas importantes, tais como HtrA2 [46]; Além disso, as proteínas virais, tais como U95 e vIRF1 também se pode ligar a desagradável-19 [21], [26], [47]. Temos demonstrado anteriormente uma associação entre 16E6 e GRIM-19 [26]; aqui, também encontramos a interação de GRIM-19 com 18E6 e E6AP

in vivo

e

in vitro

, ea indução da degradação autoubiquitination de E6AP por GRIM-19. Em células de cancro do colo do útero de infecção pelo HPV-RH, desagradável-19 foi capaz de induzir a acumulação de proteína p53 e de aumentar genes alvo, tais como p53 e p21 PUMA. Além disso, alterações significativas no perfil do ciclo celular, proliferação celular, e os sinais morfológicos de apoptose característicos foram observados em células HeLa sobre-expressão de desagradável-19. Assim, GRIM-19 e p53 podem sinergicamente suprimir o crescimento de células de câncer cervical.

E6AP é um regulador crítico de degradação da p53 em cancros cervicais humanos de uma forma dependente E6. Além fromp53, E6 complexo /E6AP foi reportado para interferir com diversas funções celulares [48], incluindo activadores da transcrição, tais como IRF3, co-activadores, tais ASP300, indutores de apoptose, tais como Bak, GADD34, pro-caspase-8 e seus adaptador FADD, cinases de proteínas tais como TYK2, moléculas de adesão celular tais como Paxilina e NFX1-91, a moléculas que atenua a actividade da telomerase associados. Na maioria destes casos, os alvos complexos E6 /E6AP estas proteínas para degradação para permitir a transformação oncogénica [48]. E6 interacção com E6AP tem sido relatada como sendo importante para a carcinogénese da pele em modelos de ratinho transgénicos [49], [50]. E6AP também tem como alvo proteínas de uma forma independente de E6. De facto, vários substratos tais como os membros da família Src de quinases de proteína [51], proteína Polycomb Ring1B [52] e a proteína da leucemia promielocítica (PML) [53] foram relatados. Naturalmente que ocorrem mutações E6AP esporádicos estão associados com a síndrome de Angelman, uma forma grave de atraso mental, em que a acumulação de agregados de proteínas não degradadas tem sido relatada [52], [54], [55], [56]. Assim, a proteína E6AP em associação com E6 e em algumas situações, por sua própria desempenha um papel central na degradação de proteínas controlar várias patologias humanas.

Como E6AP também actua como um coactivador dupla função para receptores de hormonas esteróides (SHR) incluindo receptor de progesterona, receptor de estrogénios, receptor de androgénio, o receptor de glucocorticóides, receptor de ácido retinóico-α e do receptor da hormona da tiróide [29], [57], e os aminoácidos de 170-680 são o domínio de activação de E6AP [29], a interacção de GRIM-19 com E6AP (522-872 aa) pode prever que GRIM-19 provavelmente regula a transcrição do gene SHR-dependente.

Em resumo, os nossos estudos, pela primeira vez mostram um novo mecanismo pelo qual desagradável-19 blocos complexo de E6 /E6AP; e com a colaboração entre duas proteínas supressoras de tumor distintas na regulação do crescimento celular.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Todos os tecidos cervicais foram obtidos de pacientes que se submeteram a histerectomia entre janeiro de 2008 e Novembro de 2009, Anhui Hospital Provincial filiada à Universidade médica de Anhui, Hefei, China. O estudo foi analisado e aprovado pelo conselho de ética revisão de Anhui Hospital Provincial. consentimento por escrito foi obtido de cada paciente.

Todos os procedimentos experimentais com animais realizadas neste estudo foram aprovados pelo Laboratório Animal da Comissão de Ética de Anhui Provincial Hospital Filiado à Universidade de Medicina Anhui sob licença número 201000179, e foram em conformidade com as orientações para cuidados com os animais estabelecidas por esta Comissão.

os tumores

Uma parte dos tecidos recém-excisadas foram incluídos em parafina, cortados em secções de 5 a 7 mm de espessura para o diagnóstico patológico, e o resto do tecido foi congelado a -80 ° C para posterior utilização para extrair proteínas e RNA. estágios clínicos foram determinados por um patologista ginecológica certificado de acordo com a Federação modificado Internacional de Ginecologia Obstetrícia (FIGO) sistema de estadiamento para o câncer cervical em 2000. Os 60 não-metastáticos carcinomas epiteliais escamosas analisados ​​nestes estudos foram HPV16 ou HPV18 positivo e pertencia ao digitar Ia (13 pacientes), Ib (9 pacientes) e IIa (38 pacientes). Além disso, 45 tecidos cervicais normais de pacientes submetidas à histerectomia para fins que não neoplasia, quer do colo do útero ou do endométrio razões foram recolhidos e usados ​​como controles normais neste estudo.

Cultura de células e transfecção

Humano linhas celulares de cancro cervical HeLa, SiHa e CaSki e o adenocarcinoma do pulmão humano A549 a linha celular de American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas DMEM com soro bovino fetal a 10%. A linha de células de cancro do ovário humano HO8910 foi comprado de banco de células da Academia Chinesa de Ciências [58], [59] e cresceu em completa RPMI-1640. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foi utilizado para transfecção. O estavelmente transfectadas linhas de células HeLa /PCON e HeLa /pG19 expressar vetor de controle e humano GRIM-19, respectivamente, foram descritos anteriormente [20].

xenotransplantes tumorais

Os animais foram criados em laboratório padrão condições. Dois grupos (10 em cada grupo) de ratinhos de 6 semanas de idade, do sexo feminino atímicos nu (Beijing centro animal experimental) foram implantados subcutaneamente no flanco direito de ratinhos com tanto HeLa /pG19 ou células HeLa /PCON (1 × 10

7) em 0,1 ml de PBS contendo 50% de Matrigel. Todos os ratinhos foram alojados num ambiente isento de organismos patogénicos. No final da experiência (6 semanas após o implante), os murganhos foram sacrificados, os tumores foram recolhidos e pesados. Uma porção de cada tumor foi processada para análises de imuno-histoquímica e bioquímicas, e o restante foi congelada a -80 ° C até à sua utilização.

Os plasmídeos

Os plasmídeos LZRSpBMN-ligante-IRES-EGFP-STAT3C (STAT3C) expressando um STAT3 mutante constitutivamente ativo e LZRS pBMN-ligante-IRES-EGFP-STAT3DN (STAT3DN) expressando um STAT3 mutante dominante negativo foram presentes do Dr. Hodge DR, como descrito anteriormente [60]. Os vazios vetor Pires-Puro2-Myc (PCON) e Pires-Puro2-GRIM-19-Myc (pG19) que expressam uma marcada com myc GRIM-19 foram descritos anteriormente [20].