Abstract

Aim

p16

metilação ocorre frequentemente na carcinogênese . Embora tenha sido a hipótese de que os

estados p16

metilação são mantidos de forma dinâmica em células cancerosas, evidência direta apoiando esta hipótese não estava disponível até agora.

Métodos

A fusão modelo celular foi estabelecido que o padrão reprogramado de metilação de ADN nativo das células. O estado de metilação dos

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alelos foi então repetidamente analisados ​​quantitativamente no monoclonal fusão, linhas celulares de cancro parentais (

p16

-Completamente metilado-AGS e não metilado-MGC803) e HCT116 não- célula de fusão usando DHPLC e seqüenciamento bissulfito. metilação de histona foi analisada por meio de imuno-precipitação cromatina-PCR (ChIP). status de expressão P16 foi determinada utilizando imuno-coloração e RT-PCR.

Resultados

O estado de metilação para a maioria da

p16

alelos foi mantida de forma estável no monoclonal fusão células após 60 passagens. Mais importante ainda, focal metilação de novo, desmetilação, e hidroximetilação foram consistentemente observadas dentro de cerca de 27% de

p16

alelos nos monoclones de fusão, mas não as células parentais homozigóticas metilados ou não metilados. Além disso, subclones das monoclones consistentemente mantido o mesmo

padrão de p16

metilação. Um fenômeno semelhante também foi observado usando o

HCT116 p16

hemi-metilado linha de células de câncer de não-fusão. Curiosamente, a transcrição não foi observada em

p16

alelos que foram hidroximetilado com um padrão específico anti-sentido de cadeia?. Além disso, os níveis de H3K9 e trimethylation H3K4 nas células de fusão foram encontrados para ser um pouco menor do que os AGS parentais e MGC803 células, respectivamente.

Conclusão

O presente estudo fornece a primeira evidência direta confirmando que os estados de metilação de

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ilhas CpG não é apenas homeostaticamente mantida, mas também acompanhada por um processo dinâmico de metilação transitória focal, desmetilação e hidroximetilação em células cancerosas

Citation:. Qin S, Li Q, Zhou J, Liu Zj, Su N, Wilson J, et al. (2014) Homeostáticos Manutenção do alelo-específico

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metilação em células cancerosas Acompanhado pela Dynamic Focal metilação e hidroximetilação. PLoS ONE 9 (5): e97785. doi: 10.1371 /journal.pone.0097785

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de fevereiro de 2014; Aceito: 22 de abril de 2014; Publicado: 14 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Qin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo National Science Foundation Natural da China [Grant 31261140372 e 81171900], Programa Nacional de Pesquisa básica da China [Grant 2011CB504201 e 2010CB529303], e Pequim Natural Science Foundation da China [Grant 7.122.033]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dajun Deng é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

A metilação do DNA é considerada uma das modificações epigenéticas mais estáveis ​​em mamíferos. Os estados de metilação de genes de diferenciação celulares relacionadas têm sido mostrados para ser altamente dinâmico durante células germinativas e desenvolvimento pré-implantação, mas tornam-se relativamente estática durante o desenvolvimento de tecidos somáticos [1] – [3]. Em contraste, os estados de metilação de genes relacionados com adaptação dinâmica hospedeiras permanecem em tecidos somáticos, a fim de permitir que para a resposta adequada a exposição ambiental e factor de patogénese subsequente [4] – [6]. Hidroximetilação de ADN está intimamente envolvido na alteração de estado de metilação do gene e tem sido encontrado para não só desempenhar um papel-chave na desmetilação de ADN, mas também servem muitas das suas próprias funções [7], [8].

supressor tumoral P16 codificado pelo INK4 /locus de ARF dentro cromossoma humano 9p21 é um regulador do ciclo celular envolvidos na inibição de G1 → transição de fase S através da via de P16-CDK4 /6-RB [9]. O locus é transcricionalmente silenciados em células estaminais embrionárias, e desempenha um papel limitante da velocidade na reprogramação de células pluripotentes induzidas [10]. Embora um fragmento de deleção 9p21 é a alteração genética mais freqüente encontrada em todos os tipos de câncer [11], a hipermetilação de ilhas CpG ainda é o principal mecanismo de inactivação p16 em vários cancros humanos [12] – [14]. De facto, uma série de estudos de coorte têm mostrado que a metilação de p16 ocorre precoce na carcinogénese e tem sido demonstrado que aumenta significativamente o risco de transformação maligna de displasia epitelial [15] – [21]. Embora o papel causal da metilação de p16 na carcinogénese não tiver sido estabelecida, a evidência sugere fortemente que a metilação de p16 pode contribuir significativamente para o desenvolvimento do cancro e poderia ser desenvolvido para um biomarcador potencial [4]. Embora p16 metilação é uma das modificações epigenética mais altamente estudadas, a sua estabilidade em células cancerosas e o mecanismo através do qual se mantém ainda não foi clarificada [22] – [26]. Uma compreensão detalhada das máquinas de manutenção envolvidos na metilação do ADN é um passo crítico para o desenvolvimento de biomarcadores de metilação e a terapia de intervenção epigenética.

A prevalência de metilação de p16 em tecidos gastrite crónica humana está fortemente correlacionado com a infecção por Helicobacter pylori, e diminuído dramaticamente após irradiação H. pylori, sugerindo que a maioria dos alelos metilados-p16 pode não ser estável [27], [28]. Em contraste, a metilação de p16 em células normais e cancerosas em cultura é provavelmente muito estável, uma vez que foi eficientemente recuperado após o inibidor de metilação de ADN (5-aza-CdR) foi removido [29]. No entanto, observou-se a reactivação de genes silenciados-metilação de uma certa proporção das células tratadas com inibidor da DNA metiltransferase. É difícil excluir a possibilidade de que a recuperação observada de resultados de p16 de metilação de uma vantagem selecção conferida a células que não se submetem a reactivação de p16 /desmetilação durante o tratamento inibidor. Além disso, foi recentemente relatado que os locais CpG metilados dentro da p16 ilhas CpG estão localizados principalmente no exão 1-região codificadora nucleossomal em lesões gastrite humanos e se estendem até as regiões 5 ‘UTR e nucleossomais promotor de p16 durante o desenvolvimento de carcinomas gástricos [26]. Estes achados sugerem que os alelos totalmente metilado-p16 pode ser mais estável do que os alelos metilados focalmente; No entanto, esta hipótese deve ser ainda testados usando células monoclonais contendo alelos de p16 com a diversos padrões de metilação, incluindo a metilação focal.

A fusão celular tem sido utilizada para estudar os mecanismos subjacentes a regulação da transcrição do gene e alteração de metilação de ADN [24], [30]. A fim de estabelecer um modelo de células contendo p16 diversos padrões de metilação, uma linha celular de cancro gástrico com p16 completamente metilado (AGS) foi combinado com uma linha celular de cancro gástrico p16-activo (MGC803) através de fusão celular. Em seguida, estas células de fusão foram clonados e subclonados antes da distribuição dos locais CpG metilados e hidroximetilada na p16 ilhas CpG foi caracterizado. O estado de metilação da maioria dos alelos de p16 em células de fusão permaneceram as mesmas que as células parentais. Também foram observados baixos níveis de metilação focal de novo, desmetilação, e hidroximetilação nas células de fusão; no entanto, estas alterações foram consideradas eventos instáveis. Um fenómeno semelhante foi também observada utilizando a linha celular de p16 hemi-metilado HCT116. Estas descobertas indicam que os estados de metilação do p16 ilhas CpG são homeostaticamente mantida em células cancerosas. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para sugerir que o estado de metilação de ilhas CpG é homeostaticamente mantida em células cancerosas não submetidos a diferenciação.

Materiais e Métodos

cultura celular

linha celular de cancro gástrico humano MGC803 foi cultivada em RPMI 1640 com 10% de FBS. AGS foi cultivada em meio F12 com 10% de FBS. linhas celulares MGC803 [31] e AGS (ATCC CRL-1739) foram gentilmente cedidos pelo Prof. Yang Ke no Hospital do Câncer da Universidade de Pequim e do Instituto. As células HCT116 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Yuanjia Chen, Pequim Hospital União (ATCC CCL-247), e foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS.

A geração de clones celulares estáveis ​​de fusão

pBabe-Puro (resistência à higromicina) e pIRES2-EGFP (resistência à neomicina /G418) vectores foram transfectados para células MGC803 AGS e, respectivamente, usando LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, 11668-027) de acordo com as instruções do fabricante. Puromicina (puromicina

R + -AGS) e G418 (neomicina

R + -MGC803) selecção foi realizada em AGS e linhas celulares MGC803 seguido por cultura em meio F12 com 10% de FBS e puromicina (0,25 ug /mL) e meio RPMI 1640 com FBS a 10% e neomicina (700 ug /mL), respectivamente. A fusão foi realizada utilizando PEG8000 como descrito anteriormente [32]. Após a fusão, as células foram cultivadas em meio de selecção contendo tanto neomicina (700 ug /ml) e puromicina (0,25 ug /mL). Após a selecção, as colónias individuais foram mono-clonado, e após três ciclos de clonagem subsequente, foram obtidos cinco monoclones. Dois dos cinco monoclones foram escolhidos para posterior mono-clonagem.

Os microssatélites

D9S974

e

D9S1749

análise

O conjunto de primers para

D9S974

(sentido, 5′-gagcc tggtc tggat cataa-3 ‘; anti-sentido, 5′-aagct tacag aacca gacag-3’) e

D9S1749 (com sentido, 5′-AGGAG agggt acgct tgcaa-3 ‘; anti-sentido, 5′-tacag ggtgc gggtg cagat AA-3’) foram usados ​​para amplificar o

p16

alelos (Figura S1A). Os genótipos dos micorsatellites foram analisadas a 80 ° C por DHPLC usando um detector de UV (260 nm), tal como descrito anteriormente [33].

A análise do cariótipo

Um balão de 25 cm a 60% de células confluência, foi tratada com 0,2 ug /mL de colchicina, durante 4 h. As células foram recuperadas após tripsinização e o tratamento com solução de 75 mmol /L de KCl durante 25 min. As células foram fixadas (3:01 metanol: ácido acético)., E coradas com corante de Giemsa

preparação de ADN, bissulfito e TAB tratamento

O ADN genómico foi extraído de amostras de tecido com fenol /clorofórmio . As amostras foram tratadas com 5 mol /L de bissulfito de sódio durante 16 horas a 50 ° C [34]. Para a análise 5hmC, DNA genômico foi tratado utilizando o Kit TAB acordo com as especificações do fabricante (WiseGene, Cat # K001) [35].

específicos do DNA hidroximetilado imunoprecipitação (hMeDIP)

O DNA genômico foi sonicado em 200 pb e 600 pb fragmentos usando Bioruptor sonicator (Diagenode). 100 ng sonicado DNA foi salvo como o controle de entrada. Cada amostra foi de 1 ug de ADN diluído em tampão IP e incubados com 4 ul de anti-hidroximetilcitosina (5hmC) anticorpo (Activo Motif) a 4 ° C durante a noite sonicadas. Os complexos anticorpo-ADN foram capturados com pérolas de proteína A /G, em seguida, purificadas. PCR foi executado em todas as amostras utilizando 35 ciclos com os iniciadores 5′-agtcct ccttc cttgc CAAC-3 ‘e 5′-tccga gcact tagcg aatgt g-3’. citosina não metilado, 5-metilcitosina, e de DNA 5hmC fragmentos foram utilizados como controle PCR para verificar 5hmC enriquecimento.

cromatina-imunoprecipitação (chip) Ensaios

Os níveis de modificações de histonas H3K9me3 e H3K4me3 foram determinadas usando ensaios chip como descrito [36].

PCR amplificações

o amplicon 392 pb do antisense vertente do

p16

exão-1 foi amplificado com o CpG-livre Primer (agagg sentido, 5′-ttttt atttg aggga Tagg-3 ‘; antisense, 5′-ctacc taatt CCAAT tcccc tacaa acttc-3’) conjunto como descrito [37]. O amplicon 588 pb do antisense vertente do

p16

exão-1 e promotor foi amplificada utilizando o conjunto de primers SMSP (sentido, 5′-ctacct aattc caatt cccct aca-3 ‘; antisenses, 5’- CCAAT tcccc tacaa acttc g-3 ‘, 5′-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcg-3′ e 5’-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcac CCG-3 ‘) [26]. O 369 bp do sentido de acção do

p16

exão-1 foi amplificado com o conjunto de primers CpG-free (sentido, 5′-gttgt agatt tttta tttat ttgga t-3 ‘; antisense, 5’- tcccc ttacc taaaa aaata CC-3 ‘) à temperatura de recozimento de 56 ° C. Os 284 pb e 346 pb amplicons dos antisense-costas do

p16

exon-2 e intron-2 foram respectivamente amplificado com o conjunto de primers CpG-free (sentido, 5′-tggta ggtta tgatg atgggt ag- 3 ‘; anti-sentido, 5′-aacat aatta ctacc tctaa taccc C-3′) e (sentido, 5’-tttgt gggtt tgtag aagta ggtat g-3 ‘; anti-sentido, 5′-cctaa tccaa caact AATCC actac C-3’) à temperatura de recozimento de 57 ° C.

quantificação de metilação de ilhas CpG usando DHPLC

o 392 bp, 369 bp, 284 bp, 346 bp produtos de PCR amplificados por primers universais foram separados usando o DNA WAVE Sistema de Análise com um fragmento -detector fluorescência (FL) (Transgenomic, Inc., MO, EUA) a 57,6, 55,0, 58,0, e 57 ° C, respectivamente [37], [38]. O tampão WAVE-HS1 FL-corante (Transgenomic, Inc.) foi utilizado para melhorar a intensidade de FL-produtos de PCR (rotulagem pós-coluna universal). Genomic HCT116 DNA foi usado como controle padrão.

Clone sequenciamento

PCR foi realizada no bisulfite DNA convertidos. Os produtos de amplificação foram clonados no vector pCR-romba (Invitrogen) e transformada em

E. coli

, e sequenciado utilizando um ABI 3730 Analyzer.

p16

RT-PCR

p16

mRNA foi detectada como descrito [12] .

P16 imunofluorescência coloração

imunofluorescência coloração foi realizada como descrito anteriormente [39]. Em resumo, as células de fusão foram fixadas em formaldeído a 4% /PBS durante 10 min antes de uma lavagem de 5 minutos em PBS. As amostras fixadas foram bloqueadas durante 30 min com 0,5% de Triton X-100 /PBS a temperatura ambiente. As células foram incubadas com anticorpo anti-P16 (Abcam, ab54210) durante 1 h a 37 ° C, depois lavou-se com 0,5% de Triton X-100 /PBS, depois incubadas com anticorpo IgG de coelho de cabra-anti marcado com rodamina durante 1 h a 37 ° C. DAPI (1:2000) foi utilizado para corar o núcleo da célula. Fotos foram tiradas em um microscópio confocal Leica.

Resultados

Estabelecimento e caracterização de um modelo de fusão celular com diversamente metilados

p16

alelos

Tem sido relataram que heterocariontes pode induzir variação de metilação de ADN por meio da fusão de células de duas linhas de células [30]. Nossa hipótese é que um modelo de fusão celular contendo diferentes estados de metilação do p16 ilhas CpG poderia duplicar a metilação ou desmetilação processos de Novo. Assim, puromicina

-AGS células r + contendo totalmente alelos metilados-p16 ea neomicina

-MGC803 células r + contendo alelos não metilado-p16 foram construídos, respectivamente. Estas duas linhas de células foram então fundidos e cultivadas em meio de selecção contendo tanto puromicina e neomicina. Depois de três rodadas de clonagem, os monoclones fusão foram caracterizados por dois microssatélites (D9S974 e D9S1749) perto do locus p16 (Figura S1A). Dois D9S1749 padrões de microssatélites chromatogram (C7 /C9 /E10 e D3 /E3) e um padrão de D9S974 foram observadas em 5 monoclones testadas que diferiam dos padrões de suas células parentais. Modo cromossomo também foi diferente entre o clone representante E10 (near-tetraploid) e suas células parentais (quase diplóide) (Figura S1B).

manutenção estável completamente metilado e unmethylated-

p16

alelos em células cancerosas

O estado de metilação das ilhas CpG p16 (392 pb) foi quantitativamente analisados ​​nestes clones de fusão usando um ensaio DHPLC conforme relatado anteriormente [37]. Como foi visto em células HCT116-metilado hemi p16, a proporção de moléculas não metilado para methylated–p16 foi de cerca de 1:01 em fusão destes clones (Figura 1A-esquerda). A proporção de alelos metilados-p16 foi estavelmente mantido em um clone representante de passagens 45, 50, 55 e 60 (Figura 1A-direita). Além disso, a RT-PCR de ARNm de p16 detectados em todos os 5 clones testados (Figura 1B). proteína P16 nucleoplasmic também foi observada dentro de cada célula em dois monoclones representativos (C9) e E3 (Figura 1C). Com base nesta informação, é evidente que os estados de transcrição /metilação dos alelos p16 nas células de fusão é provável mantidos em um padrão semelhante às suas células parentais.

(A) Os estados de metilação de

p16

CpG nas ilhas monoclones de fusão foram analisados ​​utilizando DHPLC (esquerda). A proporção de methylated-

p16

na monoclona-E10 foi estavelmente mantido em passagens 45, 50, 55 e 60 (à direita). (B) RT-PCR mostra variando expressão de mRNA de

p16

nas monoclones de fusão e sua MGC803 parental e linhas de células AGS. mostra a coloração (C) confocal imunocitoquímica variando expressão P16 nas várias linhas celulares.

focally metilado

p16

alelos não são estáveis ​​em células cancerosas

Curiosamente, enquanto a maioria das moléculas de P16 permaneceram nos estados completamente metilados ou não metilados, os clones representativos de fusão continha cerca de 27% (13/48) focalmente methylated- (ou demethylated-) moléculas de p16 na região do exão-1 (Figura 2B). No entanto, as células parentais homozigóticas metilados ou não metilados não exibem as mesmas alterações de metilação. A fim de confirmar que o clone testado foi de facto monoclonal, este clone foi ainda subclonado. Análises posteriores revelaram que os padrões de metilação p16 em dois subclones consistentemente manteve-se semelhante aos seus clones parentais (Figura 2C e figura S2).

(A) Bissulfito sequenciamento clone do fragmento de 392 pb do

p16

ilha CpG em AGS e MGC803 células; Cada barra verde representa um local de CpG. nucleosomal localização no exão-1 também é marcado (26). (B e C) sequenciação Bissulfito na fusão monoclona-E3 e subclones. mudanças de metilação focais (amarelo-sombreada); locais CpG metilados (ponto vermelho); locais CpG não metilados (ponto aberto); focally methylated- ou demethylated-

p16

moléculas (setas pretas). (D) modelo de metilação homeostático para uma única ilha CpG nas células tetraplóides.

Um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) (rs36228836) foi identificado na região do promotor p16. Determinou-se que o genótipo de este SNP diferente entre as duas linhas celulares parentais (T /A para MGC803 e T /T para AGS), tornando-se assim possível identificar os P16 A-alelos específicos de MGC803 nas células de fusão (figura S3). A fim de clarificar se estes fragmentos focalmente metilados foram o resultado da metilação de novo ou desmetilação, os estados de metilação dentro de um fragmento de 588 pb que cobre este SNP foram analisadas utilizando um ensaio de PCR específica de metilação-sementeira (SMSP). Descobriu-se que a metilação de CpG dos alelos p16 nos sítios de metilação “seeding” dentro de um intrão-se eficazmente enriquecido [26]. Resultados de bissulfito-sequenciação confirmou que focal metilação de novo foi observado na A-alelos específicos-MGC803 de monoclona-D3 (Figura S3).

A fim de investigar se o transitório focally existem alelos metilados-p16 em células de não fusão, o padrão de metilação da linha de células HCT116 de p16 hemi-metilado também foi analisada. De modo semelhante, 16% (8/49) das moléculas de p16 mostrou metilação focal nas células HCT116 (Figura 3). Além disso, usando uma mutação frame-deslocamento del /ins leitura encontrada na região codificadora do exão-1 como um marcador genético, determinou-se que tanto focal metilação de novo nos alelos mutantes G-inserção (principalmente não metilado) e a desmetilação no os alelos de tipo selvagem (essencialmente metilados) também ocorrem esporadicamente nas células HCT116 (4/26 e 4/23, respectivamente). Isto indica que a metilação focal e desmetilação de alelos de p16 de fato existem nas células cancerosas não-fusão. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que, embora a metilação focal e a desmetilação são eventos relativamente comuns, a maior parte dos alelos completamente não metilado e methylated–p16 são mantidas de forma estável em células de cancro.

(A) Bissulfito de sequenciação do clone 392 fragmento pb do

p16

ilha CpG em células HCT116. Wild-type (

supressão

) /mutante (G-

inserção

)

p16

alelos; focally demethylated-

p16

moléculas (setas pretas); focally

de novo

moléculas metilados (setas vermelhas). (B) modelo de metilação homeostático para uma única ilha CpG nas células diplóides.

Para estudar se o focal metilação /desmetilação ocorre no corpo gene, foram analisados ​​os estados de metilação de ilhas CpG dentro o p16 exão-intrão e 2-2. análise DHPLC revelou que estas duas ilhas CpG foram totalmente metilado em AGS, MGC803, e células HCT116 (Figura S4A B), e bissulfito-sequenciação da ilha intrão-2 CpG confirmou os resultados DHPLC (Figura S4C), sugerindo que o corpo do gene é homogênea e estável metilados nestas células e não é acompanhada focal metilação /desmetilação.

concomitante 5-hidroximetilação ocorre no

p16

alelos de células de fusão

metilação do DNA e hidroximetilação não podem ser facilmente diferenciadas utilizando ensaios regulares de metilação à base de bissulfito. O papel da hidroximetilação na metilação de p16 focal ou desmetilação foi investigada utilizando um ensaio de hMeDIP-PCR (Figura 4A, gráfico da esquerda). Os resultados deste ensaio mostraram que a quantidade de ADN hidroximetilada-p16 nos dois clones de fusão era significativamente mais elevada do que as suas células parentais (Figura 4A, quadro da direita).

(A) Imuno-precipitação de PCR e análise de sintética e celular 5hmC contendo

sequências de p16

. Os AGS e fusão de células monoclona-D3 e E3 mostra níveis significativos de 5hmC. (B) Análise de TAB-seq revela completamente hydroxymethylated-

p16

alelos nos subclones de fusão, mas não as células parentais. (C) Análise de TAB-seq de células HCT116 mostra que a maioria do tipo selvagem

p16

alelos são completamente hidroximetilado.

Tet-assistente de bissulfito de sequenciamento (TAB-seq) é capaz de detectar especificamente metilcitosina 5-hidroxi- (5hmC) em ADN com uma resolução de uma única base [35]. Utilizando este ensaio para analisar o conteúdo 5hmC na p16 ilhas CpG em detalhes, verificou-se que as células AGS exibem CpGs hidroximetilado esporádicos com uma frequência muito baixa (21/700), enquanto que as células MGC803 não mostraram qualquer hidroximetilação. Como esperado, ambos hidroximetilação completa e focal de alelos de p16 foi detectada nestas células de fusão (Figura 4B). Os resultados de dois ensaios indicam que consistentemente hidroximetilação pode desempenhar um papel na manutenção da homeostase de metilação de p16 nas células de fusão.

Análise de células HCT116 inesperadamente revelaram hidroximetilação frequente e completa dentro dos anti-sentido para as cadeias do tipo selvagem de p16 (dEL) alelos (11/14), mas não nos alelos mutantes G-inserção (Figura 4C). Enquanto metilação foi detectado no fragmento de 369 pb do sentido de acção do p16 exão-1 em células HCT116 como esperado (Figura 5A-C), designadamente, a hidroximetilação completo não foi observado no sentido-fios em ambas TAB-DHPLC análise e TAB-sequenciação (Figura 5C e D), sugerindo a cadeia anti-sentido hidroximetilação específico.

(a) Localização do amplicon 369 bp do senso-costa

p16

exão-1. (B) Detecção dos produtos de PCR 369 pb usando DHPLC (modo de colagem), a 48 ° C. (C) A detecção de moléculas hidroximetilado amplificados a partir do

p16

sentido de cadeia após a modificação TAB usando DHPLC (detector FL) na temperatura de desnaturação parcial de 55 ° C. Sob esta condição, os

moléculas de p16

hydroxymethylated- e unhydroxymethylated- são parcialmente e totalmente desnaturado, respectivamente. Os modelos regularmente tratada com bissulfito são utilizados como controlos de referência. (D) Os resultados de TAB-sequenciação para os 369 pb produtos da PCR amplificados a partir de células HCT116.

A fim de determinar se os alelos de tipo selvagem p16 completamente hidroximetilado são transcricionalmente ativo, o alelo de origem das transcrições p16 foi caracterizado por sequenciação do clone. Os resultados da sequenciação revelaram que nenhuma das moléculas de ARNm 48 p16 foram transcritos a partir de alelos de tipo selvagem p16 que foram assimetricamente metilado e hidroximetilada (M:H) (Figura 6). Esta informação comprova que hidroximetilação na cadeia anti-sentido dos alelos p16 não pode levar à activação da transcrição do gene.

(A) RT-PCR do clone sequenciação da linha celular 293T de controlo (DEL) mostra tipo selvagem

p16

ARNm. O HCT116 (G-ins) linha celular revelado somente mutante

p16

clones de mRNA. (B) os resultados Clone sequenciamento mostrar tanto do tipo selvagem e mRNA p16 mutante.

concomitante de H3K4 histonas e trimethylation H3K9 na ChIP

p16

alelos em células de fusão

-PCR foi utilizada para determinar quantitativamente os níveis de H3K4me3 activo e repressivo H3K9me3 nas células de fusão (Figura 7). O nível H3K4me3 nos alelos p16 heterogeneamente metilados de subclones de fusão verificou-se ser significativamente inferior do que foi visto nos alelos não metilados completamente das células MGC803. Além disso, o nível de H3K4me3 no exão 1-cromatina foi determinado para ser maior que a encontrada na cromatina promotor. Enquanto o H3K4me3 não foi detectado nas células AGS, o nível H3K9me3 foi significativamente maior nesta linha celular do que outras linhas celulares. nível H3K9me3 mostrou uma correlação inversa com o nível H3K4me3 entre estas linhas celulares.

(A) O nível H3K4me3 activo dentro da

p16

ilhas CpG nos subclones de fusão e MGC803 células foi significativamente superior células AGS, especialmente na região do exão-1 (monoclones vs. AGS, P 0,01). (B) O nível H3K9me3 repressivo nos subclones de fusão e células AGS foi significativamente maior que MGC803 células, especialmente na região promotora (monoclones vs. MGC803, P 0,01).

Discussão

o padrão de metilação do ADN é conhecida para alterar dinamicamente durante a diferenciação de células estaminais embrionárias e desenvolvimento de tecidos em vertebrados. No entanto, permanece um mistério como os estados de metilação do genoma são mantidos em células não sofrer diferenciação. No presente estudo, verificou-se que os estados de metilação de completamente methylated- e unmethylated-

p16

alelos permaneceu estável durante a proliferação celular. Além disso, os baixos níveis de desmetilação focal, hidroximetilação, e

de novo

metilação ocorreu com relativa frequência em dois tipos de

modelos de células de câncer metilado-hemi p16

, mas não em células homogeneamente metilados ou não metilados. Estes resultados implicam que a metilação homogênea podem exercer pressão repressão no

gene p16

que pode afetar pelo menos parcialmente ilhas anteriormente não metiladas CpG. Em contraste, a pressão exercida por desmetilação transcrição completa do gene é capaz de induzir e manter a desmetilação de

p16

ilhas CpG. Hidroximetilação de

p16

CpG alelos foi também descoberto a desempenhar um papel na manutenção da homeostase da metilação do genoma. Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de mostrar que o estado de metilação de um gene supressor de tumor é homeostaticamente mantida em células cancerosas.

A estabilidade de alelos metilados p16 ainda não foi explicada. Em lesões gastrite, os estados de metilação da maioria dos alelos de p16 são instáveis ​​e H. pylori-dependente [27], [28]; Contudo, em linhas celulares de cancro que provaram permanecer notavelmente estável [29]. Os nossos estudos recentes abrangentes de sequenciação revelou que os locais CpG metilados em gastrite estão localizados dentro da região do exão-1 do gene p16, mas se estender para a região do promotor após o desenvolvimento de carcinoma gástrico. Isto implica que completamente alelos metilados-p16 são consideravelmente mais estáveis ​​do que os seus homólogos focalmente metilados [26]. Também tem sido relatado que heterocariontes podem induzir variações de metilação do DNA por meio da fusão de células de duas linhas de células, e, além disso, que algumas moléculas-p16 silenciados em células cancerosas rato pode ser reactivado depois de serem fundidas com células estaminais de ratinho embrionário P16-activos [30], [39]. No presente estudo, as células de fusão que contêm uma grande variedade de padrões de metilação p16 foram estabelecidas a partir de linhas celulares parentais homozigóticas metilados e não metilados de forma a investigar a estabilidade do focalmente e completamente alelos metilados-p16 dentro da mesma célula. Como esperado, os alelos de p16 das células de fusão mostraram uma gama completa e variável de metilação. Os alelos de p16 em clones de fusão e os seus subclones permaneceram estavelmente hemi-metilado durante passagens celulares, o que indica que estes alelos p16 completamente metilados e não metilados são relativamente estáveis. Por outro lado, os clones de fusão metilado hemi-HCT116 e células exibiram baixos níveis de focalmente metilados /alelos p16-desmetilado, que proporcionam prova directa de que os alelos de p16-metilado hemi são menos estáveis ​​do que os alelos de p16 homogeneamente metilados. Este padrão dinâmico, mas ainda homeostático, a metilação de p16 ilhas CpG podem oferecer um mecanismo comum explicando DNA manutenção metilação em células estáticas de diferenciação. Além disso, duas ilhas CpG do gene p16 exão-2 e o intrão-2 são homogeneamente metilado em HCT116, AGS, e MGC803 células, por conseguinte, é provável que a manutenção da homeostase de metilação de p16 pode ser observada apenas na sua /-1 exão da região promotora nestas células. Uma vez que existem muitas regiões hemi-metilado presentes no genoma, tais como os cromossomas X de células do sexo feminino e genes marcados, um estudo mais aprofundado quanto ao facto de foco, a metilação do transiente e a desmetilação são fenómenos gerais na manutenção da homeostase da metilação do DNA é certamente garantido.

5hmC desempenha um papel crucial na desmetilação de ADN activo como intermediário na oxidação metilcitosina em série. No entanto, uma certa proporção de 5hmC não é adicionalmente oxidado, mas em vez disso é mantido no genoma de tecidos adultos, tais como o cérebro e o cólon. Embora as funções adicionais de 5hmC no genoma permanecem desconhecidas, é provável que uma função importante. Tem sido relatado que hidroximetilação em ambos os locais de promotor e intragênicos correlacionados positivamente com a expressão do gene [40]. Geralmente, ilhas CpG não são metilados nas regiões em torno dos locais de início da transcrição em genes transcritos ativamente, mas são metilados no corpo gene. Recentemente, tem sido relatado que a hidroximetilação no genoma do cérebro é TET2-dependente e mais hidroximetilação é detectado, no sentido de as cadeias do que os anti-sentido-fios de corpos de genes transcritos activamente [41], [42]. No presente estudo, verificou-se que o antisense-fios de células HCT116 continha uma certa proporção de alelos de tipo selvagem p16 “desnaturado”, que eram, na verdade, completamente hidroximetilado;