Abstract

Fundo

As evidências acumuladas apoia o conceito de que o melanoma é altamente heterogênea e sustentada por uma pequena subpopulação de melanoma células-tronco semelhantes. Estas células são consideradas como responsáveis ​​pela resistência a terapias de tumor. Além disso, células de melanoma são caracterizados pela sua elevada plasticidade fenotípica. Consequentemente, ambos os melanoma células-tronco semelhantes e seus descendentes mais diferenciada deve ser erradicado para alcançar a cura durável. Reavaliando compostos em populações de melanoma heterogêneos, pode ser possível seleccionar compostos com atividade não apenas contra células fast-ciclismo, mas também contra o câncer de células estaminais-like. compostos naturais foram o foco do presente estudo.

Métodos

Nós analisados ​​120 compostos a partir de produtos naturais Set II para identificar compostos ativos contra as populações de melanoma cultivadas de forma independente de ancoragem e enriquecidos com células exercendo a capacidade de auto-renovação. A viabilidade celular, ciclo celular, apoptose, expressão gênica, sobrevivência clonogênica eo rótulo de retenção foram analisados.

Achados

Vários compostos células eficientemente erradicados com capacidade clonogênica e nanaomycin A, estreptonigrina e Toiocamicina foram eficaz em 0.1 uM. Outras mas não compostos anti-clonog�icas altamente citotóxicos, tais como bryostatin 1, siomycin A, illudina M, Michell B e pentoxifilina marcadamente reduziu a freqüência de ABCB5 (ATP vinculativo cassete, subfamília B, membro 5) células -positivas. Pelo contrário, o tratamento com maitansina e colchicina seleccionado para células que expressam esse transportador. A maitansina, estreptonigrina, Toiocamicina e colchicina, mesmo que altamente citotóxica, deixou uma pequena subpopulação de células em divisão lenta afetados. Compostos selecionados no presente estudo diferencialmente alterou a expressão do fator de melanócitos /melanoma específica associada à microftalmia transcrição (MITF) e proto-oncogene c-MYC.

Conclusão

seleccionados compostos anti-clonog�icas pode ainda ser investigados como possíveis adjuvantes alvo de melanoma células estaminais-como na terapia anti-melanoma combinado, enquanto selecionado citotóxica mas os compostos não anti-clonog�icas, o que aumentou a frequência de células ABCB5-positiva e permaneceu lento ciclismo células afetadas, pode ser considerado como uma ferramenta para enriquecer a cultura com células que apresentam características de células-tronco melanoma

Citation:. Sztiller-Sikorska M, Koprowska K, Majchrzak K, Hartman M, Czyz M (2014) Atividade Natural Compounds ‘contra o cancro Stem-Like ou fast-ciclismo células de melanoma. PLoS ONE 9 (3): e90783. doi: 10.1371 /journal.pone.0090783

editor: Christopher Heeschen, Espanhol Centro Nacional do Câncer (CNIO), Espanha |

Recebido: 09 de dezembro de 2013; Aceito: 04 de fevereiro de 2014; Publicação: 03 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sztiller-Sikorska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financiamento: este trabalho foi financiado por uma concessão 2011/01 /B /NZ4 /04.921 do Centro Nacional de Ciência. O Produtos Naturais Set II foi fornecidos sem custo pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

competir interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os intratumorais fenotípicas heterogeneidade resulta da variação genética, mas também. a partir da plasticidade das células de tumor que se observa em resposta a estímulos do microambiente. Entre os diversos fenótipos funcionais dentro de um tumor, uma subpopulação de células cancerosas estaminais semelhante (CCC) capazes de auto-renovação e a grandes quantidades de um tumor que consiste em rápido-ciclismo as células e as células mais diferenciadas podem ser distinguidos [1] – [3] Como a heterogeneidade fenotipica foi mostrado ser altamente dinâmico em muitos tumores incluindo melanoma [4] -. [7] e a erradicação terapêutico de CSC subpopulação pode ser seguida pela sua regeneração de não-CSCs, ambos os CSCs e a população a granel deve ser considerada no desenvolvimento da terapia anticancro [8] – [14]. Portanto, uma combinação de drogas causando uma erradicação completa de todos os tipos de células dentro de um tumor pode ser necessário para alcançar curas duráveis. No processo de seleção de candidatos a fármacos altamente potentes, há um problema substancial na criação experimentais

in vitro

modelos que prevêem de forma confiável a atividade das drogas em pacientes. No presente estudo, as células de melanoma obtidas directamente a partir de amostras patologicamente distintas, melanoma nodular e de melanoma de espalhamento superficial, foram crescidas de uma maneira independente da ancoragem em meio de células-tronco e foram enriquecidas com células exercendo capacidade de auto-renovação, em comparação com monocamadas conduzido de soro [15]. Este

modelo in vitro

tridimensional também foi mostrado para preservar a heterogeneidade do tumor original com mais precisão do que duas dimensões culturas de monocamada [16] – [18] e foi um importante elemento de novidade no presente

in vitro

rastreio da biblioteca de compostos naturais

compostos naturais são amplamente utilizados em terapia anti-cancro e podem exercer uma actividade biológica considerável [19] -. [21]. Embora o seu mecanismo de acção são, muitas vezes não é bem definida, a maioria dos agentes terapêuticos derivados a partir de produtos naturais, principalmente, são eficazes na eliminação de células cancerosas com um índice de proliferação elevado. Os compostos que afectam a divisão celular pode falhar, no entanto, para erradicar a subpopulação de cancro lento-ciclismo células estaminais semelhante, levando eventualmente a reincidência do tumor. No presente estudo, embora várias abordagens têm sido usadas no processo de selecção, foi dada prioridade a esses compostos que foram capazes de reduzir o número de células clonogénicas. Uma redução na clonogenicidade foi interpretado como um efeito direto sobre o potencial de auto-renovação das células-tronco cancerosas-like. Além disso, a apoptose, etiqueta de retenção, a frequência de células ABCB5-positivo e a expressão de sinalização /β-catenina genes alvo Wnt,

MITF

e

c-MYC

, foram avaliadas em melanoma populações tratadas com compostos seleccionados como seja altamente anti-clonogénica ou altamente citotóxicos. Nós investigamos a influência de compostos selecionados em moléculas e vias associadas à stemness. células Slow-ciclismo considerados como câncer células-tronco-like (CSCs) pode ser marcado como células de retenção de etiqueta [12]. No presente estudo, foi utilizado um CFSE corante fluorescente para identificar compostos que deixaram as células de melanoma de retenção de etiqueta afetados. ABCB5 proteína transportadora, um mediador de quimioresistência em melanoma, também é reconhecido como um potencial marcador de células estaminais de melanoma, do [2], [22]. células de melanoma que expressam proteína ABCB5 poderia sobreviver selectivamente quando expostos a dacarbazina, vemurafenib e outras drogas [22]. Demonstrou-se que o anticorpo anti-ABCB5 ou siRNA silenciamento do gene inverteu a resistência de melanoma aos medicamentos anticancerígenos [23], [24]. Investigou-se a proporção de células portadoras deste transportador foi alterado mediante o tratamento com compostos seleccionados naturais. sinalização Wnt desempenha um papel crucial na preservação da pluripotência das células estaminais embrionárias e desenvolvimento do cancro [25]. relatório recente sugere um papel para a via de sinalização /β-catenina Wnt na manutenção da viabilidade e /ou sustentar a auto-renovação de tumor de mama iniciar células

in vitro

[26]. No melanoma, os aumentos de sinalização β-catenina durante a progressão do tumor e isso promove quimiorresistência [27]. O nosso estudo recente revelou que a via de sinalização /β-catenina Wnt é suprimida em populações de melanoma com a baixa frequência de células clonogénicas (Hartman et ai., Submetido). A influência de compostos naturais selecionados em dois genes-alvo Wnt /β-catenina,

MITF

e

c-MYC

foi investigada. factor de transcrio de MITF atos como um reóstato determinar a identidade fenotípica entre diferentes sub-populações de células de melanoma [28]. Embora amplificado apenas em cerca de 20% dos melanomas, MITF tem sido proposto como um oncogene vício linhagem contribuindo para o melanoma quimiorresistência [29], [30]. O proto-oncogene c-Myc desempenha um papel crucial no desenvolvimento de um grande número de tumores humanos [31]. Mais recentemente, tem sido mostrado que a sobre-expressão de c-Myc dentro do tumor pode ser alvo de células T específicas [32]. Compostos que induzem apoptose e /ou a inibição da proliferação de uma forma ato de c-myc-específico sobre alvos celulares distintas [33], [34]. c-MYC inibição em células de melanoma resultados na proliferação reduzida através de mecanismos que envolvem várias enzimas de biossíntese de nucleotídeos [35].

Para o nosso conhecimento, não há estudos anteriores que exploram muitos fatores em paralelo no processo de seleção inicial para compostos ativos de A Natural Products Set II (NCI). Com base nos perfis de actividade criados, cada um dos compostos seleccionados podem ser adicionalmente investigados para a sua aplicabilidade potencial como parte de uma terapia anti-cancro ou como uma ferramenta no trabalho de laboratório. Os produtos naturais selecionados como compostos ativos contra células de melanoma também pode fornecer novas leva para a conversão em agentes clinicamente úteis.

Materiais e Métodos

Compostos

A Natural Products Set II foi obtidos do Instituto Nacional do Câncer dos EUA (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov). Os compostos foram em placas de 96 cavidades com 60 compostos por placa. As placas foram armazenadas secas a -20 ° C. Cada poço continha 0,02? Mol do composto em 1 ml de glicerol. solução a 10 mM (20 ul) de cada composto foi obtida por adição de 19 ul de DMSO a cada poço. Imediatamente após solubilização as soluções de fármaco foram aliqouted em várias placas de teste para evitar a possível precipitação do composto. Todos os experimentos foram realizados utilizando compostos fornecidos pelo NCI.

tecidos tumorais e Declaração de Ética

células

DMBC foram obtidos no Departamento de Biologia Molecular do Câncer de espécimes cirúrgicos de melanoma em estágio avançado. As características dos pacientes de espécimes de melanoma foram publicados anteriormente [15], [36], [37]. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética da Universidade de Medicina de Lodz e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

culturas de células

As células foram mantidas em células-tronco médio (SCM) em um forma independente de ancoragem, como descrito anteriormente [36].

Medição do número de células viáveis ​​

células de melanoma foram contadas após coloração com azul de tripano (Sigma-Aldrich) e plaqueadas a uma densidade de 4 × 10

3 células viáveis ​​por poço em placas de 96 poços. As células foram cultivadas durante 45 h com veículo (0,05% de DMSO) ou os compostos a partir dos produtos naturais Conjunto II em 5 uM. Um ensaio de actividade de fosfatase ácida (APA) foi utilizado para medir o número de células viáveis. Resumidamente, as placas foram centrifugadas, o meio foi descartado e substituído com tampão de ensaio de 100 uL contendo acetato de sódio 0,1 M (pH = 5), 0,1% de Triton X-100 e fosfato de p-nitrofenilo 5 mM, pNPP (Sigma-Aldrich) e incubou-se durante 2 horas adicionais, a 37 ° C. A reacção foi parada com 10 pi /poço de NaOH 1 M, e os valores de absorvância foram medidas no comprimento de onda de 405 nm utilizando um leitor de microplacas (Infinito M200Pro, Tecan, Áustria). células de melanoma não respondeu a 0,05% DMSO com viabilidade reduzida.

Viabilidade Ensaio

mudanças induzidas pela droga na viabilidade celular após 45 h de tratamento também foram avaliados por citometria de fluxo após o iodeto de propídio (PI) coloração ou por meio de um analisador automatizado da viabilidade celular de acordo com procedimentos padrão. Em ambos os ensaios, as células foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSVerse (Becton Dickinson, San Jose, Califórnia, EUA), e os resultados foram processados ​​utilizando o software FACSuite (Becton Dickinson).

análise do ciclo celular

células de melanoma foram tratadas com o veículo ou os compostos nas concentrações indicadas, durante 30 h ou 45 h, em seguida, recolhidas e fixadas com 70% (w /v) de etanol a -20 ° C. As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em tampão de coloração de PI contendo ARNase (Becton Dickinson, San José, CA, EUA). A seguir à incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro, as células foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSVerse (Becton Dickinson). ModFit LT software 3.0 (Verificar software, Topsham, MN, EUA) foi utilizado para calcular as percentagens de células em cada fase do ciclo celular e software FACSuit (Becton Dickinson) foi usado para calcular as percentagens de células mortas no subg

1 .

clonogênica Ensaio

células de melanoma foram incubadas primeiro com compostos nas concentrações indicadas para 4 h. Em seguida, a viabilidade foi determinada por coloração com azul de Tripano e 1000, as células de melanoma viáveis ​​individuais foram transferidas para 700 mL de agar de topo mistura de meio (SCM, 0,35% (w /v) de agar) e as suspensões celulares obtidas foram cobertas em placas de cultura de 12 poços revestido com 700 ul de mistura de ágar solidificado inferior (SCM, 0,5% (w /v) de agar). As placas foram então incubadas a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 2 semanas, e em alguns casos também por 3 semanas. As células foram coradas com 500 ul de 0,005% de violeta cristal durante 2 h, e as colónias, pelo menos, 50 mm de diâmetro foram contados sob o microscópio. A influência dos compostos na clonogenicidade foi expressa como percentagem do controlo de acordo com a fórmula: colónias número gerado após tratamento com os compostos /número de colónias em controlo com o veículo × 100.

Análise de citometria de fluxo de apoptose

a detecção da morte de células foi efectuada através de coloração dupla com Anexina V-FITC e PI (Roche Diagnostics, Manheim, Alemanha). células de melanoma foram inoculadas em placas de 12 poços e tratadas durante 45 h com os compostos nas concentrações indicadas. Após o tratamento, as células foram recolhidas, centrifugadas a 400 x g durante 5 minutos e coradas com anexina V-FITC e PI, durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. 15.000 eventos foram analisados ​​para cada amostra por citômetro de fluxo FACSVerse (Becton Dickinson), e os resultados foram processados ​​usando software FACSuite (Becton Dickinson).

Avaliação de Células ABCB5-positiva

A frequência de células que expressam ABCB5 foi avaliada por citometria de fluxo. o anticorpo primário anti-ABCB5 não conjugado de Sigma-Aldrich e anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com FITC (BD Pharmingen) foram utilizados neste estudo. Tipicamente, 30.000 células foram analisadas por amostra. controlos do isotipo foram incluídos em cada experiência. Para excluir as células mortas da análise, coloração D 7-aminoactinomycin (7-AAD; eBiosciences) foi usado. aquisição de citometria de fluxo foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACSVerse (Becton Dickinson) e analisadas utilizando o software FACSuite. Mudanças na frequência de células ABCB5-positivo após o tratamento de drogas por 45 h foram expressos como percentagens de controlo com o veículo.

CFSE Coloração

Para a análise CFSE, células de melanoma foram coradas com CFSE 1,5 mM (o pró-fármaco éster succinimidilo carboxifluoresceína diacetato) durante 30 min a 37 ° C, lavou-se duas vezes, semeadas em placas de doze poços a 1,25 × 10

5 /cavidade, e expostas aos compostos durante 5 dias a concentrações indicadas. Em seguida, o meio foi trocado e as células foram incubadas em meio isento de fármaco durante mais 6 dias, e avaliadas por citometria de fluxo. emissão de fluorescência verde foi medida usando um citómetro de fluxo FACSVerse (Becton Dickinson) e analisadas utilizando o software FACSuite.

Isolamento de ARN, síntese de ADNc e PCR em Tempo Real

O ARN foi isolado e purificado usando o RNA total kit de isolamento com mini-sistema de coluna (A A Biotecnologia, Gdynia, Polónia). A concentração e a pureza do RNA foram medidos com um leitor de placas Tecan NanoQuant (Tecan, Áustria). O ADNc foi sintetizado utilizando 300 ng de iniciadores aleatórios e Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). O tempo real sistema de análise de ADN Gene Rotor-3000 (Corbett Research, Morklake, Austrália) foi usada para avaliar a expressão do gene por quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR). A amplificação foi realizada utilizando KAPA SYBR RÁPIDO qPCR Kit Universal 2X Mix qPCR Master (Kapa Biosystems, Cidade do Cabo, África do Sul), 200 nM de cada iniciador e modelo de cDNA 25 ng por reacção. Os iniciadores utilizados para PCR em tempo real foram como se segue: MITF: 5′-ACC GTC TCT CAC TGG TCA GG-3 ‘e 5′-GTG TAC TTG GGG TTT TCG AG-3′; C-MYC: 5’-AAT GAA AAG GCC CCC AAG GTA GTT ATC C-3 ‘e 5′-GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C-3′; SOX2: 5’-GCT AGT CTC CAA GCG ACG-3 ‘e 5′-ACG AGA AGC CTC TCC TTG-3’. A temperatura de recozimento para todos os genes foi de 56 ° C. A expressão relativa de genes alvo foi calculada versus uma RPS17 gene de referência (com os iniciadores: 5′-AAT CTC CTG ATC CAA GCG TG-3 ‘e 5′-CAA GAT AGC AGG TTA TGT CAC G-3’), e um matemático foi utilizado um modelo incluindo uma correção de eficiência para o real-Time PCR.

Análise estatística

Os dados representam médias ± DP de três experiências separadas, a menos que especificado em contrário. O significado de uma aparente diferença dos valores médios para qualquer parâmetro testado foi validada pelo teste t emparelhado de Student. P 0,05 foi considerado significativo

Resultados

estratégia de seleção de compostos naturais em células de melanoma aumentaram de modo

Anchorage-Independent

A Natural Products Set II, que consiste em 120. compostos (Tabela S1 no ficheiro SI) derivado a partir da colecção de DTP Abrir Repositório de 140000 compostos, foi rastreada para identificar compostos eficazes contra células de melanoma. No pré-triagem de compostos, foram utilizadas duas linhas celulares derivadas de melanoma avançado, a partir de um melanoma nodular (DMBC12) [15] e um melanoma de espalhamento superficial (DMBC11) [37]. Ambas as populações foram cultivadas em SCM de uma maneira independente da ancoragem como esferóides multicelulares 3-dimensional. Em despistagem primária, as células de melanoma a partir de esferóides dissociadas foram expostas a cada composto a uma única concentração de 5 uM. Ambos, os ensaios não-clonogénicas e clonogénicas foram usadas em paralelo (Fig. 1).

Em primeiro lugar, compostos a partir de The Natural Products Conjunto II foram testados em duas linhas celulares de melanoma obtidos a partir de amostras patologicamente distintas, DMBC11 e DMBC12, a uma única concentração de 5 uM. Alterações na viabilidade (ensaio de APA, doseamento volumétrico, de coloração de PI e subg

1 de ensaio) foram medidos como efeitos a curto prazo e mudanças no potencial clonogénico como efeitos a longo prazo dos compostos testados. Todos os testes de viabilidade foram comparados para os potenciais inconsistências. Dois critérios foram utilizados para selecionar compostos para uma análise mais aprofundada: composto deve reduzir a viabilidade celular (PI-coloração) para ≤ 50% do controle e clonogenicidade a ≤ 20% do controle. Em seguida, os compostos seleccionados foram usados ​​em concentrações mais baixas para as curvas de dose-resposta. Os compostos mais potentes foram então investigados quanto à sua capacidade para induzir apoptose, para influenciar a frequência de células ABCB5-positivas e células lento-ciclismo de retenção de etiqueta, e para alterar a expressão genética.

Curto Prazo citotóxicos e citostáticos Efeitos de compostos naturais em células de melanoma

Quatro métodos não-clonogénicas foram escolhidos para o rastreio inicial. Alterações nos números de células viáveis ​​foram determinadas com base na quantificação da actividade de fosfatase ácida citosólica (ensaio APP) (Fig. S1A em Si file) e por citometria de fluxo utilizando um analisador de viabilidade de células automatizado (ensaio volumétrica) (Fig. S1B no ficheiro SI ). Citotoxicidade dos compostos foi medida por citometria de fluxo, após coloração de PI, como seja a frequência de células PI-positivos (Fig. 2 e Fig. S2 no ficheiro SI) ou como percentagem de células em subg

1 A fracção. Os histogramas para aqueles compostos que se acumularam mais de 40% das células de melanoma em subg

uma fracção estão incluídos na Fig. 3 e fig. S3A no arquivo SI. Todos estes ensaios foram usados ​​para avaliar a actividade da droga depois de incubação curto, quer após 45 h para a quantificação de fracções de células viáveis ​​e PI-positivos, ou depois de 30 h para as percentagens de células em subg

1 fracções. Em paralelo, os compostos naturais em 5 uM foram avaliadas em, linha celular de leucemia de p53 deficiente fármaco-resistentes K562 (Fig. 2, Fig. S1-S2 no ficheiro SI). A comparação da citotoxicidade de produtos naturais contra células de melanoma e leucemia (Fig. 2) revelou que vários compostos activos contra células de melanoma não foram activos em células K562. Por exemplo, estreptonigrina (32), crassin (68) e geldanamicina analógico (72) reduziu a viabilidade das células de melanoma para menos de 3% do controlo, mas a redução da viabilidade das células K562 não atingiu 50% do controlo. As células de melanoma também foram muito mais sensível a fastigilin B (63), bactobolin (84), didemnina B (104), siomycin A (107), Toiocamicina (108), geldanamicina (110) e tubulosine (119), entre outros (Fig. 2). As células K562, por sua vez, eram muito mais sensível a lapachona (20) do que as células de melanoma.

A viabilidade foi medida após 45% de veículo (0,05% de DMSO) tenha sido tratada com o controlo. Para comparação, foi utilizada a linha celular de leucemia K562. Cada quadrado representa a resposta de células de melanoma ou de leucemia a um dos 120 compostos. As cores indicam o nível de resposta de células. Para maior clareza os números designados no presente estudo para os compostos testados (Tabela S1 no arquivo SI) são colocados em primeiro cru e da primeira coluna. Veja a Figura S2 no arquivo SI para os dados quantitativos.

histogramas representativos de células DMBC11 tratados com compostos naturais para 30

1 não excedam 40%, histogramas foram analisados ​​utilizando software ModFit para calcular as percentagens de células em cada fase do ciclo celular. Histogramas que mostram paragem do ciclo celular em G

0 /G

1 fase foram marcados com moldura verde, na fase S com moldura azul e G

2 /M no quadro vermelho, e as porcentagens de células de melanoma presos em essas fases são indicados. Quando a acumulação de células de melanoma em subg

1 excedeu os 40%, software FACSuit foi utilizado e as percentagens de células mortas são indicados. Os resultados obtidos para células DMBC12 são mostrados na Figura S3A no ficheiro SI. Efeitos de concentrações mais baixas para os compostos mais citotóxicos ou de uma exposição mais prolongada para os compostos ineficazes em 30 h estão incluídos na Figura S3B no ficheiro SI.

Na análise do ciclo celular, vários compostos, na concentração de 5 ^ M células de melanoma acumuladas, quer em diferentes fases do ciclo celular ou células danificadas gerados recolhidos no subg

1 (Fig. 3 para DMBC11 células e Fig. S3A no arquivo SI para DMBC12 células). A colchicina (1), rotenona (19), vincristina (39), maitansina (60) e rizoxina (86) preso a maioria das células de melanoma em G

2 /H de fase. Resorufina (12), a michellamina B (101) e fumagilina (120), entre outras células preso na fase S, enquanto que Brefeldina A (47) e camptotecina (48), as células acumuladas em G

0 /L

1 ou subg

1 dependendo da linha da droga e celular. Diversos compostos, que em 5 uM não causou efeitos no ciclo celular após o tratamento durante 30 h, foram utilizados na experiência subsequente, durante 45 h, enquanto que os compostos que causam a acumulação de células em subg

1 foram testados a 1 uM, e em caso dos compostos mais potentes em 0.1 uM (Fig. S3B no ficheiro SI). Estreptonigrina (32) gerando uma grande população de células no subg

1 a 5? M, células DMBC12 acumulados em fase S quando usado em 0.1 M.

Pre-screen da Capacidade clonogênica como um efeito a longo prazo de compostos naturais em células de melanoma

Um ensaio clonogênica foi empregada para investigar os efeitos de compostos naturais na capacidade de auto-renovação das células de melanoma. As células foram incubadas com os compostos apenas por 4 h, e os efeitos a longo prazo desta incubação foi avaliada como a capacidade de formação de esferas em agar mole depois de 2 semanas. Quarenta e oito e quarenta e seis compostos em 5 uM reduziu o número de clones formadas em agar para ≤1% de controlo em populações DMBC11 e DMBC12, respectivamente (Fig. 4 e Fig. S4 no ficheiro SI). Como as células clonogénicas pode dividir-se mais lentamente, e a colónia pode não atingir o tamanho apropriado dentro de 2 semanas, para vários compostos da contagem de colónias foi feito uma semana mais tarde. Não houve diferenças significativas entre o número de clones obtidos após duas e três semanas (dados não apresentados).

As células foram incubadas em meio contendo composto por 4 h e, em seguida, eles foram crescidos em agar suave durante 14 dias na presença de meio isento de droga. colónias de células foram coradas com violeta de cristal e contadas. Os compostos foram agrupados com base na sua actividade anti-clonogénica expressos como percentagem de controlo tratado com veículo (0,05% de DMSO). Pelo menos duas experiências independentes foram realizados em duplicado. Veja a Figura S4 no arquivo SI para os dados quantitativos.

Comparação de curto e longo prazo efeitos de compostos ativos naturais em Melanoma células

Após a triagem inicial realizada a 5 mM, cada composto de The Natural Products Set II poderia ser atribuído a uma das cinco categorias (Fig. 5). Quarenta e seis compostos em 5? M não estavam ativos em qualquer um dos ensaios empregados em ambas as populações testadas. Eles foram excluídos da análises posteriores. Alguns desses compostos não-activos, tais como curcumina (27) ou rapamicina (69) são bem caracterizada pela sua actividade anti-cancro, mas, aparentemente, a 5 uM não eram activos contra células de melanoma independente de ancoragem. Vários compostos foram capazes de induzir a morte celular durante os dois primeiros dias, e, além disso, de forma eficiente as células com potencial clonogénico erradicada. Os compostos foram considerados como muito potentes, e as suas actividades, tanto não-clonogénicas e clonogénicas, foram medidos a concentrações mais baixas nas experiências seguintes. Duas drogas, actinomicina D (105) e ciclofosfamida (117), foram excluídas da análise mais aprofundada, como eles são muito bem caracterizados por sua

in vitro

in vivo

atividade anticancerígena Comprar e. Além disso, parthenolide (61) também foi excluída como nosso relatório detalhado descrevendo seus efeitos sobre células de melanoma independente de ancoragem, foi publicado recentemente [36]. Como foi dada prioridade a compostos que reduzem o número de células de melanoma que mostram a capacidade de auto-renovação, compostos seleccionados a partir do grupo de anti-clonogénica mas não foram altamente citotóxicos também ainda analisados.

Depois de rastreio inicial, os compostos foram agrupados com base nas suas actividades. Um composto foi definido como anti-clonogénica quando se reduziu a percentagem de clones formadas em agar mole a menos do que 20% de controlo tratado com veículo (0,05% de DMSO). Um composto foi chamado citostático quando se reduziu o número de células viáveis ​​para menos de 50% do controlo utilizando o número de células viáveis ​​de contagem, e citotóxicas utilizando a citometria de fluxo depois de PI-coloração. Os números correspondentes a compostos que se acumularam células de melanoma em subg

1 estão sublinhados. Compostos que causaram interrupção do ciclo celular são marcadas em verde para G

0 /G

1 fase, azul para a fase S e vermelho para G

2 /M fase. Vários compostos (46) não foram activos em qualquer ensaio. Alguns compostos eram citotóxicos mas não significativamente influenciado o número de colónias formadas em agar. Alguns outros compostos exerceram seus efeitos apenas em células clonogénicas ou reduzida clonogenicidade abaixo de 20% do controle, causou efeito citostático /citostático sem induzir a morte celular substancial. Vários compostos foram citostático e citotóxica e, além disso, de forma eficiente as células erradicada com potencial clonogênica. Estavam no foco do estudo adicional. Ver Tabela S1 no ficheiro SI para os nomes dos compostos correspondentes aos números mostrados na Figura.

Primeiro, os efeitos citotóxicos de compostos naturais potentes foram confirmados em seis linhas celulares derivadas de pacientes, incluindo quatro linhas celulares adicionais derivadas de espécimes cirúrgicos de melanoma nodular, DMBC2, DMBC8, DMBC10 [15] e DMBC9 [36]. As concentrações dos compostos foram reduzido a 1 uM e 0,1 uM, e em alguns casos a 0,01 uM ou mesmo 0,001 uM, até IC

50 efeito foi alcançado (Tabela S2 no ficheiro SI). Em geral, apenas pequenas diferenças entre as respostas de células de melanoma a partir de diferentes populações DMBC eram visíveis a concentrações de droga de 1 uM e 0,1 uM. DMBC8 células parece ser menos sensível a vários compostos que outras populações.

Em seguida, as curvas de dose-resposta foram preparados por 45 compostos exercendo fortes potenciais anti-clonogénicas e /ou citotóxicos (Fig. 6 e Fig. S5 em SI arquivo). Com base nas curvas de dose-resposta, a lista de classificação dos compostos mais potentes a partir de produtos naturais Conjunto II foi preparado (Tabela 1). A actividade anti-clonogênica foi classificado acima atividade citotóxica. IC

50 valores de sete compostos eram abaixo de 0,1 | iM, quando a influência de drogas sobre a capacidade de formar clones em agar mole foi avaliada. Entre aqueles compostos, maitansina (60) exerceu um efeito citotóxico global mais forte do que o efeito anti-clonogénica, estreptonigrina (32), Toiocamicina (108), colchicina (1) e Equinomicina A (102) tinha uma potência semelhante em ambas as actividades, enquanto nanaomycin Um (74) e illudina H (114) eram mais potentes em células com o potencial clonogénico erradicação do que na redução da viabilidade no incubação de curto prazo. Fenómenos semelhantes foram observados para vários compostos que eram eficazes a concentrações mais elevadas. Por exemplo, o IC

50 valores para os compostos anti-clonogénicas, briostatina 1 (112), siomycin A (107), fumitremorgin C (118), fumagallin (120) michellamina B (101) e da pentoxifilina (100) estavam de na gama de 0,1 – 1 jiM no ensaio clonogénico mas na gama de 1 -. 5 uM no ensaio de viabilidade

curvas de dose-resposta foram preparados para os compostos que mostram um elevado potencial anti-clonogénica e /ou citotóxico. Curvas azuis, a actividade anti-clonogênica; curvas preto, actividade citotóxica. Os gráficos resumiu os resultados de pelo menos 3 experiências independentes realizadas em triplicata utilizando DMBC11 (quadrado preenchido) e DMBC12 (quadrado aberto) linhas celulares. As fórmulas químicas de compostos testados estão incluídos. As curvas de dose-resposta para os compostos menos potentes são mostrados na Figura S5 em Arquivo SI.

indução de apoptose em células de melanoma Expostos a compostos seleccionados

citometria de fluxo e anexina V /as células marcadas com PI revelou que os compostos altamente citotóxicos induzidos a apoptose em células de melanoma, enquanto que os compostos erradicar principalmente células com a capacidade para formar clones (Tabela 1) não desencadear a apoptose em concentrações eficazes para a sua actividade anti-clonogénica (Fig. 7) . Por exemplo, maitansina (60) induziu apoptose na maioria das células a uma concentração tão baixa como 0,01 uM. Pelo contrário, nanaomycin A (74), que em 0.1 uM quase completamente as células com potencial clonogénico erradicada não induziu apoptose a esta concentração.

A indução de apoptose foi determinada por citometria de fluxo após a Anexina V /coloração com iodeto de propídio . gráficos de contorno típicos de células de melanoma tratadas com os compostos nas concentrações indicadas são mostrados.