gene

Abstract

Estudos anteriores sugeriram grupo Ataxia-telangiectasia D complementando (CTDM) como um oncogene em muitos tipos de cancro. No entanto, as suas funções biológicas de expressão e no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) permanecem pouco claros. Aqui, nós investigamos seu padrão de expressão em 109 casos de amostras de NSCLC humanos por imuno-histoquímica e descobriu que CTDM foi sobre-expresso em 62 de 109 amostras de NSCLC (56,88%). ATDC superexpressão correlacionada com o tipo histológico (p 0,0001), o estado do tumor (p = 0,0227) e diferenciação histológica (p = 0,0002). A seguir, sobre-expresso em ATDC brônquica HBE linha de células epiteliais humanas normais e empobrecido a sua expressão em células A549 NSCLC linhas e H1299. MTT e ensaio de formação de colónias mostrou que CTDM superexpressão promoveu a proliferação celular, enquanto seu esgotamento inibiu o crescimento celular. Além disso, a análise do ciclo celular mostraram que a sobre-expressão ATDC diminuiu a percentagem de células em fase G1 e aumentou a percentagem de células em fase S, enquanto que o tratamento ATDC siARN aumentou a percentagem de fase G1 e diminuiu a percentagem da fase S. Outras estudo revelou que CTDM superexpressão podia-se-regular ciclina D1 e expressão de c-Myc em células HBE enquanto seu esgotamento ciclina D1 e expressão de c-Myc regulada no A549 e H1299 células. Além disso, CTDM superexpressão também foi associado com um aumento do índice de proliferação, ciclina D1 e expressão de c-Myc em amostras de NSCLC humanas. Outras experiências demonstraram que a sobre-regulada ATDC ciclina D1 e expressão de c-Myc independente de Wnt /β-catenina ou via de sinalização de p53. Curiosamente, CTDM superexpressão aumento da atividade luciferase repórter NF-kB e nível de proteína p-IkB. Correspondentemente, o NF-kB inibidor bloqueou o efeito de ATDC sobre-regulação da ciclina D1 e c-Myc. Em conclusão, demonstramos que CTDM pode promover a proliferação do cancro do pulmão através de NF-kB induzida up-regulação da ciclina D1 e c-Myc

Citation:. Tang ZP, Dong QZ, Cui QZ, Papavassiliou P, Wang ED , Wang EH (2013) D Complementando Gene Grupo Ataxia Telangiectasia-(CTDM) promove o câncer de pulmão Proliferação celular através da activação de NF-kB Caminho. PLoS ONE 8 (6): e63676. doi: 10.1371 /journal.pone.0063676

editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |

Recebido: 15 de novembro de 2012; Aceito: 07 de abril de 2013; Publicação: 12 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (bolsas 81071905 e 81272606). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das principais causas de todas as mortes relacionadas com cancro em todo o mundo e, em particular o cancro do pulmão, não-pequenas células (CPNPC), constitui a maioria dos casos diagnosticados [1], [2] . Múltiplos factores incluindo genética, epigenética e microambiental, têm um papel importante na sobrevivência e a colonização das células tumorais a um local de tecido distante, levando à metástase [3]. No entanto, apesar de muitos estudos experimentais, um mecanismo molecular subjacente que governa a metástase de tumores individuais ainda não foi totalmente compreendido. Devido ao êxito limitado das terapias convencionais na obtenção de uma sobrevivência a longo prazo em pacientes com cancro do pulmão, os esforços de investigação têm-se centrado nas vias biológicas envolvidas em progressão do tumor e a sobrevivência de células neoplásicas, a fim de identificar alvos terapêuticos potenciais [4].

grupo Ataxia-telangiectasia D gene complementando (CTDM) é um membro da família motivo tripartite (TRIM) [5]. TRIM proteínas possuem tipicamente uma série de domínios conservados incluindo múltiplos motivos de dedo de zinco e um motivo de fecho de leucina. Estas proteínas têm sido demonstrados para participar na regulação do crescimento e desenvolvimento de células e têm sido implicadas em várias doenças humanas tais como a infecção pelo HIV e leucemia [6], [7]. Em particular, a guarnição de proteínas, tais como TRIM8, TRIM22, TRIM38 e TRIM40 têm sido relatados para engatar na regulação da activação do NF-kB [8] – [11]. ATDC, também conhecido como TRIM29, foi inicialmente identificada numa pesquisa para o gene responsável pela doença genética ataxia-telangiectasia e verificou-se possuir funções supressoras radiossensibilidade [12]. Estudos subsequentes mostraram que ATDC foi sobre-expressa em vários tipos de cancros, incluindo pâncreas, gástrico, da bexiga, colorrectal, do ovário e cancro do endométrio, bem como no mieloma de células plasmáticas [13] – [21]. Considerando que, a sua expressão foi aparentemente reduzido em diversos outros tumores, como os cancros de melanoma, mama, próstata, cabeça e pescoço [22] – [27]. Apenas um relatório descreveu o aumento da expressão do mRNA CTDM em associação com alto grau histológico, tamanho grande tumor, extensão da invasão tumoral e metástases em linfonodos no câncer gástrico [15]. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, a expressão da proteína de CTDM e sua relação com fatores clínico-patológicos em cancros do pulmão primários nunca foram caracterizados.

Um estudo recente em uma linha de células de adenocarcinoma do pâncreas demonstrou que CTDM interage com Disheveled -2 e os componentes do complexo de destruição β-catenina para estabilizar β-catenina e activam a sinalização de Wnt, uma via essencial que promove a progressão do tumor em diversos tipos de cancro [13]. Outros estudos sugeriram que ATDC se liga a p53 no citoplasma para sequestrar-lo de núcleo resultando na regulação negativa do seu gene alvo p21 [28]. Na linha de células de carcinoma epidermóide humano A431, foi observado ATDC para interagir com a proteína vimentina intermédia de filamentos e com um inibidor de proteína quinase C, actuando assim como um componente da via de transdução de sinal da proteína quinase C [29]. No seu conjunto, estes estudos anteriores sugerem que ATDC pode funcionar como um oncogene para promover a proliferação de células de cancro e invasão. No entanto, ainda não foram determinados os papéis biológicos de CTDM em células de câncer de pulmão.

A fim de abordar as questões acima, verificamos distribuição expressão e tecido CTDM no cancro do pulmão de não-pequenas células por imuno-histoquímica e analisados sua associação com os parâmetros clínico. Nós também investigou o papel de CTDM na proliferação celular e ciclo celular progressão usando abordagens gain- ou perda de função. Mais importante, nós exploramos o potencial mecanismo pelo qual as funções CTDM para promover a proliferação de células de câncer de pulmão.

Métodos

Pacientes e espécimes

Este estudo foi realizado com a aprovação do conselho de revisão institucional na China Medical University. consentimento escrito foi dada pelos participantes para informação a ser armazenada na base de dados do hospital para os espécimes para ser utilizado neste estudo. E toda a investigação clínica tem sido conduzido de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. As amostras de tumores primários foram coletados de 109 pacientes com carcinoma de células escamosas (SCC) ou adenocarcinoma do pulmão submetidos à ressecção cirúrgica completa no Primeiro Hospital Afiliado da China Medical University, entre 2001 e 2004. carcinoma de grandes células, carcinoma adeno ou outro NSCLC subtipos foram excluídos deste estudo. informações de acompanhamento foi obtido pela revisão dos prontuários dos pacientes. Nenhum dos pacientes havia recebido radioterapia ou quimioterapia antes da ressecção cirúrgica, e todos os pacientes foram tratados com a quimioterapia de rotina após a ressecção. Todos os 109 casos foram revistos para subtipo histológico, diferenciação e estágio do tumor. O diagnóstico histológico e grau foram avaliadas em hematoxilina e-eosina de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) de classificação. De 109 casos, 46 (42,2%) eram do SCC e 63 (57,8%) eram adenocarcinoma. metástases dos nódulos linfáticos foram identificadas em 44 (40,4%) dos 109 pacientes. O sistema de estadiamento p-TNM da União Internacional contra o Câncer (7th Edition) foi utilizado para classificar os casos.

Cultura de Células e

linhas celulares Tratamento

NHBE, A549, H1299, H157 e H460 foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). linhas celulares LH7 e LK2 foram adquiridos a partir de Xangai Cell Bank da Academia Chinesa de Ciências. A linha de células BE1 foi fornecido como um presente pelo Dr. J Zheng (Departamento de Patologia da Peking University School of Medicine). A linha de células BE1 foi criado pelo Dr. J Zheng e Dr. WY Zhu em 1995 e agora pode ser comprado de Plataforma Nacional de Recursos célula experimental para Sci-Tech (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal de vitelo. As células foram cultivadas em placas de cultura de tecidos estéreis e foram passadas a cada 2 dias, utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen). NF-kB inibidor BAY 11-7082 (10 mM, 6 horas) foi adquirido de Sigma Aldrich.

Imunohistoquímica

espécimes de tumor extirpado cirurgicamente foram fixadas com formalina a 10% neutra, embebidos em parafina e Prepararam-se 4 mm de espessura. A imunocoloração foi realizada utilizando o método do complexo avidina-biotina peroxidase (Ultra Sensível TM, Maixin, Fuzhou, China). As secções foram desparafinadas com xileno, re-hidratadas com uma série álcool graduado e fervidas em tampão de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 minutos numa autoclave. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando peróxido de hidrogénio (0,3%) antes da incubação das secções com soro de cabra normal para reduzir a ligação não específica. As secções de tecido foram então incubadas com anticorpo policlonal de coelho ATDC (1:150 diluição) (cat.17542-1-AP, Proteintech, IL, EUA). Imunoglobulina de coelho (com a mesma concentração do anticorpo específico de antigénio) (cat.NC-100, Maixin, Fuzhou, China) foi utilizado como um controlo negativo. coloração imuno-histoquímica de Ki67 (1:200 diluição) (cat.MAB-0129, Maixin, Fuzhou, China), c-Myc (1:500 diluição) (cat.ab32, Abcam) e ciclina D1 (1:100 diluição) ( cat.2978, tecnologia de sinalização celular, Boston, MA, EUA) foram também executado de acordo com as instruções dos fabricantes. Coloração para todos os anticorpos primários foi realizada à temperatura ambiente durante 2 horas. biotinilado de cabra IgG sérica anti-ratinho ou IgG de cabra biotinilado anti-soro de coelho (pronto a utilizar) (cat.KIT-9922, Maixin, Fuzhou, China) foi usado como segundo anticorpo. Após a lavagem, as secções foram incubadas com conjugado de peroxidase de rábano-estreptavidina-biotina, seguido de 3, 3′-tetracloridrato de diaminobenzidina a desenvolver reacção de peroxidase. Contracoloração foi realizada com hematoxilina, e as seções foram então desidratadas com etanol antes de ser montado.

Dois pesquisadores avaliaram de forma independente todos os slides tumorais. Cinco campos aleatórios foram examinados por lâmina, e 100 células foram avaliadas por alto campo de ampliação (400 ×). epitélio brônquico normal nas secções de tumor foi usado como um controlo negativo interno. A imunocoloração de ATDC foi marcado na sequência de uma escala semi-quantitativa, avaliando a intensidade de coloração e a percentagem de células tumorais em áreas representativas em relação ao observado nas células de controlo. imunocoloração positiva foi definida como uma coloração citoplasmática distinta das células tumorais. A intensidade da coloração citoplasmática ATDC foi estratificado como 0 (sem coloração), 1 (fraca) e 2 (forte). contagens percentuais foram designados como 1 (1-25%), 2- (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%). Os escores de cada amostra de tumor foram multiplicados para dar uma pontuação final de 0-8 e a expressão total de CTDM foi determinada como qualquer expressão negativa ou baixa (-), se a pontuação total foi de 4, e de expressão como positivo ou alta expressão (+), se a pontuação total foi de ≥4.

a coloração imuno-histoquímica para Ki-67 foi avaliada e pontuada como percentagem das células cancerosas imunoreativos, com um total de 500 células tumorais examinada por lâmina. O valor médio desta série (35%) foi usado como um valor limite para estratificar os tumores no grupo com um baixo ( 35%) e o índice de um com um elevado índice de (≥35%) da proliferação das células. A expressão de c-Myc e da ciclina D1 foi definida como nível elevado de expressão de baixo nível ou de acordo com os critérios anteriores [30], [31].

quantitativa PCR em tempo real (Método SYBR Verde)

quantitativa PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green PCR Master mix com um volume total de 20 uL em 7900HT rápido real-Time PCR System (Applied Biosystems). A condição de reacção é como se segue: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos e 60 ° C durante 30 segundos. Um passo de dissociação foi aplicada para gerar uma curva de fusão para confirmar a especificidade da amplificação. transcritos de p-actina foram amplificados e servido como a referência. Os níveis relativos de expressão de genes foram representados como referência -Ct gene ΔCt = Ct, e a mudança de dobragem da expressão do gene foi calculada pelo método 2-ΔΔCt. As experiências foram realizadas em triplicado

O iniciador sequências foram as seguintes:.

β-actina para a frente, 5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3 ‘, β-actina reverso, 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ; ATDC para a frente, 5’-GCACCGGACACCATGAAGA-3 ‘, ATDC reverso, 5′-GGAGACGAGGGCTGGTATGA-3’.

Análise Western Blot

Total de proteínas a partir de tecidos com NSCLC e linhas celulares de cancro de pulmão foram extraídos em tampão de lise (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) e quantificada através do método de Bradford. Cinquenta microgramas de proteína foram separadas por SDS-PAGE (12%). Após a transferência, o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EUA) foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos seguintes: ATDC (1:1000; cat.17542-1-AP, Proteintech), β- actina (1:500; cat.612657), β-catenina (1:1000; cat.610154) (BD Transduction Laboratories), A2 ciclina (1:1000; cat.4656S), ciclina D1 (1:1000; gato. 2978), ciclina E1 (1:800; cat.4129), CDK2 (1:1000; cat.2546), CDK4 (1:1000; cat.2906), CDK6 (1:1000; cat.3136), P- Rb (Ser807 /811) (1:2000; cat.8516), P21 (1:800; cat.2947), p-IkB (Ser32) (1:500; cat.2859) (tecnologia de sinalização celular, Boston, MA , EUA), c-Myc (1:1000; cat.ab32, Abcam), β-catenina activo (1:500; cat.05-665, Millipore), p65 (1:500; sc-8008, Santa Cruz) . Após a incubação com anti-ratinho acoplados a peroxidase (cat.sc-2005) ou de coelho (cat.sc-2004) IgG (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 horas, as proteínas ligadas foram visualizadas utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific) e quantificada utilizando bioimaging Sistemas (UVP Inc., Upland, CA, EUA). Os níveis de proteína relativos foram calculados em referência a p-actina como o controle de carregamento.

plasmídeo transfecção e pequeno RNA de interferência Tratamento

O plasmídeo pCMV6-CTDM foi comprado de Origene. pCMV6 vector vazio foi utilizado como um controlo negativo. On-alvo mais siRNAs para ATDC (M-012409-01) e não segmentação siARN # 1 (D-001810-01) foram adquiridos da Dharmacon (Lafayette, CO, EUA). O plasmídeo e siRNA foram transfectados para células utilizando Attractene Transfection Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanha). Resumidamente, as células foram semeadas numa placa de 6 poços de 24 horas antes da experiência. Os níveis de mRNA e de proteína de CTDM foram determinados 48 horas após a transfecção.

Teste de Proliferação Celular e Formação de Colónias Ensaio

ensaio de proliferação celular foi realizada utilizando celular Contagem solução Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas a uma concentração de 5 × 10

3 células /100 uL /​​poço em placas de 96 poços de cultura e tratadas com 10 ul /poço de celular de contagem Kit-8 solução durante as últimas 4 horas de cultura . A densidade óptica dos poços foi medida no comprimento de onda de 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

Para o ensaio de formação de colónias, as células foram semeadas em três pratos de cultura de células de 6 cm (1 × 10

3 células por prato ) e incubou-se durante 12 dias. As placas foram lavadas com PBS e coradas com Giemsa. O número de colónias com mais de 50 células foram contadas.

ciclo celular Análise

As células (5 × 10

5) foram semeadas em um disco de 6 cm de cultura de tecidos. Após 12 horas de incubação, as células foram tratadas com inanição de soro durante 24 horas antes da transfecção com doses indicadas de plasmídeos ou ARNsi. Nos pontos de tempo indicados, as células foram colhidas, fixadas em paraformaldeído a 1%, lavou-se com solução salina de fosfato tamponada (PBS) e coradas com 5 mg /ml de iodeto de propidio em PBS suplementado com ARNase A (Roche, Indianapolis, IN) durante 30 minutos a temperatura do quarto. As células coradas foram recolhidos e analisados ​​utilizando sistemas de citometria de fluxo BD

Luciferase Reporter Assay

ensaio de transfecção do gene repórter e a actividade de luciferase foram realizados como se segue:. As células em crescimento confluente numa placa de 24 poços foram co-transfectadas com o repórter de luciferase de pirilampo (0,2 ug) juntamente com o repórter luciferase de Renilla (Promega co) (0,02 mg) durante 12 horas, utilizando um reagente attractene (Qiagen) de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante. Os plasmídeos repórter de TOP /FLASH, p53 e NF-kB foram adquiridos de BioTime Biotecnologia, China. A actividade de luciferase foi medida em extractos celulares utilizando um kit de luciferase relatado ensaio de gene duplo (Promega, CA, EUA). A actividade relativa do gene repórter foi calculado dividindo-se os sinais de repórter da luciferase do pirilampo por os sinais obtidos a partir de repórter de luciferase de Renilla.

Análise estatística

SPSS 16.0 para Windows foi utilizado para todos estatística analisa. O teste do qui-quadrado foi usado para examinar possíveis correlações entre a expressão CTDM e fatores clínico-patológicas. O teste t de Student foi utilizado para testar a diferença entre os grupos e os valores de p foram com base na análise estatística de dois lados, com um valor de p 0,05 designando significância estatística

Resultados

a superexpressão de CTDM proteína em células não pequenas do pulmão cancer tecidos e sua relação com fatores clínicopatológicos

a fim de investigar os níveis de proteína CTDM no câncer de pulmão, examinamos a expressão CTDM em um painel de 109 amostras de NSCLC e 20 emparelhado tecidos pulmonares normais homólogos usando imuno-histoquímica. A sobre-expressão de ATDC foi observado em 62 (56,88%) de 109 amostras de NSCLC, e a proteína foi ATDC localizada principalmente no citoplasma das células de tumor (Figura 1C-F). Não ou sinais fracos de coloração foram detectados nos tecidos pulmonares normais e os epitélios bronquiais normais adjacentes ao tumor (Figura 1A-B).

. coloração negativa em pneumócitos normais nos alvéolos do pulmão de não-tecido neoplásico. B. coloração negativa no epitélio brônquico normal no tecido pulmonar não neoplásico. C. ATDC coloração negativa no adenocarcinoma de pulmão. D. coloração CTDM fraco no adenocarcinoma de pulmão. E. coloração CTDM fraco no carcinoma epidermóide de pulmão. F. forte coloração CTDM no carcinoma epidermóide de pulmão.

A relação entre a expressão CTDM e vários parâmetros clínico-patológicas foi também analisado. Como mostrado na Tabela 1, foi observada uma associação significativa entre ATDC sobre-expressão e a extensão do tumor primário (T1-T2 contra T4:42.11% vs 64,79%, P = 0,0227), a diferenciação histológica (bem diferenciação em relação pobre diferenciação moderado /: 31,43% versus 68,92%, P = 0,0002) e tipos histológicos (carcinoma de células escamosas contra adenocarcinoma: 97,83% vs 26,98%, p 0,0001). Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre CTDM superexpressão ea idade do paciente (p = 0,5449), sexo (p = 0,3696), estado nodal (p = 0,2327) ou estágio TNM (p = 0,5085).

CTDM promove a proliferação celular em linhas celulares de cancro do pulmão

a expressão de CTDM foi analisada por PCR em tempo real e western blot em um painel de linhas celulares de cancro do pulmão e de uma linha de células epiteliais brônquica normal HBE (Figura 2A- B). Descobrimos que os níveis de ARNm tanto ATDC e de expressão de proteínas em linhas de células NSCLC foram muito mais elevados do que na HBE, especialmente em A549 e linhas de células H1299. A fim de investigar um possível papel do CTDM no crescimento de células de câncer de pulmão, nós transfectadas uma expressão cDNA CTDM construir em células HBE e aplicado um conjunto constituído por três siRNAs CTDM-alvo para knockdown expressão CTDM em ambos os A549 e células H1299 (Figura 2C-D). células HBE demonstraram um aumento significativo na expressão ATDC ATDC após a transfecção, enquanto siRNA específico ATDC-bloqueou eficientemente a expressão ATDC em A549 e linhas de células H1299.

. Os níveis de expressão de ARNm de ATDC analisados ​​por PCR em tempo real em um painel de linhas celulares de cancro do pulmão. Note-se a expressão mais elevada é observada na linha celular A549 e o menor é visto em células HBE. B. ATDC níveis de expressão de proteína analisados ​​por Western blot num painel de linhas celulares de cancro de pulmão. Nota uma correlação directa do nível de proteína (B) com os transcritos de (A) em cada linha celular. C. em tempo real A análise de PCR de ATDC eficiência sobreexpressão em células HBE e eficiência depleção em A549 e células H1299 em um nível transcricional. análise de mancha de D. ocidental de CTDM eficiência superexpressão em células HBE e eficiência esgotamento no A549 e células H1299 a um nível de proteína. A banda inferior de MW em células H1299 é um produto de degradação de proteínas. Nota uma correlação directa do nível de proteína (D) com os transcritos de (C) em cada linha celular.

ensaio MTT mostraram que a transfecção de ADNc em células ATDC HBE promovido o crescimento celular em comparação com o controlo (transfecção de vectores vazios) (HBE controle versus ADNc ATDC: 1,06 ± 0,05 contra 1,41 ± 0,05, p 0,05). O efeito de ATDC na capacidade de proliferação foi também analisada usando ensaio de formação de colónia. CTDM superexpressão em células HBE levaram a um aumento notável no número de colónias (controle HBE contra cDNA CTDM: 221 ± 13 versus 441 ± 9, p 0,05). Por outro lado, a taxa de proliferação celular (A549 NF contra siATDC: 1,23 ± 0,03 contra 0,84 ± 0,03; H1299 NC vs siATDC: 1,72 ± 0,01 contra 1,19 ± 0,02; p 0,05) e a capacidade de formação de colónias (A549 NF contra siATDC: 400 ± 12 versus 150 ± 14; H1299 NC contra siATDC: 258 ± 20 119 ± 17 contra; p 0,05) foram atenuados em A549 e células H1299 com ATDC knockdown (Figura 3). Estes resultados em conjunto sugerem que CTDM pode modular a proliferação de células do cancro do pulmão.

A. ensaio de MTT que mostra ATDC transfecção em células HBE promove o crescimento celular e ATDC knockdown em A549 e células H1299 inibe a proliferação celular. B-C. Avaliação de potenciais clonog�icas das células com superexpressão CTDM e células empobrecido CTDM por contagem de números de colónias. Um aumento notável no número de colónias foi observada nas células com HBE ATDC sobreexpressão, em comparação com o controlo, e o número de colónias formadas por células A549 H1299 e tratou-se com ATDC siARN foi muito menos do que a de células de controlo. Colunas em C representa o valor médio de 3 duplicatas; barras representam o desvio padrão [13]. * Indica uma significância estatística na diferença entre os valores de barras 2 indicadas (p 0,05).

CTDM Facilita G1 /S Transição e Up-regula ciclina D1 e c-Myc expressão em células do cancro do pulmão

análise do ciclo celular de células activadas por fluorescência (FACS) foi executada em células que sobre-expressam ATDC HBE e em ATDC empobrecido A549 e células H1299 (Figura 4). ATDC superexpressão diminuiu a percentagem de células na fase G1 (controle HBE contra ADNc ATDC: 68,04% ± 0,04% versus 57,74% ± 0,51%, p 0,05) e aumentou a percentagem de células em fase S (controlo HBE contra ADNc ATDC: 12,48% ± 0,74% versus 27,62% ± 0,61%, p 0,05). Por outro lado, o tratamento ATDC siARN aumentou as células na fase G1 (A549 NC contra siATDC: 64,99% ± 0,57% versus 75,99% ± 2,72%; H1299 NC contra siATDC: 52,66% ± 1,47% versus 63,80% ± 1,13%, p 0,05 ) e diminuiu as células na fase S (A549 NF contra siATDC: 29,59% ± 0,45% versus 9,24% ± 0,06%; H1299 NC contra siATDC: 37,55% ± 3,13% versus 20,80% ± 3,11%, p 0,05) em comparação com ao controle. Estes resultados sugerem que ATDC pode promover a progressão através do ciclo celular G1 /S limite

ATDC sobreexpressão em células HBE aumenta as células em fase S e diminui as células em fase G1. (P 0,05 comparado com o controlo). CTDM knockdown em células A549 e H1299 aumenta as células em fase G1 e diminui células em fase S (p 0,05 comparado com o controle).

Para investigar o mecanismo de progressão do ciclo celular regulada por CTDM em câncer de pulmão, examinaram o efeito de ATDC sobre ciclina a, ciclina D1, ciclina e, CDK2, CDK4, CDK6, p-Rb e de c-Myc em linhas celulares de cancro do pulmão. Como mostrado na Figura 5, a análise de transferência de western revelou que ATDC sobre-expressão sobre-regulada os níveis de proteína de ciclina D1, CDK4, CDK6, p-Rb e de c-Myc em células HBE, enquanto knockdown de ATDC diminuição da expressão destas proteínas em A549 e células H1299. No seu conjunto, estes resultados sugerem que ATDC pode promover a transição G1 /S através de up-regulação da ciclina D1 e expressão de c-Myc.

análise de transferência de Western revela que ATDC transfecção aumenta Ciclina D1 e expressão de c-Myc em células e HBE knockdown de CTDM diminui os níveis de proteína de ciclina D1 e c-Myc em ambas as células H1299 A549 e, sem alterações significativas na expressão de ciclina a e ciclina e.

CTDM expressão se correlaciona com índice de marcação Ki67, ciclina D1 e c-myc em NSCLC níveis tecidos

Foi examinada a relação entre o nível de proteína total ATDC e o índice de proliferação (Ki67 rotulagem) em NSCLC. Descobrimos que os casos com um elevado nível de expressão da proteína ATDC tenderam a exibir um índice de proliferação elevado, em comparação com aqueles com um baixo nível de ATDC (p = 0,0022) (Figura 6). A imunocoloração para ciclina D1 e c-Myc foi também realizado em espécimes NSCLC e suas associações com expressão ATDC foram analisados ​​(Figura 6). Como mostrado na Tabela 1, a sobre-expressão ATDC correlacionada com um elevado nível de ciclina D1 (p = 0,0010) e a expressão de c-Myc (p = 0,0150).

coloração imuno-histoquímica de ATDC (A e B), ciclina D1 (C e D), c-Myc (e e F) e Ki67 (G e H) em amostras de NSCLC. A, C, E e G indicam um caso representativo com positiva ATDC demonstrando um elevado nível de ciclina D1 e c-myc, um elevado índice de marcação de Ki67, enquanto que B, D, F e H representam um caso com ADTC negativa e correspondendo negativo ciclina D1 e c-Myc manchas ou baixo nível de rotulagem ki67.

CTDM Up-regula ciclina D1 e c-Myc em células de câncer de pulmão Independente de Wnt /β-catenina ou p53 via de sinalização

dados recentes mostram que a superexpressão de CTDM leva a wnt activação sinalização em linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas. Isso levanta a questão de saber se CTDM mediada up-regulação da ciclina D1 e c-Myc em células de câncer de pulmão resulta de uma ativação da via de transdução de sinal de Wnt em que a ciclina D1 e c-Myc são componentes cruciais. Para testar isso, medimos β-catenina total e níveis de β-catenina ativos por análise de Western blot, e examinou a atividade de Wnt por ensaios de repórter de luciferase em células HBE com superexpressão CTDM e em H1299 e células A549 knocked-down de CTDM. Sem aparentes alterações dos níveis de actividade e β-catenina Wnt foram observadas nestas células com níveis alterados de ATDC (Figura 7A-B). Portanto, o efeito de ATDC na proliferação de células do cancro de pulmão parece ser independente de Wnt /β-catenina via de transdução de sinal.

. Não houve alteração significativa da actividade de luciferase após Topflash ATDC transfecção em células HBE e após o tratamento com siRNA em A549 e células H1299. B. Não houve alteração significativa da β-catenina e os níveis de proteína β-catenina activas após transfecção em células ATDC HBE e após o tratamento com siRNA em A549 e células H1299. C. ATDC transfecção em células HBE ou seu esgotamento em células A549 não alterou o nível de actividade da luciferase de p53. D. CTDM transfecção na HBE ou seu esgotamento em células A549 não alterou o nível de proteína de p53 p21 gene alvo.

Desde CTDM foi relatado para aumentar a proliferação celular através da inibição da p53 atividades nucleares, nós saber Se o ATDC mediada por sobre-regulação da ciclina D1 e c-Myc em células de cancro do pulmão pode ser devido ao seu efeito inibitório sobre a proteína p53. Entre as 3 linhas celulares utilizadas acima, as células H1299 foram bem conhecido por ter perdido gene p53, enquanto que as células A549 e HBE expressar tipo selvagem de p53. Portanto, avaliou-se o efeito sobre a actividade de ATDC p53 em células A549 e HBE. Tal como mostrado na Figura 7C-D, a superexpressão da ATDC em células HBE não se alterou de forma significativa a actividade do repórter de luciferase responsivo p53 ou a expressão de p21 p53 gene alvo. Nem a mudança foi observada em células A549 desprovidas de CTDM endógeno. Em conjunto com o fato de que CTDM regulada ciclina D1 e nível de c-Myc em células H1299 p53, nós pensamos que o efeito da CTDM na progressão do ciclo celular em células de câncer de pulmão pode ser independente da atividade p53.

ATDC-regula ciclina D1 e c-Myc, através da activação de NF-kB Caminho

Uma vez que tanto a ciclina D1 e c-Myc foram alvos a jusante de NF-kB, foi examinada a expressão de proteína de p65, p-IkB e a actividade de luciferase de NF-kB para avaliar se ATDC poderia regular a activação do NF-kB via (Figura 8A-B). Parecia que CTDM superexpressão em células HBE-regulada a actividade da luciferase repórter NF-kB, e, correspondentemente, a depleção CTDM em A549 e H1299 células regulada para baixo sua actividade. Por outro lado, o nível de p-IkB foi regulada em células transfectadas com HBE ATDC e regulados negativamente em células A549 e H1299 depletados de ATDC endógeno, embora não houvesse nenhuma mudança significativa de p65 nível total nestas células. Estes resultados sugerem um possível envolvimento da ativação de NF-kB na CTDM induzida up-regulação da ciclina D1 e c-Myc. Bay 11-7082, que inibe a fosforilação e a degradação de IkBa para bloquear a activação de NF-kB, foi também utilizado em células transfectadas com HBE ATDC para confirmar o efeito da activação do NF-kB. Tal como mostrado na Figura 8C, NF-kB reverteu o efeito inibidor de ATDC sobre ciclina D1, c-Myc e p-RB em células HBE. Portanto, a ativação de NF-kB pode ser um pré-requisito para CTDM induzida up-regulação da ciclina D1 e c-Myc.

A. CTDM superexpressão-regulada a actividade da luciferase repórter NF-kB em células HBE e exaustão CTDM inibiu a atividade da luciferase repórter NF-kB tanto em células H1299 A549 e. B. ATDC transfecção aumento da expressão de p-IkB em células HBE e depleção ATDC diminuição do nível de p-IkB em A549 e células H1299.