Abstract

Fundo

Este estudo foi desenhado para explorar o potencial terapêutico de suprimir MAP quinase e PI3K /Akt percursos e histona deacetilase (HDAC) para induzir a expressão de sódio symporter /iodeto (NIS) e captação de iodo radioativo em células cancerosas não-tireóide.

Métodos

Nós testados os efeitos do inibidor MEK RDEA119, o perifosina inibidor da Akt, e o inibidor de HDAC em SAHA expressão NIS em treze linhas celulares de cancro humano derivadas de melanoma, carcinoma hepático, carcinoma gástrico, carcinoma do cólon, carcinoma da mama, e cancros do cérebro. Também examinamos captação de iodo radioativo e acetilação das histonas no promotor NIS em células selecionadas.

Resultados

No geral, os três inibidores poderia induzir a expressão de NIS, em graus diferentes, no melanoma e todo o carcinoma epitelial -derived células mas não em células derivadas de cancro cerebral. SAHA foi mais eficaz e seu efeito poderia ser significativamente reforçada por RDEA119 e perifosine. A expressão de NIS, tanto a nível de ARNm e de proteína, foi mais robusta na de células de melanoma M14, de células de carcinoma hepático HepG2, e a célula de carcinoma gástrico MKN-7. captação de radioiodo foi induzida correspondentemente, acompanhada por um aumento robusto na acetilação de histonas no promotor NIS, nessas células quando tratados com as três inibidores.

Conclusões

Esta é a primeira demonstração de que a supressão simultânea MAP quinase e PI3K /Akt percursos e HDAC poderia induzir a expressão NIS robusto e captação de iodo radioativo em determinadas células cancerosas humanas não-tireóide, proporcionando novas implicações terapêuticas para o tratamento com iodo radioactivo adjunto destes cancros

Citation:. Liu Z, Xing M (2012) indução de /Iodeto Simportadores (NIS) Expressão de sódio e Radioiodine Captação em células de câncer não-tiróide. PLoS ONE 7 (2): e31729. doi: 10.1371 /journal.pone.0031729

editor: Marian Ludgate, da Universidade Cardiff, Reino Unido

Recebido: 12 de setembro de 2011; Aceito: 12 de janeiro de 2012; Publicado: 16 de fevereiro, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Liu, Xing. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de CA134225 Health subvenção R01 ao Dr. Xing. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Como uma glicoproteína transmembranar expressa principalmente em células da tireóide epiteliais foliculares, symporter iodeto de sódio (NIS) desempenha um papel fundamental no transporte de iodeto do espaço extracelular para dentro da célula da tireóide para a síntese de hormônios da tireóide na glândula tireóide [1] – [4]. Esta é a base biológica para a aplicação clínica de radioiodo no diagnóstico e tratamento de uma variedade de doenças da tiróide benignos e malignos. Um exemplo típico de utilização desta função de NIS é a ablação com iodo radioactivo amplamente aplicado para o tratamento do cancro da tiróide [5], [6]. tratamento com iodo radioactivo é geralmente eficaz em pacientes com câncer de tireóide, mas torna-se ineficaz quando as células cancerosas da tiróide perderam a expressão de NIS e já não pode levar até radioiodine como tipicamente visto em mal cânceres diferenciados e indiferenciados da tiróide [7] – [10]. Estudos anteriores demonstraram que os inibidores da histona deacetilase (HDAC) poderia induzir a expressão do NIS em células de cancro da tiróide [11], [12]. Recentemente demonstramos que a combinação do inibidor HDAC SAHA com inibidores da MAP quinase e PI3K /Akt percursos poderia induzir a expressão robusta e sinérgica de NIS e captação de iodo radioativo em células de cancro da tiróide [13]. Isso abriu a possibilidade para novo tratamento eficaz do cancro da tiróide com radioiodo que seja de outra forma não-ávido para este radioisótopo.

Dada a função única de NIS para o transporte de iodeto nas células da tireóide e o sucesso clínico do uso de radio-iodo a tireóide câncer de tratamento de ablação, que tem sido proposto e testado expressão NIS que induziu exogenamente utilizando a transferência de gene alvo pode conferir as células cancerosas não tireoidianas avidez radioiodo para tratamento com iodo radioactivo ablação [2] – [4], [14]. Tais estudos são promissores, mas ainda não resultaram em aplicações clínicas confiáveis. Grande esforço ainda é necessária para melhorar vários aspectos fundamentais desta abordagem, incluindo a eficácia terapêutica, a especificidade, segurança e complexidade técnica. NIS pode ser expresso em vários tecidos não-tiróide normais, embora a um nível baixo, incluindo, por exemplo, salivares, lacrimais, mama, estômago, intestino, tecido de pulmão, e rim [15] – [19]. expressão de baixo nível de NIS também foi relatado em alguns tipos de câncer não-tireóide, tais como carcinoma da mama [20]. Recentemente, demonstrou que a supressão da quinase MAP e vias de PI3K /Akt poderia induzir a expressão de NIS e captação de radioiodo nas células de melanoma [21]. Dado o sinergismo na indução de forma robusta a expressão do gene da tireóide e captação de iodo radioativo em células de cancro da tiróide inibindo simultaneamente HDAC eo MAP quinase e vias de PI3K /Akt [13], no presente estudo, nós testamos o potencial desta nova estratégia terapêutica para induzir a expressão NIS para captação de iodo radioativo em um painel alargado de células cancerosas não-tireóide.

resultados

a indução da expressão do gene NIS em células de câncer de tireóide não-suprimindo a quinase MAP e PI3K /AKT e HDAC

Foram testados os efeitos do inibidor MEK RDEA119, o perifosina inibidor da Akt, e o inibidor de HDAC SAHA na expressão do

gene NIS

em 13 células de cancro humanas (Tabela 1). Estas células de melanoma incluídos e células epiteliais de carcinoma derivadas de carcinoma hepatocelular, carcinoma gástrico, carcinoma do cólon, da mama e do cancro, bem como de células de glioblastoma T98G e células de astrocitoma SNB-78. Para demonstrar os efeitos de drogas específicas dos três inibidores nestas células, que primeiro testados os seus efeitos sobre as suas moléculas alvo nas vias de sinalização. Como mostrado na Fig. 1, após 30 horas de tratamento, RDEA119 em 0.5 uM e perifosina em 5 uM poderia inibem significativamente a fosforilação de ERK (p-ERK) e a fosforilação de AKT (p-AKT), respectivamente, em praticamente todas as células, excepto para o celular SNB-78. SAHA a 0,5 uM durante 30 horas poderia aumentar drasticamente a acetilação de histona H3 nestas células, excepto para algumas células, tais como T98G e SNB78, em que não havia nenhuma ou apenas um pequeno aumento na acetilação da histona. Estes resultados, em geral, demonstraram os efeitos esperados alvo destes inibidores.

O RDEA119 MEK inibidor, a perifosine inibidor da Akt, e o inibidor HDAC SAHA foram usadas para direcionar respectivamente destas vias ou moléculas de sinalização. As células foram tratadas durante 30 horas com 0,5 | iM RDEA119, perifosina 5 uM ou 0,5 uM SAHA como indicado. DMSO ou PBS foi utilizado em paralelo, como o controlo de veículo. As células foram lisadas por transferência de Western após os tratamentos para revelar os níveis de ERK fosforilada (p-ERK), Akt fosforilada (P-Akt), e histona acetilada (Ac-His) com anticorpos específicos. “+”, O tratamento com o inibidor indicado; “-“. Tratamento, com o veículo

Nós posteriormente testou os efeitos dos três inibidores a estas concentrações, individualmente ou em combinações, sobre a expressão do

NIS

do gene nas células 13 usando quantitativa PCR em tempo real. Como mostrado na Tabela 1,

NIS

expressão foi aumentado em graus diferentes em todas as células, excepto para as duas células de cancro não-epiteliais e T98G SNB78 que não tiveram qualquer resposta a estes tratamentos com medicamentos. A expressão

NIS

induzida foi mais robusta na de células de melanoma M14, a célula de hepatocarcinoma HepG2, e a célula de carcinoma gástrico MKN-7, que foram utilizados para estudos adicionais tal como apresentados nas secções seguintes. Individualmente, RDEA119 e perifosine cada um tinha um efeito menor e SAHA exibidos os efeitos mais pronunciados na expressão de

NIS

. Um efeito sinérgico foi observado quando o inibidor de MEK ou o inibidor da Akt foi cada uma delas combinada com SAHA e os efeitos sinérgicos foram ainda mais robusto, quando as três drogas foram combinadas, com uma excepção que em células HepG2 perifosina não aumentar ainda mais o efeito robusto de SAHA .

Após a demonstração de expressão de mRNA de NIS quantitativa PCR em tempo real em células de melanoma e de carcinoma epitelial, o próximo procurado para examinar a expressão de NIS ao nível da proteína nestas células, utilizando o celular de melanoma M14 , hepatocarcinoma HepG2 célula, e de células de carcinoma gástrico MKN-7 como representantes que exibiu a expressão mais robusta de NIS (Tabela 1). Como mostrado na Fig. 2, o tratamento combinado de células com estes RDEA119, perifosina SAHA e aumentou significativamente a expressão da proteína NIS como detectado por Western blotting. Em comparação com células M14 e HepG2, MKN-7 células exibido um modesto aumento na expressão de proteína NIS em resposta ao tratamento de combinação com os três inibidores, que foi semelhante ao padrão de expressão de ARNm de NIS nestas células sob estas condições de tratamento de drogas (Tabela 1). Assim, a supressão da quinase MAP e PI3K /Akt e vias de HDAC pode induzir a expressão robusta de NIS nestas células tanto nos níveis transcricionais e translacionais.

As células foram tratadas durante 30 horas com o uso da combinação RDEA119, perifosina, e SAHA nas concentrações descritas na Fig. 1, seguido por análise de transferência de Western de lisados ​​de células padrão usando o anticorpo primário específico contra NIS. O nível de expressão de ß-actina foi analisado em paralelo para controlo de qualidade. “Controlar”, o tratamento de células com o veículo; “R + P + S”, o tratamento de células com o uso combinado de RDEA119, perifosine e SAHA.

captação radioiodide celular induzida por suprimir a quinase MAP e PI3K /Akt percursos e HDAC

com a demonstração de expressão NIS robusta em células cancerosas não tiróide através da supressão da quinase MAP e as vias PI3K /Akt e HDAC, utilizou-se M14, HepG2 e MKN-7 células para testar a relevância funcional final desta descoberta através da análise do capacidade destas células para tomar-se iodeto radioactivo após a indução de NIS. Como mostrado na Fig. 3, a absorção de iodeto radioactivo foi claramente induzida nessas células pelo tratamento combinado com RDEA119, perifosina e SAHA. Entre as três células, marcadas captação de iodeto radioactivo foi particularmente visto na célula M14, consistente com a descoberta de que a expressão do NIS em ambos os níveis de mRNA e proteína foi mais robusta nesta célula.

As células foram tratadas com RDEA119, e perifosina SAHA como descrito na Fig. 2, seguido por incubação com Na

125I durante 1 h. células paralelas foram adicionalmente tratados com o NIS bloqueador NaClO

4 para obter captação de iodo radioativo não específica /ligação com as células. As células foram então lavadas, lisadas, e medido por radioactividade. captação de radioiodo celular é apresentada em cpm /10

6 células (no eixo dos Y da figura) após correcção para as radioiodo a ligação não específica. procedimentos experimentais detalhados são como descrito nos Materiais e Métodos. “Controlar”, o tratamento de células com o veículo; “R + P + S”, o tratamento de células com utilização de combinação RDEA119, perifosina e SAHA. ** Em comparação com o controlo, p . 0,01

O aumento da acetilação das histonas do promotor NIS através da supressão da quinase MAP e PI3K /Akt percursos e HDAC

acetilação de histona na região promotora promove a expressão do gene [22]. Para explorar se este era um mecanismo envolvido na expressão de NIS induzido pelos tratamentos com drogas em células de cancro da tiróide não no presente estudo, o próximo realizada análise ChIP de acetilação das histonas no promotor NIS. Foram examinados três diferentes regiões do promotor NIS para histona H3 e H4 acetilação em M14, HepG2 e células MKN-7. Estas regiões representam o promotor NIS essencial mínimo [23]. Descobrimos que a acetilação da histona nestas regiões do promotor de NIS foi aumentada para vários níveis de tratamento com SAHA nestas células (Fig. 4a-c). O tratamento de combinação com a quinase MAP e PI3K /Akt e vias inibidores de HDAC aumentou ainda mais a acetilação das histonas no promotor NIS. Em geral, este acetilação das histonas foi observada em ambos H3 e H4 nos três células, excepto para as células MKN-7 em que nenhuma alteração significativa foi observada acetilação em H3 (Fig. 4c). Todas as três regiões do promotor NIS essencial mínimo exibido acetilação das histonas com excepção para a região de P1 em células M14 que não mostrou nenhuma mudança no acetilação de H3 depois de tratamentos com drogas (Fig. 4a). Até cerca de 50 dobras de aumento da acetilação de histona H4 em a região de P2 do promotor NIS em células M14 (Fig. 4a) e cerca de 20 dobras de aumento da acetilação de histona H4 em a região de P1 em células HepG2 (Fig. 4b) foram observado. Estes dados sugerem que a acetilação das histonas é um mecanismo envolvido na expressão NIS induzida por supressão da quinase MAP e vias de PI3K /Akt e HDAC nestas células de cancro não-tiróide. células M14 mostrou a acetilação das histonas mais robusto no promotor NIS e segunda maior em células HepG2. células MKN-7 apresentada uma acetilação das histonas relativamente modesto no promotor NIS. É interessante notar que este padrão da medida de acetilação da histona, em três células de eco assim os padrões de a extensão da expressão do NIS (Tabela 1, Fig. 2) e a captação de radioiodo (Fig. 3) nestas células, apoiando ainda mais um papel importante de acetilação da histona na expressão NIS induzida por segmentação da quinase MAP e vias de PI3K /Akt e HDAC. Isto não parece ser aplicável para a célula T98G que mostrou alguma acetilação da histona sob o tratamento com SAHA (Fig. 1), enquanto que não houve um aumento na expressão de NIS nesta célula (Tabela 1). No entanto, este nível de acetilação da histona era mínimo em comparação com o que em muitas outras células (Fig. 1). Por conseguinte, a correlação da expressão do NIS com a acetilação de histona foi global clara em várias células testadas.

As células foram tratadas com SAHA sozinho ou em combinação com SAHA RDEA119 e perifosina como descrito na Fig. 2. Níveis de acetilação das histonas com as três regiões (P1, P2, e P3) que compreendem o promotor essencial mínimo do gene de

NIS

foram analisados ​​por análise de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) como descrito em Materiais e Métodos. A acetilação do estado tanto histona H3 e H4 foi examinada utilizando anticorpos específicos para o chip. anticorpos IgG não específicos foram utilizados como controle. Os resultados para M14, HepG2 e células MKN-7 são apresentados nas Figs. 4a, 4b e 4c, respectivamente. Para cada célula, o painel superior mostra os resultados reais da PCR sobre os fragmentos de ADN obtidos por chip, utilizando anticorpo (Anti-Ac-H3) H3 IgG de controlo não específico, anti-acetilado ou anticorpo anti-acetilado H4 (Anti Ac-H4) . quantidades idênticas de lisados ​​de células pré-imunoprecipitação a partir de diferentes condições de tratamento foram utilizados para iniciar a imunoprecipitação. Uma alíquota de lisado de células pré-imunoprecipitação foi directamente usada para isolar o DNA de controlo “de entrada”. Os resultados da PCR refletir os níveis de acetilação das histonas. Apresentado no painel inferior de cada célula é um gráfico de barras que mostra quantitativamente os níveis de acetilação de H3 e H4 em três regiões de

NIS

promotor com base nas medições densitométricas do painel superior. Os resultados são normalizados através da divisão dos sinais de entrada correspondentes e são apresentadas como a razão entre o tratamento indicado em relação ao controlo. “Controlar”, o tratamento de células com o veículo; “SAHA”, o tratamento de células com SAHA sozinho; “R + P + S”, o tratamento de células com o uso combinado de RDEA119, perifosine e SAHA.

Discussão

Radioiodine ablação e terapia adjuvante são tratamentos clássicos e padrão para câncer de tireóide , o que tira proveito da função única para transporte de iodeto de NIS na membrana celular da tiróide. Dado o facto de NIS também é normalmente expressa, em graus diferentes, em vários tecidos não-tireóide, no presente estudo, nós testamos

NIS

captação de expressão e com iodo radioactivo nas células cancerígenas derivadas de tecidos não-tireóide, suprimindo simultaneamente o MAP quinase e as vias de PI3K /Akt e HDAC. Embora o papel das MAP-cinase e da via PI3K /Akt vias na expressão de NIS foi investigada em pacientes com melanoma nos nossos estudos anteriores [21], o papel de HDAC e acetilação de histona na expressão de

NIS

no melanoma não possui foi investigada. Estamos, portanto, também incluiu células de melanoma no presente estudo.

Nós fomos capazes de induzir a expressão do NIS, em graus diferentes, em células de melanoma e hepática, gástrico, células do cólon e do carcinoma da mama, mas não em não-epitelial células do tumor cerebral derivado, o que sugere que esta expressão indutível NIS pode ser restrita às células de cancro da pele e células cancerosas de origem celular epitelial. Este é curiosamente consistente com o padrão de distribuição da captação fisiológica de radioiodine nos tecidos da pele (fase de recuperação de queimadura), fígado, estômago, cólon e mama (fase de lactação) sobre o exame do corpo de pacientes com câncer de tireóide após o tratamento com iodo radioactivo [24 ] – [27]. Notavelmente, também demonstrou captação de iodo radioativo após a indução da expressão de NIS, consistente com a funcionalidade NIS nestas células cancerosas não-tireóide. Nossos dados também, pela primeira vez mostrou que o aumento da acetilação das histonas no

NIS

promotor foi um importante mecanismo envolvido na expressão de NIS nestas células cancerosas não-tireóide.

induzida por inibidores HDAC expressão NIS foi anteriormente demonstrada em células Hela e, tal como no mesmo estudo, em células HepG2 [28]. Para dar mais um passo, demonstramos recentemente um efeito sinérgico da SAHA inibidor de HDAC em expressão NIS induzida por supressão da quinase MAP e PI3K /vias de Akt em células de cancro da tiróide, embora, neste estudo, a acetilação de histona não foi examinado [13]. No presente estudo, nós, pela primeira vez demonstrado que a supressão directa da cinase MAP e PI3K /Akt vias melhorado acetilação de histona na

NIS

promotor como um mecanismo para a expressão de NIS induzida por segmentação simultaneamente os dois e vias de HDAC em células cancerosas humanas.

demonstração da expressão do NIS em ambos os níveis de mRNA e proteínas, bem como a absorção de iodeto radioactivo nestas células estabelecidas o significado funcional da expressão indutível do gene

NIS nessas células cancerosas não-tireóide. O nível da expressão do NIS induzida variou entre as células testadas, com células de melanoma M14, de células de carcinoma hepático HepG2, e de células de carcinoma gástrico MKN-7, que mostra a expressão mais robusta de NIS, sugerindo que a expressão de NIS e absorção de iodo radioactivo pode ser induzida, preferencialmente, em determinada casos específicos destes cancros por razões pouco claras. provavelmente existem factores adicionais que determinar a indutibilidade da expressão da NIS nestas células de cancro, tal como exemplificado pelo estado do receptor de estrogénio que determina a capacidade de indução da expressão do NIS por todo-trans ácido retinóico em células de cancro da mama [29]. Os resultados do presente estudo têm importantes implicações clínicas. Melanoma, carcinoma hepático e carcinoma gástrico são cancros humanos comuns, todos com altas taxas de mortalidade, particularmente em metastático e casos avançados. Como os últimos casos são geralmente cirurgicamente inoperável, estão actualmente a necessidade urgente de novos tratamentos médicos eficazes. Com a capacidade de indução da expressão de NIS e captação de iodo radioativo nestas células cancerosas demonstrados no presente estudo, pode ser possível tratar estes cancros usando radioiodine adjunto como no tratamento de câncer de tireóide. O facto de a expressão induzida NIS foi particularmente robusto em algumas linhas de células, mas não outros derivados destes cancros sugere que este tratamento com iodo radioactivo pode ser eficaz num subgrupo de pacientes com estes cancros.

Os agentes terapêuticos de segmentação principais vias de sinalização, tais como inibidores de MEK e BRAF para a via da MAP-cinase e inibidores de mTOR e de Akt para a via PI3K /Akt, bem como inibidores de HDAC, estão actualmente a ser desenvolvido clinicamente activa [30] – [33]. Muitos deles têm demonstrado um forte potencial terapêutico em vários cancros humanos e alguns têm sido aprovados para uso clínico. Por conseguinte, é clinicamente possível a utilização destes inibidores para atingir a quinase MAP e vias de PI3K /Akt e alguns deles em combinação para suprimir duplamente as duas vias para induzir a expressão do NIS. O inibidor HDAC SAHA, que também tem sido aprovado para o tratamento de certos tipos de cancro [34], podem ser incluídos nesta terapia de combinação de fármacos para aumentar a expressão do NIS por tratamento com iodo radioactivo de cancros. À medida que estas drogas são eles próprios terapêutico por inibir directamente o crescimento de células de cancro, a sua utilização em conjunto com o uso do RI para matar mais células cancerosas poderia fazer o tratamento de uma quimioterapia ainda mais eficaz. Isto pode revelar-se uma nova estratégia terapêutica e particularmente eficaz para o melanoma e carcinomas do sistema hepático e gastrointestinal. Esta estratégia tecnicamente fácil de usar drogas clinicamente comprovada para induzir a expressão NIS e captação de iodo radioativo em células cancerosas não tireoidianas, se confirmado para ser eficaz em estudos futuros, pode vir a ser superior à expressão NIS alcançada por transferência de genes se aproxima, pois ele pode evitar certas segurança, especificidade, eficácia e questões de complexidade técnica associadas à transferência de genes amplamente investigado plasmídeos ou mediada por vírus alvo de órgão NIS [4], [14].

Curiosamente, estudos anteriores demonstraram uma expressão basal de genes da tiróide em células da pele e células de melanoma [35], [36]. Isso fornece uma base para a expressão induzida de forma robusta de genes de tireóide e captação de iodo radioativo em células de melanoma, visando a quinase MAP e as vias PI3K /Akt e HDAC em nossos estudos actuais e anteriores [21]. Também é possível, mas continua a ser investigado que um baixo estado de expressão basal de genes da tiróide semelhante existe em carcinomas hepáticos e gástricas e outros tipos de câncer analisados ​​no presente estudo, que torna-se robustamente ativa mediante a supressão das principais vias de sinalização.

em resumo, o presente estudo, pela primeira vez demonstra a expressão NIS robusto e captação de iodo radioativo em várias células cancerosas não tireoidianas, visando, simultaneamente, a quinase MAP e as vias PI3K /Akt e HDAC usando seus inibidores. Como muitos destes inibidores de já ter sido provado ser clinicamente viável e promissora na inibição de vários cancros, a sua utilização também para induzir a expressão do NIS para o tratamento adjuvante do radioiodo para além da sua inibição directa das células cancerosas podem revelar-se um processo novo e estratégia terapêutica eficaz para os cancros da tiróide não-selecionados.

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro humano

Treze linhas celulares de cancro humanos foram utilizados neste estudo, incluindo células de melanoma M14, UACC- 62 e A375; células de carcinoma hepático HepG2 e SK-Hep-1; células de carcinoma gástrico e MKN-7 NUGC-4; células de carcinoma do cólon HT-29 e RKO; células de carcinoma da mama BT-20 e células MDA-MB-231; celular de glioblastoma T98G; e células astrocitoma SNB-78. Estas células foram da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e NCI-Frederick Câncer DCTD linha de tumor /Cell Repository (Frederick, MD). M14, UACC-62, MKN-7, NUGC-4 e SNB-78 as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). RKO, BT-20, MDA-MB-231, HepG2, células SK-Hep-1, e T98G foram cultivadas em Eagle Meio Essencial Mínimo (ATCC, Manassas, VA) com soro bovino fetal a 10%. As células HT-29 foram cultivadas em meio 5a de McCoy (ATCC, Manassas, VA) com 10% de soro fetal de bovino. As células A375 foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (ATCC, Manassas, VA) com soro bovino fetal a 10%. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2.

Sob estas condições de cultura, as células foram tratadas, quando indicado, com o RDEA119 inibidor da MEK, a perifosina inibidor da Akt, e a HDAC inibidor SAHA individualmente ou em combinações. DMSO e PBS foram usados ​​em paralelo como controlo do veículo.

Western blotting

As células foram lisadas em tampão RIPA, com inibidores de protease padrão (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e Western blotting padrão As análises foram realizadas como descrito anteriormente [37], utilizando anticorpos primários, incluindo anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-Akt, anti-Ac-Histona H3, ou anti-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-Ac-histona H4 (Cell Signaling, Danvers, MA); ou anticorpos anti-NIS (Millipore Corp., Billerica, MA).

extracção de ARN e quantitativa PCR em tempo real

Depois de 30 h de tratamento das células com os inibidores indicados, o ARN total foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. Três ug de RNA total foram sujeitos a transcrição reversa utilizando iniciadores oligo-dT e sobrescritos III TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Quantitative PCR em tempo real foi pré-formado para analisar a expressão do

NIS

gene utilizando SYBR Green Supermix iTaq com ROX (Bio-Rad, Hercules, CA) num sistema de PCR ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). p-actina foi executado em paralelo para padronizar o cDNA de entrada. Os iniciadores concebidos para

NIS

e

genes

beta-actina e os métodos utilizados para calcular os níveis de expressão relativa de

NIS

foram como descrito anteriormente [13].

Radioactive captação de iodeto de ensaio

O ensaio de incorporação de iodeto radioactivos foi realizada como descrito anteriormente [13]. Resumidamente, após um tratamento de 30 h com os inibidores indicados, as células foram incubadas com 1 uCi de Na

125I e 5 uM não radioactivo Nal em 2 ml de meio em placas de 6 poços a 37 ° C durante 1 h. Para determinar a absorção específica NIS-, as células em paralelo de forma semelhante tratados com os inibidores foram adicionalmente tratadas com 200 uM de NaClO

4 durante 30 min antes de Na

125I tratamento. O meio foi aspirado e as células foram rapidamente lavadas três vezes com solução salina equilibrada de Hank (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As células foram então tripsinizadas e foram lisadas com 1 ml de NaOH 0,33 M. placas paralelas de células identicamente tratados com os inibidores, mas sem incubação com iodo radioactivo foram usadas para determinar o número de células no final da experiência. A radioactividade associada com as células foi contada com um contador gama e apresentados como cpm /10

6 células após correcção para a ligação não-específica iodeto radioactivo das células na presença de NaClO

4.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) ensaio

ensaio ChIP foi realizada utilizando o EZ-Magna ChIP Um kit (Millipore Corp., Billerica, MA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, após tratamentos com drogas, 1 × 10

7 células foram reticuladas com formaldeído a 37% durante 10 min, seguido por incubação com a solução de glicina fornecida no kit durante 5 min. Após 2 lavagens com PBS, as células foram lisadas e sonicadas 12 vezes durante 10 segundos na potência de impulso de 20% utilizando o Cell Disrupter Sonicador Modelo Micros-150D (Branson, Danbury, CT). A proteína /ADN reticulado foi subsequentemente incubada durante a noite com anti-histona H3 acetilada, anticorpos anti-histona H4 acetilada ou IgG de controlo não específico, e purificado utilizando pérolas de proteína A. Depois de lavar com os tampões no kit na ordem de acordo com o protocolo, grânulos fornecidas com proteína A proteína /complexos de ADN foram incubadas com proteinase K a 62 ° C durante 2 horas com agitação. Os fragmentos de ADN foram separados por centrifugação e subsequentemente purificada utilizando colunas de centrifugação. Três pares de iniciadores que abrangem a área de mínimo essencial promotor do gene NIS foram usadas na análise, como descrito anteriormente [23]. De ponto de extremidade normalizada de PCR foi realizada como se segue: após 3 min de desnaturação a 95 ° C, a mistura de reacção foi realizada durante 32 ciclos a 94 ° C, 60 ° C e 72C ° cada um durante 30 segundos, seguido por um alongamento à 72 ° C durante 8 minutos (para todos os três pares de primers).

Análise estatística

Os dados aqui apresentados são representantes de pelo menos duas experiências semelhantes realizados em duplicados ou triplicados. As diferenças entre os grupos foram analisadas pelo

t

teste e um

P

valor menor que 0,05 foi considerado significativo.