Abstract
O genoma é organizado e embalado para o núcleo através de interacções com as proteínas do núcleo de histonas. Emergentes evidência sugere que os tumores são altamente sensíveis às alterações epigenéticas que induzem eventos baseados em cromatina e influenciam de forma dinâmica o comportamento tumoral. Examinamos organização da cromatina na cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP), utilizando os níveis de acetilação de histona 3 como um marcador de compactação da cromatina. Em relação ao controle queratinócitos orais, descobrimos que as células CECP estão hypoacetylated e que sugestões microambiente (por exemplo, microvasculatura células endoteliais) induzem acetilação tumor. Além disso, verificou-se que a inibição química da histona desacetilases (HDAC) reduz o número de células-tronco cancerosas (CSC) e inibe a formação de esfera clonogênica. Paradoxalmente, a inibição de HDAC também induziu transição epitelial-mesenquimal (EMT) em células CECP, acumulação de IMC-1, um oncogene relacionado com a agressividade do tumor, e a expressão do marcador mesenquimais vimentina. Importante, observou-se a co-expressão de vimentina e histona acetilada 3 na frente da invasão de tecidos tumorais de carcinoma epidermóide humano. Colectivamente, estes resultados sugerem que os factores ambientais, tais como factores segregados por células endoteliais, modulam a plasticidade do tumor, limitando a população de CSC e induzindo EMT. Portanto, a inibição de HDAC pode constituir uma nova estratégia para interromper a população de CSC em tumores da cabeça e do pescoço para criar uma população homogénea de células cancerosas com assinaturas biologicamente definidos e comportamento previsível
citação:. Giudice FS, Pinto DS Jr, nem JE, Squarize CH, Castilho RM (2013) Inibição da histona deacetilase Cancer Impactos Stem Cells e induz epitelial-Mesênquima Transição de Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 8 (3): e58672. doi: 10.1371 /journal.pone.0058672
editor: Irene Söderhäll, Universidade de Uppsala, Suécia
Recebido: 06 de novembro de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 20 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Giudice et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH /NCI) P50-CA97248 (University of Michigan Cabeça e Pescoço SPORE); e pela concessão R01-DE21139 do NIH /NIDCR (JEN). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Entre os tumores malignos de cabeça e pescoço, cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) é a neoplasia epitelial mais comuns e é uma das seis doenças malignas mais comuns em todo o mundo [1]. HNSCC é caracterizada por lesões na cavidade oral, laringe, faringe e. Apesar dos esforços para desenvolver biomarcadores para a detecção precoce e prognóstico, a sobrevida de pacientes com CECP não melhorou significativamente [2]. O desenvolvimento de novas terapias que melhoram a sobrevivência e qualidade de vida de pacientes com CECP é urgentemente necessário.
O início e progressão do câncer é controlada principalmente por eventos genéticos e epigenéticos que influenciam a expressão do gene [3]. alterações Epigenetic pode regular a expressão do gene independentemente de mutações genómicas. alternâncias epigenéticas são comumente observados após a metilação do DNA e histonas modificação [4], [5]. As histonas pode ser modificado após a tradução através de acetilação lisina e ubiquitinação, fosforilação da serina, sumoilação, e metilação de lisinas e argininas [6]. histona acetiltransferase (HAT) catalisam a transferência de um grupo acetilo a partir de acetil-Co-A para o local do e-amino de lisina, o que resulta na descondensação da cromatina. Em contraste, histona desacetilases (HDAC) agir em resíduos de lisina a cromatina compacta e reprimir a transcrição de genes [7], [8]. Curiosamente, o efeito de HDAC na organização da cromatina também está associada com a regulação e manutenção da pluripotência de células estaminais em coordenação com numerosas vias de sinalização [9], [10]. No entanto, a condensação da cromatina também está associada com quimiorresistência em tumores [11] – [14]. Este fenótipo é parcialmente atribuída a células especializadas que reactivar haste programas de transcrição semelhantes a células [15]. Estas células estaminais cancro (CSC) são caracterizados por uma elevada taxa proliferativa, comportamento agressivo, o potencial metastático, e a capacidade de se auto-renovar [16] – [25]. CSC são alvos terapêuticos importantes para o cancro [26], e os benefícios clínicos de alvejar diretamente CSC está sob investigação. Quisemos determinar se interferir com a condensação da cromatina, conhecida por desempenhar um papel fundamental na manutenção de células estaminais normais [9], [10], que influenciam o comportamento do tumor e o conteúdo CSC. Observou-se cromatina hypoacetylated num painel de linhas celulares derivadas de CECP e identificada uma população distinta de CSC nestas células. Estas observações levaram-nos a perguntar se cromatina acetilação dita o comportamento biológico dos tumores e se a interferência farmacológica com HDAC altera o comportamento CSC. Descobrimos que a inibição de HDAC perturba o acúmulo de CSC e, paradoxalmente, induz as células tumorais se submeter a transição epitelial-mesenquimal (EMT).
Materiais e Métodos
linhas de células e condições de cultura
usadas linhas de células de carcinoma epidermóide gerados a partir da remoção cirúrgica dos tumores primários localizados na língua (HN6, HN13 e Cal 27), faringe (HN30), da laringe (Hep2) e derivados de um tumor língua que metastizado para os nódulos linfáticos (HN12 ) [27], [28]. queratinócitos espontaneamente imortalizada linha de células oral normal (NOK-SI) foi previamente estabelecida e gentilmente cedido pelo Dr. Gutkind do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (NIDCR /NIH) [29]. A linha celular de fibroblastos normais NIH /3T3 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, EUA) e cultivadas utilizando DMEM (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) suplementado com soro de vitelo de bovino a 10% ( Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 250 ng de B /mL de anfotericina (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). As células foram mantidas numa incubadora humidificada de 5% CO2. células endoteliais primárias humanas microvasculares dérmicas. (HDMEC; Lonza, Walkersville, MD, EUA) foram preparadas em meio basal endotelial sem soro (Lonza, Walkersville, MD, EUA)
Western blot
As células tumorais foram lisadas com tampão de lise de células contendo inibidores de protease e sonicadas brevemente. A proteína total foi resolvido sobre uma electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de 10-15% e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilo Immobilon-FL (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas em leite seco magro a 5% contendo 0,1 M de Tris (pH 7,5), 0,9% de NaCl e 0,05% de Tween-20 durante 1 hora à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com vimentina (clone V9, 1 500, Dako, Carpinteria, CA, EUA), IMC-1 (1 500, Millipore, Billerica, MA, EUA), Acetil-Histona H3 Lys9 (1 1500, Cell Signaling, Danvers , MA, EUA) ou acetil-Histona H4 Lys 5, 8, 12 e 16 (1 2000, Merck, Billerica, MA, EUA) anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. As membranas foram depois incubadas com anticorpos secundários conjugados apropriados para a peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology, Sta. Cruz, CA, EUA) durante 2 horas à temperatura ambiente. O sinal foi desenvolvido utilizando o ECL SuperSignal West Pico Substrato (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA), e as proteínas foram visualizadas utilizando a máquina UVP (BioSpectrum Imaging System). GAPDH serviu como um controlo de carga (1:20.000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, EUA).
FACS de cabeça e pescoço CSC
células semelhantes a células-tronco de cabeça e pescoço cancro foram identificados por separação de células para a actividade de ALDH (aldeído desidrogenase). O kit Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante para identificar as células com actividade enzimática elevada ALDH. Resumidamente, as células HN6 e HN13 foram tratadas com 300 nM de Tricostatina A (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA) durante 24 horas e suspendeu-se com substrato activado Aldefluor (BODIPY-aminoacetato) ou um controlo negativo (dietilaminobenzaldeído, um específico inibidor da ALDH) durante 45 minutos a 37 ° C. As amostras foram analisadas no Classificador FACSDiVA celular (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA).
celular invasão ensaio
HN6 e células HN13 (5 × 10
4) foram semeadas em placas de 24 poços através de uma fina camada homogénea de fibronectina (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) em Cultura de células Millicell inserções (Millipore, Billerica, MA, EUA) que continha membranas de filtro de policarbonato com poros de 8 ^ M de diâmetro. Determinou-se que o tempo óptimo de invasão de células tumorais CECP foi de 8 horas após a sementeira, como evidenciado pelo número substancial de células que invadiram a parte inferior da membrana filtro de policarbonato (~60-70% de células /área total) (Fig. S1). As células de tumor do grupo de controlo foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos, e o inibidor de HDAC grupo recebeu 300 nm de Tricostatina A (TSA), diluída em meio. A câmara inferior continha DMEM suplementado com 20% de FBS e 1% de antibióticos. Após o plaqueamento, as células foram incubadas durante 8 horas, com base no tempo óptimo invasão (Fig. S1), a 37 ° C numa incubadora humidificada de 5% CO2. células invasoras na câmara inferior foram corados com hematoxilina e eosina (H E). As imagens foram tiradas com uma câmera digital monocromática QImaging ExiAqua ligado a uma Nikon Eclipse 80i Microscope (Nikon, Melville, NY, EUA) e visualizada utilizando software QCapturePro.
incorporação IF-parafina, linhas IF-celular e anticorpos
biópsias de pacientes humanos foram embebidos em parafina, e as secções 3-um foram utilizadas para a coloração de imunofluorescência. Resumidamente, as secções foram incubadas com anticorpos primários durante a noite, lavaram-se com PBS, e incubadas com um anticorpo secundário conjugado com fluoresceína quer (Jackson ImmunoResearch Labs, 1: 100) ou rodamina (Jackson Immuno Research Labs 1: 100). As lâminas foram montadas com DAPI contendo meios de montagem (Vector Laboratories) e incubadas a 4 ° C durante a noite com vimentina (clone V9, 1: 500, Dako, Carpinteria, CA, EUA) e IMC-1 (1:500, Millipore, Billerica , MA, EUA) anticorpos. Para a análise de imunof luorescência, as células foram semeadas em lamelas de vidro e fixadas com metanol durante 6 minutos a -20 ° C. As células foram tratadas com TSA (300 nM) ou veículo durante 24 horas quando indicado e coradas para o Ki-67 (1:100, Dako, Carpinteria, CA, EUA), citoqueratina 14 (1:1000, Covance, 155P), e rodamina -phalloidin (1:150, citoesqueleto, Denver, CO, EUA). As células foram co-coradas com Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA) para a visualização do conteúdo de ADN. As imagens foram tiradas com uma câmera digital monocromática QImaging ExiAqua ligado a uma Nikon Eclipse 80i Microscope (Nikon, Melville, NY, EUA) e visualizadas com software QCapturePro.
Sphere ensaio
Para avaliar a capacidade de linhas de células tumorais a crescer em suspensão como esferas, HN6 e células HN13 (10
3) foram cultivadas em placas de fixação ultra-baixo (Corning; Nova Iorque, Nova Iorque, EUA) durante 5 dias. Veículo ou TSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA) foi adicionada ao meio de cultura a uma concentração final de 300 nM e cuidadosamente monitorizados durante 24 horas para determinar o efeito da hiper-acetilação na manutenção de CSC esferas.
a análise estatística
a análise estatística de invasão e taxa de proliferação de células tumorais foi analisada utilizando um teste t não pareado. Sphere quantificação ensaio de formação foi realizada pela análise de uma via de variância (ANOVA), seguido por testes de comparação múltipla de Tukey e Bonferroni. Avaliação da morfologia celular e expressão de vimentina foram analisados utilizando GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA). Os asteriscos indicam significância estatística (NS, P 0,05; * P 0,05; ** P 0,01; e *** P 0,001).
Resultados e Discussão
acetilação cromatina e comportamento celular de HNSCC
Para investigar o papel da cromatina remodelação no comportamento HNSCC, examinamos cromatina acetilação num painel de linhas celulares 6 CECP. Uma linha de células de mucosa oral espontaneamente imortalizada (NOK-Si) foi utilizada como um controlo [29]. proteínas histona desempenham papéis estruturais e funcionais em todos os processos nucleares e sofrem várias modificações [30], incluindo acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação, SUMOilação, e poli-ADP-ribosilação de regular a estrutura da cromatina e a expressão de genes [31]. A acetilação da histona H3, vulgarmente observada em Lys9, 14, 18, 23, 27, e 56, desempenha um papel na actividade de genes [32], [33]. Em particular, a acetilação de histona funcional 3 em Lys 9 tem sido extensivamente estudada e está associada à deposição de histona, a montagem da cromatina e activação de genes [34] – [36]. As células tumorais têm diferentes níveis de acetilação da histona 3 na lisina 9, que é um marcador de genes activos, [33] [32]. Todas as linhas de células de carcinoma epidermóide analisamos hipoacetilação exibido da cromatina em comparação com NOK-SI controlos (Fig. 1A), sugerindo HNSCC cromatina ter condensado sob condições de cultura de base. níveis reduzidos de acetilação da histona 3 na lisina 9 também foram relatados em tumores do pulmão e do esófago [37] – [39] e em 3D culturas de células de neuroblastoma e esferóides tumor derivado de células de melanoma [40] – [42]. As alterações na organização da cromatina desempenhar um papel em muitas doenças humanas, incluindo o cancro [43], onde eles são considerados um marcador de prognóstico valioso [44].
(A) análise de transferência de Western que mostra a hipoacetilação cromatina global HNSCC, quanto evidenciado por níveis baixos de expressão de Acetil-histona H3 Lys9 (Ac.H3) em relação ao controle queratinócitos orais normais (NOK-SI). (B) Imagens representativas e gráfico de barras de ensaios de invasão. HN6 mostram uma capacidade invasiva significativa em comparação com HN13 (*** p 0,001). Invasão foi determinada por contagem das células CECP na parte inferior da membrana (ver materiais e métodos para detalhes) em campos múltiplos (20x). (C) análise de transferência de Western que mostra os níveis de expressão elevados de vimentina endógena, um marcador canónica de EMT, em células HN6 mas não em células HN13. (D) A avaliação do marcador demonstra que ALDH CSC HN6 tem um elevado número de células ALDH +, soma a mais de 11% da população total de células de tumor. Cerca de 6% das células HN13 são ALDH +. (E) Exemplo representativo de holoclones (seta), meroclones (seta) e paraclones (asterisco) formados durante o ensaio clonogênica HN6. células tumorais HN13 formar principalmente holoclones indiferenciadas (seta). Quantificação de esferas revela o aumento da capacidade das células HN6 para gerar esferas comparação com HN13 (** p 0,01).
A seguir, examinou a agressividade das células CECP com baixos níveis de acetilação. células tumorais HN6, que são sensíveis à cisplatina invasividade (Almeida OA e Castilho RM, dados não publicados), visualizado melhorado (Fig 1B, *** p . 0,001) e alta expressão de vimentina endógena, um filamento intermediário frequentemente encontrado em agressivo maligna tumores epiteliais que são submetidos a transição epitelial-mesênquima (EMT) [45] – [47] (Figura 1C.). Em seguida, procurou-se caracterizar a existência de uma subpopulação de CSC conhecido para corroborar a iniciação do tumor, crescimento, metástase e [16] – [25] e está associada com o desenvolvimento de EMT [48] – [50]. Embora vários marcadores têm sido propostos para identificar a população CSC dentro cancros da cabeça e pescoço, os níveis de actividade da enzima desidrogenase aldeído (ALDH) é considerada como sendo um marcador altamente selectivo para o CSC e um biomarcador de células estaminais para várias células estaminais normais e cancerosas [51] – [54]. Invasiva HN6 ter uma apresentou um elevado número de células ALDH-positivas (ALDH +), soma a mais de que correspondeu a mais de 11% da população total (Fig. 1D_HN6). Em contraste com as células HN6, células HN13 não expressam vimentina, houve uma diminuição da capacidade de invasão, e apenas 6% da população total de células foi constituída por células de ALDH + interessante, células tumorais HN13 comportou-se diferencialmente quando comparado com as células HN6 que apresenta uma população de 6% de ALDH + células, ausência de expressão de vimentina, e reduzida capacidade invasiva (Fig. 1B, C, e D_HN13). Em um ensaio clonogênica, as células HN6 e HN13 formado 3 padrões diferentes esfera, identificados como holoclones, meroclones e paraclones, que estão diretamente associados com “stemness” Na sequência, o ensaio clonogênica de linhas celulares de cabeça e no pescoço exibida a formação de 3 padrões de esfera diferentes diretamente associado ao comportamento “stemness”, os holoclones, meroclones e paraclones [55] – [57]. Holoclones são caracterizados por bordas bem demarcadas e possuem o maior potencial de crescimento, assim, susceptível de ser composto por células-tronco indiferenciadas. Paraclones são caracterizados por um crescimento rápido, ainda, mas limitado a viabilidade celular. Meroclones situar-se entre os outros dois padrões de esfera e são caracterizadas por as duas CSC descrito anterior esferas padrões, pelo que apresentam colónias com perímetros enrugada e reforçada a viabilidade celular em comparação com paraclones [55]. Observou-se que as células tumorais HN6 invasivos gerado mais clones comparação com HN13. Notavelmente, as células formadoras de esfera de HN6 eram uma mistura de holoclones (Fig. 1E_arrow), meroclones (cabeça Fig. 1E_arrow) e paraclones (Fig. 1E_asterisk). No entanto, esferas HN13 continha apenas grandes holoclones e não meroclones ou paraclones (Fig. 1E_arrow), sugerindo uma população homogénea de CSC.
Em conjunto, nossos resultados sugerem que as células do cancro do pescoço e consistentemente manter a cromatina hypoacetylated apesar de sua agressiva comportamento. O aumento da condensação da cromatina está correlacionada com a resistência de tumores às quimioterapias [11] – [14], provavelmente devido a um influxo de moléculas interrompido de reparação do ADN para o núcleo e a apoptose auditivos [58]. Na verdade, a descondensação da cromatina é necessário para a reparação do ADN [59] – [62], em que os membros da maquinaria de reparação do ADN desempenham um papel na reorganização da cromatina através da cromatina em grande escala desdobramento [59], [63]. A presença de CFC, tal como detectado pela actividade enzimática da ALDH, em linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço humanos é interessante e demonstra a capacidade das células tumorais para manter uma população heterogénea. Notavelmente, verificou-se que células de tumor agressivo são compostas de uma população heterogénea de células formadoras de esfera composto de holoclones, meroclones e paraclones, e um grande número total de esferas (Fig 1E, ** p . 0,01). O padrão CSC heterogêneo não foi observado em células de tumor de cabeça e pescoço indolentes. Estes achados sugerem a coexistência de células tumorais com diferentes graus de “stemness” que representa tanto para a sua população CSC e invasão.
microambiente do tumor e inibidor HDAC modula acetilação cromatina e CSC conteúdo
Na sequência da nossa observações anteriores de que as células tumorais são encontrados hypoacetylated, decidimos procurar sinais ambientais que poderiam influenciar cromatina acetilação durante a invasão tumoral. Nós selecionamos as histonas ricos em arginina H3 e H4 como marcadores para acetilação cromatina com base em sua capacidade de organizar DNA dentro nucleossomos. Acetilada histonas H3 e H4 liberação supercoiled DNA de nucleossomos para fazer genes mais acessível [64]. Além disso, a acetilação das histonas H3 e H4 afeta estruturas de cromatina de alta ordem e faz ligação a DNA sites acessíveis a factores que actuam em trans [65], [66]. Foram tratados células tumorais com meio condicionado (CM) derivado de células endoteliais e fibroblastos, dois principais componentes do microambiente do tumor [67] – [69]. Embora fibroblastos representam o principal componente celular de derme e submucosa, CM a partir destas células não conseguiram induzir alterações na acetilação de histonas H3 (Ac. H3) e H4 (Ac. H4) (Fig. 2A_Fibroblast CM). No entanto, CM a partir de células endoteliais tinha um efeito pronunciado sobre a organização da cromatina do tumor (Fig 2A_Endothelial CM -.. Ac H3 e H4 Ac.). cromatina Curiosamente, em resposta ao CM a partir de células endoteliais, células HN6 exibida acetilado e aumento da expressão de vimentina, que é observada principalmente durante EMT [45] – [47]. IMC-1, um membro do complexo repressor Polycomb 1 que está envolvida na remodelação da cromatina e altamente expresso em células de cancro [70] – [72], foi regulado positivamente em HN6 em resposta a CM endoteliais (Fig 2A_ endotelial CM_HN6.). Surpreendentemente, CM endotelial induzida compactação da cromatina em células HN13 (Fig. 2A_ endotelial CM_HN13) de um modo semelhante ao processo de dois passos de corrente de repressão da transcrição mediada pela família de genes grupo Polycomb (PCG). Este processo influencia negativamente a acessibilidade DNA por fatores de transcrição e de remodelação, resultando na compactação da cromatina (revisado por Sparmann A,
et al
. [73]). A desacetilação de células HN13 não alterou IMC-1 e expressão de vimentina (Fig. 2_Endothelial CM). As discrepâncias entre o comportamento do tumor e a resposta da cromatina a alterações ambientais pode ser devida a mutações em membros da família PCG que causam o comportamento agressivo observado em HN6 tumores de células (Fig. 1B e C).
(A) análise de transferência de Western demonstra que o meio condicionado de fibroblastos (FCM-painel da esquerda) não modula acetilação cromatina (Ac. H3 e Ac. H4), IMC-1 ou vimentina níveis em linhas celulares de tumor. -Endotelial derivado meio condicionado (painel ECM-direita) influencia acetilação tumor como descrito por elevada Ac. H3 e Ac. níveis em células H4 HN6 e ablação de Ac. H3 e Ac. H4 níveis em células HN13. Note-se que, juntamente com Ac. H3 e Ac. H4, as células HN6 mostram aumentos menores nos níveis de IMC-1 e vimentina. proliferação (B) Tumor avaliada por Ki67 demonstra a reduzida proliferação após a administração de HDACi TSA (300 nM) durante 24 horas. (C) A administração de TSA (300 nM) durante 24 h reduz a população total de células na CSC HN6 e HN13, como evidenciado pela presença de células de ALDH +. (D) HDACi (TSA) interrompe holoclones tumorais tal como ilustrado na imagens representativas de esferas de tumor e pela quantificação de esferas (HN6 ** p 0,01, HN13 * p 0,05).
próxima determinar se o comportamento da cromatina acetilação sozinho influências cabeça e no pescoço. Utilizou-se o inibidor HDAC Trichostatin A (TSA) para induzir quimicamente cromatina acetilação. TSA inibe selectivamente as classes de HDAC I e II, que possuem atividade epigenética. Mais recentemente, a TSA também tem sido demonstrado que inibem não-histonas factores de transcrição e co-reguladores, incluindo p53, STAT, e NFkB [74], [75]. Depois de determinar a concentração óptima de TSA (300 nM) capaz de induzir cabeça e acetilação de células de cancro do pescoço (Fig S2.) [76] – [82], verificou-se que a inibição de HDAC auditivos directamente a proliferação de células CECP (Fig 2B. , HN6 * p 0,05, HN13 *** p 0,001). Observou-se também uma redução inesperada na fracção de CSC após tratamento com TSA (Fig. 2C_TSA), com uma redução de 7% nas células ALDH + isoladas a partir de HN6 e uma redução de aproximadamente 6% em células de ALDH + a partir de HN13 (Fig. 1D_Vehicle). Como um ensaio funcional, foi avaliada a influência da TSA sobre a formação clonogênica das esferas CSC. Usando placas ultra-baixas de adesão, que cultivaram células tumorais com baixo confluência durante 5 dias e observada até a formação de esferas bem definidas. Após a formação da esfera, TSA foi administrado, e as esferas foram acompanhados de perto. Surpreendentemente, a indução de acetilação cromatina provocou uma ruptura rápida e progressiva de esferas (figura 2D, HN6 ** p . 0,01, HN13 * p 0,05). Interrupção das esferas de tumor sugere que acetilação cromatina induzida por inibição de HDAC perturba os requisitos fisiológicos para manutenção CSC. Com efeito, a acetilação cromatina tem sido conhecido por induzir a diferenciação celular e restringir a transformação celular [83], [84]. Assim, os inibidores de HDAC (HDACi) pode ser uma nova estratégia terapêutica para prejudicar os efeitos deletérios do CSC. Estes resultados sugerem um processo dinâmico em que as células cancerígenas de cabeça e pescoço são altamente suscetíveis a mudanças epigenéticas orientadas para o ambiente, apoiando a noção de que a segmentação epigenética pode ser uma abordagem eficaz e valioso para a quimioterapia e quimioprevenção do câncer [4]. inibidores de HDAC (HDACi) são as drogas que alvejam enzimas específicas envolvidas na regulação epigenética da expressão gênica e são potencialmente uma nova classe de agentes anticancerígenos [4], [5], [7], [12], [85]. Embora HDACi são bem sucedidos no tratamento de doenças hematológicas malignas, a sua utilização em tumores sólidos permanece controverso [86], [87].
induzido quimicamente acetilação cromatina promove EMT em células de CECP
O efeito da HDACi em CSC nos levou a determinar se a administração da TSA iria alterar as características adicionais de cancro da cabeça e pescoço. Os tumores malignos derivados de células epiteliais (carcinomas) sofrem um processo conhecido como requintado EMT que precede a invasão e a progressão de células cancerosas [46], [88] – [91]. EMT é caracterizada pela perda de adesão celular, o aumento da motilidade, comportamento agressivo, e a aquisição de uma morfologia f ibroblastóide alongado e expressão de vimentina, um marcador canónica de EMT [45] – [47]. Notavelmente, células HN6 agressivos tinha a expressão constitutiva de vimentina (Fig. 1C) e uma aparência predominantemente paralelepípedos (Fig. 3A_Vehicle_HN6). A inibição farmacológica da HDAC células causada para alterar rapidamente a sua morfologia em forma de fuso e para aumentar a expressão de vimentina (Fig. 3A_ TSA_HN6). Além disso, a administração de TSA induzida morfologia do fuso e expressão de vimentina em células HN13 (Fig. 3A_ TSA_HN13) que normalmente não expressam este filamento intermediário (Fig. 1C_HN13_Vimentin). Não foram observadas alterações morfológicas induzidas pela TSA ou expressão de vimentina em células normais (Fig. 3A_NOK-SI), sugerindo que hiperacetilação da cromatina diferencialmente modula células normais e neoplásicas. Embora o número total de células HN6 expressam vimentina apenas marginalmente aumentada em resposta a TSA (Fig 3B_HN6, * p . 0,05), as células tumorais que apresentam a morfologia fibroblastóide foram em grande parte positiva para vimentina (Fig 3C_HN6, *** p . 0.001). A combinação da expressão de vimentina e morfologia f ibroblastóide foi também observada em células HN13 seguinte acetilação cromatina (Figura 3B e C_HN13 *** p . 0,001). Estes resultados sugerem um papel forte para descondensação cromatina durante a aquisição de um fenótipo de EMT em células de CECP.
A inibição da histona deacetilase induz a expressão de vimentina em células de CECP e aquisição da morfologia em forma de fuso. (A) Os exemplos representativos de mudanças morfológicas e expressão da citoqueratina 14 (CK14) marcador de células epiteliais e mesenquimais do marcador vimentina. Note-se que os queratinócitos normais expressam CK14 na presença de veículo ou TSA e morfologia das células é continuamente epitelióide (paralelepípedos ou aparência discóide). Tanto as células HN13 HN6 e expressar CK14 e uma forma epitelióide (A, veículo). A seguir ao tratamento de TSA, e HN13 HN6 expressar vimentina e tornar-se fusiformes. (B) gráficos representam a percentagem de células positivas para a vimentina seguintes TSA ou do tratamento com veículo. TSA-induzida resultados acetilação cromatina no aumento da expressão de vimentina no HN6 e células HN13 (* P 0,05 e *** p 0,001). (C) gráfica que representa a expressão de vimentina em células em forma de fuso (células tumorais com morfologia EMT-like). células HN6 e HN13 exibir aumentos significativos na expressão de vimentina após o tratamento TSA (*** p 0,001).
cromatina hiperacetilação aumenta a invasão e expressão da BMI-1 em cânceres de cabeça e pescoço
O
BMI-1