Abstract

Fundo

A metástase para os linfonodos regionais via vasos linfáticos desempenha um papel fundamental na progressão do cancro. linfangiogénese tumor é conhecida por promover metástases linfáticas, e factor de crescimento endotelial vascular C (VEGF-C) é um activador da linfangiogénese crítica do tumor durante o processo de metástase. Nós previamente identificados periostina como um fator invasion- e de promoção da angiogênese na cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP). Neste estudo, descobrimos um novo papel para periostina em lymphangiogenesis tumor.

métodos e resultados

periostina superexpressão upregulated expressão VEGF-C mRNA em células de CECP. Usando meios condicionados a partir de células CECP-superexpressão periostina, examinamos a formação do tubo de células endoteliais linfáticas. Os meios condicionados de células-superexpressão periostina promoveu a formação do tubo. Para saber a correlação entre periostina e VEGF-C, comparamos a expressão periostina com expressão VEGF-C em 54 casos CECP por imuno-histoquímica. expressão periostina se correlacionou bem com a expressão de VEGF-C em casos CECP. Além disso, foi observada uma correlação entre a secreção periostina e VEGF-C em soro de pacientes com CECP. Curiosamente, periostina si promoveu a formação do tubo de células endoteliais linfáticas independentemente do VEGF-C. lymphangiogenesis promoveu-periostina foi mediada por Src e atividade Akt. Observou-se, de facto possível correlação entre periostina e estado linfática em tumores de xenoenxerto periostina-superexpressão e casos de CECP.

Conclusões

Nossas descobertas sugerem que periostina em si, bem como a regulação positiva induzida por periostina de VEGF-C pode promover a linfangiogénese. Sugerimos que periostina pode ser um marcador para a predição de comportamentos malignos em CECP e um alvo potencial para uma futura intervenção terapêutica para obstruir invasão linfática tumoral e linfangiogênese em pacientes com CECP

Citation:. Kudo Y, Iizuka S, M Yoshida , Nguyen PT, Siriwardena ATCEC, Tsunematsu T, et al. (2012) periostina direta e indiretamente Promove Tumor Linfangiogênese de Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 7 (8): e44488. doi: 10.1371 /journal.pone.0044488

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 19 Abril, 2012; Aceito: 03 de agosto de 2012; Publicação: 30 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Kudo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid do Ministério da Educação, Ciência e Cultura do Japão (Y. Kudo e T. Takata), uma bolsa de Investigação para Jovens cientistas e as excelentes Jovens Pesquisadores Overseas Programa Visita da Sociedade Japonesa para a promoção da Ciência (S. Iizuka), e uma subvenção Kurozumi Memorial Foundation (Y. Kudo). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:. Autor Masahiro Maeda é empregado pelos Laboratórios Imuno-biológicos, Co., Ltd. Este não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Milhões de pessoas morrem a cada ano de câncer metastático. A metástase ocorre através dos vasos sanguíneos ou linfáticos ou directamente em tecidos e cavidades do corpo. Embora os mecanismos bioquímicos da metástase são mal compreendidos, o processo é pensado para ser sistemática aleatório, em vez de [1]. Os linfonodos regionais são muitas vezes os primeiros locais de disseminação, presumivelmente devido à drenagem das células tumorais através de vasos linfáticos pré-existentes aferentes e /ou capilares linfáticos recém formados [2], [3]. Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é um dos tipos mais comuns de câncer humano, com uma incidência anual de mais de 500.000 casos em todo o mundo [4]. A literatura sugere que a razão mais importante para a alta taxa de mortalidade é que a doença muitas vezes não é diagnosticada ou tratada até que tenha alcançado um estágio avançado. Apesar agressivos, abordagens de tratamento multidisciplinar, incluindo pré-operatório ou quimioterapia pós-operatória e /ou radioterapia com cirurgia reconstrutiva, a sobrevivência do CECP de 5 anos não melhorou significativamente ao longo dos últimos 20 anos [5]. Como a maioria dos outros cancros epiteliais, HNSCC desenvolve em um processo de várias etapas através da acumulação de múltiplas alterações genéticas e epigenéticas. O indicador de prognóstico mais importante para pacientes com CECP é metástase para os linfonodos cervicais ou órgãos distantes [6]. Nós previamente estabelecida uma linha de células de carcinoma epidermóide a partir de um nó de linfa metastático [7] e utilizado um

In vitro

ensaio de invasão para isolar um clone altamente invasivo a partir desta linha celular [8]. Em seguida, compararam os perfis de transcrição de células CECP-mãe e o clone altamente invasiva e por análise de microarray identificou periostina (factor específico-osteoblasto 2) como o gene mais diferencialmente expressos no clone invasiva [9]. Periostina é uma proteína secretada que tem sido sugerido para funcionar como uma molécula de adesão celular por pré-osteoblastos e a participar no recrutamento de osteoblastos, apego e espalhando [10], [11]. superexpressão periostina maior crescimento invasão e independente de ancoragem em células de CECP [9]. Interessantemente, as células que sobre-expressam periostina foram agressivamente invasiva e espontaneamente metástase para nódulos linfáticos cervicais e para o pulmão num modelo ortotópico de rato HNSCC [9]. Bao et ai. também demonstrou que uma linha de células do cancro do cólon com baixo potencial metastático exibido tumor notavelmente acelerado crescimento metastático em um modelo de xenotransplante animais de metástase quando projetados para superexpressão periostina [12]. Estes resultados indicam que a sobre-expressão pode ser periostina comum em vários tipos de cancro e que periostina pode ser importante para a invasão tumoral. Periostina foi anteriormente mostrado para estimular o crescimento metastático de induzir angiogénese [12], [13] e melhora a expressão do receptor de FCEV de Flk-1 /KDR em células endoteliais através de uma via de sinalização da integrina avp3-FAK-mediada [13]; Além disso, periostina recombinante aumenta a formação capilar

in vitro

[14]. Importante, estudos clínicos de expressão periostina em cancros humanos demonstraram que a expressão aumentada de periostina correlaciona-se com o número de vasos sanguíneos do tumor e a metástase [14]. Por outro lado, estudos de imuno-histoquímica anteriores mostraram uma possível correlação entre a expressão periostina e linfonodo metástases em casos de câncer [15]. No entanto, não existe nenhum estudo sobre o papel das periostina em linfangiogénese tumor. No presente estudo, demonstramos uma ação novela de periostina: a promoção direta e indireta de lymphangiogenesis tumor

Resultados

VEGF-C regulada pela superexpressão periostina promove a formação de tubos de células endoteliais linfáticas

periostina previamente identificado como um factor de promoção da invasão por comparação dos perfis das células-mãe (CECP MSCC-1) e um clone altamente invasiva (MSCC-INV1) [9] (Figura 1A) de expressão de genes. O VEGF-C também foi regulada no clone altamente invasiva por análise de microarray (Figura 1A). O aumento da expressão de VEGF-C em células MSCC-Inv1 em relação a células-mãe foi observado (Figura 1B). Além disso, na nossa análise de microarray anterior para comparar o perfil de expressão do gene entre as células que sobre-expressam CECP periostina e controlo, o VEGF-C foi regulada positivamente em células que sobre-expressam periostina [9]. Aqui confirmou-se que a sobre-expressão ectópica de periostina regulada positivamente a expressão de VEGF-C (Figura 1B). Ambos periostina e VEGF-C foi detectada no meio condicionado a partir de células que sobre-expressam periostina mas não as células de controlo (Figura 1B). VEGF-C é conhecida por ser um activador da linfangiogénese crítica do tumor durante o processo de metástase. Portanto, nós examinamos a formação do tubo de células endoteliais linfática através da adição de meios condicionados a partir de células transfectadas com vector vazio ou células-superexpressão periostina às células TR-LE. células TR-le foram previamente estabelecido como uma linha de rato imortalizada linfático células endoteliais [16]. O meio condicionado a partir de células que sobre-expressam periostina notavelmente promovida a formação de tubos por células TR-LE (Figura 1C e 1D).

(A) Esquema mostra a estratégia para identificar periostina e VEGF-C, comparando o perfil de expressão do gene entre o pai (células MSCC-1) e um clone altamente invasivo (células MSCC-Inv1). (B) maior expressão de ARNm de VEGF-C em células do clone altamente invasivo MSCC-INV1 e a expressão de VEGF-C em células que sobre-expressam periostina. HSC4 células sem expressão periostina foram transduzidas utilizando um plasmídeo que codifica periostina hexa-histidina marcada com retroviral. Periostina e os níveis de expressão de ARNm de VEGF-C em células MSCC-1, células MSCC-Inv1, células HSC4 transfectadas com vector vazio (vazio), e células que sobre-expressam HSC4 periostina (HIS-periostina) foram analisados ​​por RT-PCR. expressão de GAPDH foi usada como um controlo de carga. Os meios condicionados foram recolhidos a partir de células transfectadas com vector vazio HSC4 (vazio) e células que sobre-expressam HSC4 periostina (HIS-periostina), após incubação durante 4 dias. Os meios condicionados foram concentrados e analisados ​​por transferência de Western para a expressão de His-periostina e VEGF-C em meio condicionado. (C) O meio condicionado a partir de células que sobre-expressam periostina promove a formação de tubos de células endoteliais linfáticas. formação do tubo de células TR-le adicionando meios condicionados a partir de células-superexpressão periostina. células TR-Le foram semeadas em poços revestidos com Matrigel, na presença de meio condicionado a partir de células transfectadas com vector HSC4 (CM controlo) ou sobre-expressam periostina (CM periostina) vazios. Após incubação durante 0-9 h, foram avaliados os comprimentos das estruturas semelhantes a tubos formados. A figura mostra as células após incubação durante 9 h. (D) O gráfico mostra a pontuação tubo após 0-9 h de incubação de CM controlo ou CM periostina. As barras mostram os valores médios e desvios-padrão de 3 experiências independentes.

Para demonstrar o efeito da expressão induzida por periostina VEGF-C na formação do tubo, utilizou-se o receptor de VEGF 3 (VEGFR-3) inibidor de cinase MAZ51, que é relatado para bloquear tanto o VEGF-C e fosforilação de VEGFR-3 de VEGF-D-induzida em células PAE [17]. células TR-le é conhecida para expressar VEGFR-3 [16]. Confirmámos que MAZ51 marcadamente inibida a formação do tubo induzida por VEGF-C (Figura S2A e S2B). MAZ51 formação do tubo muito inibida induzida por meio condicionado a partir de células-superexpressão periostina (Figura S2A e S2B). Também foi observada a inibição da formação do tubo por MAZ51 em meio condicionado a partir de células transfectadas com vector vazio. Esta inibição pode ser explicada pela secreção de VEGF-C a partir próprias células endoteliais linfáticas. O efeito inibitório de MAZ51 foi baixa em células tratadas com meio condicionado derivado de células transfectadas com vector vazio (Figura S2C). Estes resultados indicam que periostina pode promover linfangiogênese através de regulação positiva do VEGF-C.

Correlação de expressão periostina com VEGF-C e estado linfática em casos de câncer clínicos

Para determinar a correlação entre periostina e VEGF Os níveis de expressão -C em casos de câncer clínicas, comparamos a expressão periostina com expressão VEGF-C em 54 casos CECP por análise de imuno-histoquímica. Definiu-se a classificação das periostina e coloração de VEGF-C como elevada (acima de 10% de células de tumor que mostra ++ ou +++ intensidade) ou baixo (sem coloração ou menos do que 10% de células de tumor que mostram intensidade +). Para o critério de 10% de células positivas, considerou-se que os casos de CECP com menos do que 10% de células de tumor que mostra imunopositividade fraco /focal foi igual ao caso HNSCC sem coloração positiva. A Figura 2A mostra um caso representativo de alta expressão de ambos periostina e VEGF-C. Ambos periostina e a expressão de VEGF-C foram observados no citoplasma de células CECP (Figura 2A). Na verdade, a maioria dos casos, com elevada expressão de periostina ou VEGF-C mostrou forte imunopositividade e difuso, como mostrado na Figura 2A e com a maioria dos casos de baixa expressão periostina ou VEGF-C não mostrou nenhuma imunopositividade como mostrado na Figura S3A. Apenas alguns casos mostraram a coloração heterogênea (Figura S3B). Para a coloração heterogéneo, que totalmente avaliado o número de células coradas e a sua intensidade de coloração, verificando, pelo menos, dez campos, incluindo áreas invasivas superficiais, centrais e de profundidade do tumor. Dos 54 casos CECP, foi observada elevada expressão de periostina em 39 (72,2%) dos casos e alta expressão de VEGF-C em 37 (68,5%) dos casos (Figura 2B). Trinta e três dos 39 (84,6%) casos CECP com expressão periostina expressa VEGF-C; esta correlação foi estatisticamente significativa (P 0,001).

(A) coloração imuno-histoquímica para periostina e VEGF-C em casos CECP. casos CECP representativos (alta e baixa ampliação) com periostina e expressão VEGF-C são mostrados. barra de escala é mostrado em cada imagem. (B) Gráfico mostra o estado de expressão VEGF-C em casos CECP com expressão alta ou baixa da periostina. (C) O nível sérico de periostina e VEGF-C em 81 pacientes com CECP foi examinada por ELISA. nível sérico de periostina e VEGF-C foi comparado com o estágio do tumor. O gráfico mostra a percentagem de periostina ou VEGF-C casos positivos na fase de tumor diferentes (variando de 1 a 4). (D) O nível sérico de periostina e VEGF-C foi comparado com metástase ganglionar. O gráfico mostra a percentagem de periostina ou VEGF-C casos positivos nos casos com ou sem metástase ganglionar (E) O nível sérico de periostina foi comparado com o nível sérico de VEGF-C. O gráfico mostra a percentagem de casos positivos de VEGF-C em casos com periostina positivo ou negativo.

Como tanto periostina e VEGF-C são proteínas secretadas, foram examinados os níveis séricos de periostina e VEGF-C em HNSCC pacientes por ELISA. Neste estudo, foi utilizado o sangue periférico coletadas de 81 pacientes com câncer HNSCC. Estes casos eram diferentes dos casos usados ​​no estudo imuno-histoquímico. As informações clínicas, incluindo metástase linfática, estágio do tumor e classificação TNM foi recolhida a partir de registros cirúrgicos dos pacientes (Tabela S2). Em amostras de 5 controlos saudáveis, o nível de soro foi periostina 0 ng /ml e o nível sérico de VEGF-C inferior a 11,0 ng /mL (dados não mostrados). Periostina foi detectada em 11,4 ng /mL em meio condicionado a partir de células-MSCC Inv1. Com base nestes resultados, um caso periostina-positiva foi definida como possuindo um nível sérico periostina 0 ng /mL e um caso de VEGF-C como tendo positivo um soro de VEGF-C nível ≥12.0 ng /mL. A percentagem de casos periostina-positivas aumentou com a fase de progressão e metástase de nódulo linfático (Figura 2C e 2D). Os dados sobre os níveis séricos de periostina e VEGF-C e os dados clínicos relevantes sobre o doente CECP estão listados na Tabela S2. A percentagem de casos-VEGF-C positiva também aumentou com a fase de progressão e metástase de nódulo linfático (Figura 2C e 2D). Curiosamente, 32,4% dos casos periostina-positivo, mas apenas 18,2% dos casos periostina-negativos foram VEGF-C-positivo (Figura 2E).

periostina promove diretamente a formação do tubo por células endoteliais linfáticas

como mostrado acima, verificou-se que a expressão periostina bem correlacionada com a expressão de VEGF-C. Periostina tem sido mostrado previamente para promover a angiogénese, tal como demonstrado por várias conclusões: (i) periostina aumenta receptor de FCEV Flk-1 /expressão de KDR em células endoteliais através de uma via de sinalização da integrina avp3-FAK-mediada [13], (ii) periostina recombinante aumenta a formação capilar [12], e (iii) aumento da expressão de periostina está correlacionada com o número de vasos sanguíneos e com metástases no HNSCC [14]. Por outro lado, estudos clínico-patológico mostrou que periostina estava bem correlacionada com metástases em linfonodos em vários tipos de câncer [15]. Estas descobertas feitas nos periostina hipótese de que pode afectar directamente a células endoteliais linfáticas em semelhantes às células endoteliais vasculares. Portanto, nós investigamos se periostina pode promover directamente lymphangiogenesis. Foi examinado o efeito de periostina sobre a formação de tubos por células TR-Le. Em relatórios anteriores, 100 ng /mL de proteína periostina recombinante foi usado para

in vitro

experimentos [12], [13]. Shao et al. expressão Flk1 avaliada após o tratamento com periostina recombinante (0, 50, 100 e 250 ng /mL). Como 100 ng /mL de periostina expressão regulada positivamente Flk1 notavelmente, eles utilizados 100 ng /mL de periostina nos seus estudos. Na nossa análise de ELISA, foram detectados 11,4 ng /mL de periostina em meios condicionados de células MSCC-Inv1. Além disso, foram detectados 0-15,1 ng /mL de periostina no soro de HNSCC paciente (Tabela S2). Apesar de 100 ng /mL de periostina parece ser elevada concentração, pensamos que a concentração de periostina pode ser mais elevada na área local do tumor do que no soro. Além disso, verificou-se que periostina promoveu a formação do tubo de um modo dependente da concentração (0, 50, 100 e 200 ng /mL) (Figura S4), e o efeito de 100 ng /ml de periostina na formação do tubo é notável (Figura 3A -C e a figura S4). Apesar de 100 ng /ml de periostina parece ser maior em comparação com o nível do nível fisiológico, foram utilizados 100 ng /ml de periostina nos seguintes estudos. 100 ng /ml de VEGF-C foi utilizada como um controlo positivo para a linfangiogénese. Em diversos estudos, 100 ng /ml de VEGF-C foi usado para in

experiências in vitro

[18] – [20]. Curiosamente, o tratamento com periostina recombinante promovido tubo de formação em relação a nenhum tratamento (Figura 3A e 3B). Surpreendentemente, o efeito sobre a formação de periostina tubo foi semelhante à do VEGF-C (Figura 3C). Por outro lado, o co-tratamento com periostina e VEGF-C acentuadamente promovida a formação do tubo (Figura 3D e 3E).

(A) As células TR-Le foram semeadas em poços revestidos com Matrigel, na presença de periostina (100 ou 200 ng /ml) ou VEGF-C (100 ng /mL). Após incubação durante 1-9 h, foram avaliados os comprimentos das estruturas semelhantes a tubos formados. A figura mostra as células após incubação durante 9 h. (B) O gráfico mostra as pontuações tubo após incubação durante 1-9 h. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de 3 experiências independentes. (C) O gráfico mostra as razões da pontuação tubo após o tratamento com VEGF-C ou periostina durante 9 h. A pontuação do tubo de controle foi definido como 1.0. (D) As células TR-Le foram semeadas em poços revestidos com Matrigel na presença de periostina (100 ng /mL) e VEGF-C (100 ng /mL). Após incubação durante 1-9 h, foram avaliados os comprimentos das estruturas semelhantes a tubos formados. O gráfico mostra a pontuação tubo após incubação durante 1-9 h. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de 3 experiências independentes. (E) O gráfico mostra as razões da pontuação tubo após o tratamento com VEGF-C e periostina durante 9 h. A pontuação do tubo de controle foi definido como 1.0. (F) periostina promove Src e fosforilação de Akt. Níveis de formas totais e fosforiladas de Src, Akt, ERK, e FAK após o tratamento de células TR-le com periostina (100 ng /ml) mostrado por Western blotting. expressão de p-actina foi utilizado como um controlo de carga. (L) Os comprimentos das estruturas semelhantes a tubos formados por células TR-le incubadas durante 1-9 h com periostina recombinante (100 ng /mL) com ou sem SU6656 (400 nM) foram avaliados. O gráfico superior mostra a pontuação tubo após incubação durante 1-9 h. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de 3 experiências independentes. O gráfico inferior mostra a relação de pontuação tubo. A pontuação do tubo de controle foi definido como 1.0. (H) Os comprimentos das estruturas semelhantes a tubos formados por células TR-le incubadas durante 1-9 h com periostina recombinante (100 ng /mL) com ou sem LY294002 (10 uM) foram avaliados. O gráfico superior mostra a pontuação tubo após incubação durante 1-9 h. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de 3 experiências independentes. O gráfico inferior mostra a relação de pontuação tubo. A pontuação do tubo de controle foi definido como 1.0.

Nós investigamos como periostina promove lymphangiogenesis usando western blot com anticorpos específicos de fosforilação para determinar os níveis de moléculas de sinalização celular, tais como Src, Akt atividade, ERK e FAK, em células TR-le-tratada periostina. Src e Akt e ERK, mas não FAK foram activadas por tratamento periostina recombinante (Figura 3F). Para confirmar o papel da Src e Akt no periostina promovido linfangiogénese, utilizou-se SU6656 para inibir a actividade de Src e LY294002 inibem a actividade de Akt para. Estes inibidores de quinase inibida a formação do tubo induzida por periostina por células TR-LE (Figura 3G e 3H), sugerindo que a linfangiogénese induzida por periostina pode ser mediada por Src e a actividade de Akt.

Em seguida, examinou-se o efeito de periostina na proliferação e migração de células TR-Le. periostina recombinante promovida apenas ligeiramente o crescimento celular (Figura 4A), mas a migração grandemente promovida (Figura 4B). adherens focais, que são aglomerados de integrinas com acumulação de múltiplos citoesqueleto e proteínas sinalizadoras em torno dos domínios citoplasmáticos integrina, ter efeitos significativos sobre a migração celular e sinalização. Portanto, examinámos o efeito de periostina sobre a formação de adesões focais. Foi semeado tripsinizadas células TR-Le em lamelas revestidas com PBS ou periostina recombinante e coradas para adesões focais com anticorpo anti-vinculina e para o F-actina com faloidina. células TR-le eficientemente ligado e rapidamente recuperada a sua morfologia em lamelas revestidas com periostina em comparação com PBS lamelas revestidas com (Figura 4C). Notavelmente, as células TR-le formado numerosas adesões focais contendo vinculina sobre as revestidas com periostina mas não as lamelas revestidas com PBS (Figura 4C). Aperfeiçoamento de formação de tubos por periostina pode ser afectada pela promoção da migração e aumento adesões focais.

(A) A proliferação de células TR-le depois do tratamento periostina recombinante. As células foram semeadas em placas de 24 poços revestidas com fibronectina a 1,5 x 10

4 /cavidade. Após pré-incubação a 33 ° C durante 24 h, a temperatura foi alterada e periostina recombinante foi adicionado (100 ng /mL) ao meio. As células foram tripsinizadas e contadas 0, 2, 4, ou 6 dias após a adição de periostina recombinante. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de 3 experiências independentes. (B) O efeito da periostina sobre a migração celular de células TR-LE. As células foram semeadas em filtros de pré-revestidas com 10 ug de fibronectina. O compartimento inferior continha 0,5 mL de meio isento de soro com ou sem 100 ng periostina recombinante /ml. Após incubação durante 4 h, as células que tinham migrado para a superfície inferior dos filtros foram visualizados por coloração com hematoxilina e contadas. O ensaio foi repetido 3 vezes. A figura mostra as células que tinham migrado para a superfície inferior do filtro (painel superior). O gráfico mostra o número de células sobre as superfícies inferiores dos filtros com ou sem periostina (100 ng /ml) (painel inferior). células (C) TR-Le foram semeadas em lamelas revestidas com PBS ou periostina recombinante (200 ng /mL) e deixadas a aderir durante 60, 120, 180, ou 240 min. As células foram coradas com Alexa Fluor 488 anticorpo-faloidina e anticorpo anti-vinculina-FITC. O ADN foi visualizado por 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) coloração.

periostina expressão correlaciona-se bem com o número de células endoteliais linfáticas em espécimes clínicos cancro

Para Conhecer o papel da periostina em lymphangiogenesis tumor

in vivo

, confirmou-se a correlação entre a expressão periostina eo número de vasos linfáticos em um modelo de xenotransplante tumoral em ratos nus. Nós já injetaram células CECP controle ou periostina-superexpressão subcutaneamente em ratinhos nus e descobriram que as células-superexpressão periostina transplantados produziu volume do tumor comparativamente maior após 28 dias do que os de células transfectadas com vector vazio [9] (Figura S5). Usamos estes tecidos tumorais (10 controlo e de 10 tumores com superexpressão periostina) para contar o número de vasos linfáticos que expressam LYVE-1, que foi especificamente observado em vasos linfáticos em ambos os tumores com superexpressão periostina (Figura 5A e Figura S4) e controle de. Curiosamente, o número de vasos linfáticos era significativamente mais elevada em tumores que sobre-expressam periostina (36,3 ± 11,1) do que nos tumores de controlo (14,95 ± 2,0) (Figura 5B).

(A) que sobre-expressam-periostina (periostina) e células (controlo) HSC2 transfectadas com vector vazio (1 × 10

7 células) foram individualmente injectados por via subcutânea em 2 sítios em cada um dos 5 ratinhos nus. Após um mês, os tumores foram ressecados e coradas com um anticorpo LYVE-1 anti-ratinho que reconhece vasos linfáticos. casos representativos de coloração imuno-histoquímica para LYVE-1 no controle e tumores com superexpressão periostina são mostrados. Seta mostra LYVE-1 vasos linfáticos positivos. (B) Os LYVE-1 em vasos linfáticos positivos controlo e tumores que sobre-expressam periostina foram contadas. O gráfico mostra o número médio de vasos linfáticos no controle e tumores com superexpressão periostina. As barras mostram os valores médios e SDS.

Finalmente, examinamos a correlação entre a expressão periostina e estado linfática em casos CECP por imuno-histoquímica utilizando o anticorpo D2-40. O anticorpo D2-40 especificamente reconhecido células endoteliais linfáticas mas não vasos sanguíneos (dados não mostrados). vasos linfáticos foram distribuídos de forma desigual ao longo dos tumores. Contamos o número de vasos linfáticos na intratumoral (dentro do tumor) e peritumoral (dentro de 1 mm da frente invasivos) áreas. CECP casos com expressão periostina tendiam a ter um maior número de vasos linfáticos, em ambos os domínios intratumoral e peritumorais (Figura 6A e 6B), mas esta relação não foi estatisticamente significativa. Como esperado, D2-40 imunocoloração destacou a presença de invasão linfática. De 54 casos CECP, 27 (50%) exibiram invasão de vasos linfáticos por células tumorais. Surpreendentemente, a expressão periostina foi observada em 25 de 27 casos CECP com invasão linfática (Figura 6C). expressão periostina foi significativamente correlacionada com invasão linfática (

P Art 0,001).

(A) periostina e níveis de expressão de D2-40 foram examinadas por coloração imuno-histoquímica de amostras de casos HNSCC. Um caso representativo de periostina e expressão D2-40 para CECP é mostrado. Seta mostra D2-40 vasos linfáticos positivos. (B) O gráfico mostra a comparação entre o número médio de vasos linfáticos em intratumoral, peritumoral, e as áreas totais em casos CECP com expressão alta ou baixa da periostina. (C) O gráfico mostra o status de invasão linfática em casos CECP com expressão alta ou baixa da periostina.

Discussão

A taxa de sobrevida em 5 anos global para CECP, um dos os cancros mais comuns, é baixa, em grande parte devido à propensão de alguns tumores de divulgar através dos vasos linfáticos. Na verdade, comprometimento de linfonodos é um dos mais fortes indicadores de mau prognóstico. Estudos recentes, utilizando modelos animais sugerem que os tumores sólidos podem induzir a linfangiogénese que por sua vez pode promover a disseminação do tumor [21]. Além disso, lymphangiogenesis pode ocorrer ao lado ou dentro de cancros e se correlaciona com metástase ganglionar [22], [23]. Temos demonstrado anteriormente que o número de vasos linfáticos em ambas as áreas intratumorais e peritumoral foi bem associada a um aumento da tendência para a metástase nodal para CECP [24]. Enquanto lymphangiogenesis em tumores primários é conhecido por prever a metástase nodal, o seu mecanismo permanece obscuro.

Nós previamente identificados periostina como um fator de promoção da invasão através da comparação dos perfis de expressão genética de pai e células clone CECP altamente invasivos [9] . Periostina, originalmente chamada específico do osteoblasto fator-2 (Osf2), foi identificado pela primeira vez no osso, em que foi implicada na regulação da adesão e diferenciação dos osteoblastos [10], [25]. evidência cumulativa mostra que a alta expressão de periostina é frequentemente observada em vários tipos de câncer e se correlaciona bem com comportamento maligno [15]. Recentemente, periostina foi revelado para estimular o crescimento metastático através da indução de angiogênese [13], [14]. Periostina segregada por actos células tumorais de um modo parácrino para aumentar a sobrevivência de células endoteliais e induz neovascularização, consistente com a noção de que o aumento de sobrevivência de células endoteliais intratumorais é crítica para a angiogénese do tumor bem sucedida [26] – [28]. A nossa análise de microarray anterior de células-mãe e CECP clone altamente invasivos encontrados que o VEGF-C foi regulada positivamente nas células altamente invasivos [9] (Figura 1A e 1B). De facto, a sobre-expressão induzida periostina a supra-regulação da expressão de VEGF-C em células do CECP, e da proteína VEGF-C foi segregada a partir de células que sobre-expressam CECP periostina (Figura 1B). VEGF-C, o original Flt-4 /VEGFR-3 ligando [29], [30], é um membro da família VEGF de factores de crescimento de polipéptido, o qual compreende VEGF-A, -B, -C, -D ea VEGFs vírus parapoxvirus orf [31], [32]. Com base no seu perfil de expressão e a sua ligação a Flt-4, o VEGF-C tem sido implicado no desenvolvimento do sistema linfático [33], [34]. Além disso, a sobre-expressão transgénica do VEGF-C, sob o promotor de queratina 14 induz o alargamento de vasos linfáticos na pele [35], e VEGF-C recombinante induz linfangiogénese na membrana corioalantóica de pintainho [36]. A activação do /Flt-4 eixo de VEGF-C em células endoteliais linfáticas pode facilitar a metástase, aumentando a formação de vasos linfáticos no interior e em torno de tumores [37]. A /Flt-4 eixo de VEGF-C é expresso, por conseguinte, não apenas por células endoteliais linfáticas, mas também por uma variedade de células tumorais humanas. Como esperávamos, meios condicionados a partir de células CECP periostina-superexpressão promoveu a formação de tubos de células endoteliais linfáticas. Além disso, o inibidor da cinase VEGFR-3 inibiu a formação do tubo induzida por meio condicionado a partir de células que sobre-expressam periostina, sugerindo que a linfangiogénese promoveu-periostina pode ser causada em parte pelo aumento da secreção de VEGF-C a partir de células de cancro (Figura S2B). Ao utilizar amostras clínicas, que demonstraram que a expressão periostina bem correlacionada com a expressão de VEGF-C em casos CECP por imuno-histoquímica e que o nível sérico periostina bem correlacionada com a de VEGF-C em pacientes com CECP (Figura 2E). Neste estudo, não foi possível detectar periostina no soro a partir de 5 voluntários saudáveis ​​normais. Relatos anteriores mostraram que a gama de periostina selvagem foi detectado no soro (0,2-194 ng /mL) em voluntários saudáveis ​​normais [35] – [38]. Assim, o nível sérico de periostina em voluntários saudáveis ​​normais parece ser controverso, e ainda não está claro se periostina é produzida por células normais ou não. No futuro, vamos examinar o nível sérico de periostina no grande número de voluntários saudáveis ​​normais. No entanto, todos os relatórios, incluindo o presente estudo mostrou que o aumento do nível de periostina foi observada em pacientes com câncer [38] – [41]. Importante, nível sérico de periostina e VEGF-C foi bem correlacionada com a progressão tumoral, incluindo metástase ganglionar.