Sumário

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2) desempenham um papel fundamental na progressão da doença, a recidiva e resistência terapêutico do cancro da próstata avançado (APC). Neste trabalho, foram avaliados, pela primeira vez, o benefício terapêutico do bloqueio EGRF e /ou COX-2 (utilizando gefitinib e NS-398, respectivamente) em termos de melhorar a eficácia da droga docetaxel quimioterapêutico clínica convencional in vitro e vivo. Mostrámos que o EGFR e expressão de COX-2 foi maior do que em metastático tecidos e células não metastáticas APC. O docetaxel, sozinho ou em combinação com gefitinib ou NS-398, resultou num pequeno decréscimo na viabilidade celular. A combinação de três drogas diminuiu a viabilidade celular em maior medida do que isoladamente ou em combinação com gefitinib ou NS-398 docetaxel. Docetaxel resultou num aumento modesto na célula apoptótica em linhas de células metastáticas e não metastáticas. NS-398 marcadamente aumentada de apoptose celular induzida por docetaxel. A combinação das três drogas causou apoptose ainda mais marcado e resultou em maior supressão do potencial invasivo do que isoladamente ou em associação com gefitinib ou NS-398 docetaxel. A combinação de todas as três drogas também resultou numa redução mais acentuada do NF-kB, os níveis de VEGF e MMP-9 em células PC-3M. Estes resultados in vitro foram apoiados por estudos in vivo que mostram que o docetaxel em combinação com gefitinib e NS-398 foi significativamente mais eficaz do que qualquer agente individual. Com base em estudos pré-clínicos anteriores, podemos concluir que, simultaneamente, bloquear o EGFR e COX-2 por gefitinib e NS-398 sensibiliza células avançados APC a citotoxicidade induzida pelo docetaxel.

Citation: Lin J, Wu H, Shi H, Pan W, Yu H, Zhu J (2013) Combinada de inibição de Fator de Crescimento Epidérmico Receptor e ciclo-oxigenase-2 induz maior atividade anti-tumoral de Docetaxel in Advanced Câncer de próstata. PLoS ONE 8 (10): e76169. doi: 10.1371 /journal.pone.0076169

editor: Wendy J. Huss, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Março, 2013; Aceito: 21 de agosto de 2013; Publicação: 14 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho tem apoiado pelo projeto de planejamento Ciência e Tecnologia de Nanjing, China (201.201.088). A URL do site do financiador é https://202.127.12.44/XMSB/Show_JBXXB.jsp?XMBH=2012sc315043 DJXH=20121069. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno mais comum, e é uma das principais causas de morte entre os homens idosos [1]. A taxa de resposta à terapia prostatectomia e ablação hormonal radical é elevada em pacientes com diagnóstico de cânceres localizados e andrógeno-dependentes. No entanto, a progressão de cancros da próstata refractário a hormonas (HRPC) e /ou metástases ósseas está associado com a recidiva da doença e sobrevivência do paciente pobre [2-4]. Com efeito, a progressão do cancro da próstata a independência de androgénio continua a ser uma barreira primária para melhorar a sobrevivência do paciente, uma vez que está associada com as alterações celulares subjacentes complexos.

O docetaxel é considerado como o agente quimioterapêutico padrão para pacientes com HRPC e naqueles com evidência clínica de metástases. Tem sido relatado para melhorar a qualidade de vida e oferece o alívio da dor, mas é associada com o mínimo de uma taxa média de sobrevivência de apenas 12 a 19 meses a partir do início do tratamento. Isso destaca a necessidade de ensaios investigando como otimizar esquemas quimioterápicos convencionais em pacientes com HRPC ou PCA avançado.

Investigando os mecanismos moleculares subjacentes a progressão APC, irá ajudar a identificar os genes alvos terapêuticos putativos envolvidos na apoptose. Ele também irá ajudar a elucidar o mecanismo responsável para o crescimento e sinalização celular [5-8]. EGFR e de COX-2 têm mostrado contribuir para o crescimento sustentado em HRPC avançado quer na ausência ou na presença de baixas concentrações de androgénio [9-11].

EGFR é frequentemente sobre-expresso em cancros humanos. Dados pré-clínicos sugerem que as vias de sinalização EGFR ativar receptores de andrógenos em condições de privação de andrógeno clínica. Esta está ligada à transição do androgénio-responsivo ao fenótipo refractário a hormonas, resultando em um resultado clínico mais agressivo [10,11]. EGFR é, portanto, assumido como sendo de importância terapêutica primária, devido à sua sobre-expressão em CaP avançado e seu papel como um alvo de drogas. Estudos anteriores têm demonstrado que a activação do EGFR aumenta a capacidade dos receptores de androgénio para aumentar a proliferação de CaP. Em contraste, foi mostrado inibição de EGFR para melhorar a eficiência de docetaxel no tratamento de CaP metastático [12,13].

As ciclooxigenases catalizam a formação de prostaglandinas envolvidas na iniciação do tumor e /ou progressão. A COX-2 tem sido demonstrado que promovem a inflamação, o que pode contribuir directamente para o desenvolvimento de CaP [14]. Também foi mostrado que induzida por PGE2 de COX-2 activa a sinalização celular envolvidos na proliferação e promove assim directamente o crescimento de células tumorais. Outros estudos demonstraram que a COX-2 é sobre-expressos em APC e que o seu nível de expressão se correlaciona com a pontuação de Gleason, a progressão do câncer e recorrência [15,16]. Em anos recentes, inibidores da COX-2 em combinação com medicamentos quimioterapêuticos foram avaliadas no tratamento de CaP avançado. Estes agentes aumentam significativamente a eficácia da retirada de androgénio e promover a resolução das lesões do esqueleto [17,18]. É geralmente aceite que a COX-2 contribui para a APC e existe evidência crescente para sugerir que os inibidores da COX-2 pode ser benéfica no tratamento de CaP.

Estudos anteriores têm confirmado que a elevada expressão de COX-2 em PCA é correlacionada com a resistência do docetaxel, e que a inibição da COX-2 diminui significativamente o crescimento do tumor e aumenta a eficácia do docetaxel [19,20]. Com base nestas observações, é possível que a adição de inibidores selectivos de EGFR e de COX-2 podem representar uma nova abordagem terapêutica para a melhoria do tratamento de CaP metastático. No presente estudo, a hipótese de que o bloqueio simultâneo de EGFR e COX-2 vias usando gefitinib e NS-398 pode melhorar os efeitos citotóxicos de docetaxel em CaP avançado in vitro e in vivo. O anti-proliferativos, anti-invasivo, e indução de apoptose efeitos dos três agentes, sozinhos e em combinação, foram determinadas in vitro e in vivo e os mecanismos moleculares subjacentes foram investigados.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética da Universidade médica de Nanjing. A investigação clínica foi aprovado pelo Comitê da Universidade Médica de Nanjing Ética. consentimento informado por escrito foi obtida para todos os assuntos antes da participação no estudo.

amostras tumorais e linhas celulares

amostras de CaP de 37 casos de adenocarcinoma primárias foram incluídos no estudo. Em todos os casos, dois patologistas independentes avaliaram as amostras de excluir outros tipos patológicos. Todas as amostras foram obtidas por ressecção transuretral da próstata, a prostatectomia radical ou agulha de biópsia no BenQ Hospital Nanjing e Nanjing Primeiro Hospital, entre 2010 e 2012. O estadiamento cirúrgico de tumores foi realizada de acordo com critérios Jewett-Whitmore. A idade média dos pacientes era de 69 anos (variando de 58 a 79 anos).

A próstata humana linhas celulares de cancro LNCaP, PC-3M e DU-145 utilizados no estudo foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection e foram mantidas em meio de cultura RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10%, 26 mmol /L NaH

2CO

3 (pH 7,4), 1% de L-glutamina, e antibióticos (100 IU /mL de penicilina-100 ug /mL de estreptomicina) a 37 ° C em 5% de CO

2. RPMI 1640 e outros materiais de cultura foram fornecidos por Gibco.

Reagentes e anticorpos

Gefitinib, NS-398, docetaxel e MTT foram adquiridos da Sigma. Anexina V-FITC foi fornecido pela Gibco. Os anticorpos contra VEGF humano e MMP-9 foram obtidos a partir de R D e Sistema Bioworld, respectivamente. monoclonal anti-humano de COX-2, EGFR e anticorpos monoclonais de VEGF monoclonais foram obtidos de Santa Cruz. Anticorpo contra P65 NF-kB humana foi comprado de Abcam. Os anticorpos monoclonais para GAPDH (Bioworld) e β-actina (Sigma) foram utilizados como controlos experimentais.

Imunohistoquímica

Os cortes histológicos (4 mm), fixados em formol 10% e embebidos em parafina foram usados ​​para a coloração imuno-histoquímica. Antes da coloração com um anticorpo primário, as lâminas foram pré-tratadas com ácido cítrico ou tampão de ácido etilenodiamino tetra-acético em uma panela de pressão para a recuperação de antigénio. Todos os anticorpos primários utilizados no estudo foram anticorpos monoclonais biotinilados.

actividade de peroxidase endógena foi extinta utilizando 3% H

2O

2 reagente de bloqueio durante 10 minutos. As lâminas foram então incubadas com um anticorpo primário, a 4 ° C durante a noite, antes da coloração imunológica com complexo de peroxidase avidina-biotina (100: l). As lâminas foram coradas com diaminobenzidina de acordo com o protocolo do fabricante (Dako, CA). As lâminas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato após cada passo de coloração. As secções foram coradas com uma diluição de 1: o anticorpo 200 contra o EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), e 1: diluição do anticorpo contra a COX-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA 100, EUA), respectivamente.

As lâminas coradas foram avaliados quantitativamente ou semi-quantitativa por dois patologistas independentes que eram cegos aos dados clínicos. O número médio de células de tumor coradas positivamente para a COX-2 e EGFR foi de 10% em cada caso. A percentagem de células positivas coradas com anticorpo especial observado por dois patologistas foram consistentes e valores médios foram determinados.

Cultura e viabilidade celular Ensaios

Os efeitos dos agentes individuais, e de combinações duplas e triplas de agentes em linhas de células DU-145 PC-3M e foram determinados após 48 h de exposição a 3- (4,5-dimetylthiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT). A reprodutibilidade foi confirmada em três experiências independentes. Para testar a viabilidade após a exposição a gefitinib, NS-398 e docetaxel isoladamente ou em combinação, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de aproximadamente 5 x 10

4 /ml (em 100 ul de meio por poço) e foram incubadas durante a noite a 37 ° C. Com base em estudos anteriores, nós escolhemos concentrações de 20 umol /L gefitinib, 100 pmol /L) e NS-398 0.01μmol /L de docetaxel para todos os ensaios. As células expostas a DMSO foram usadas como controlos não tratados.

invasão in vitro de ensaio

O potencial invasivo de células de cancro da próstata foi estimado pela sua capacidade para penetrar numa câmara de invasão de Matrigel compreendendo uma membrana de tamanho de polietileno tereftalato de 8 poro, e uma fina camada de Matrigel matriz. PC-3M e DU-145 células de controlo ou células previamente expostos durante 24 h a gefitinib (10 umol /L), NS-398 (50 umol /L), ou docetaxel (0,005 umol /L) sozinhos ou em combinação foram utilizados o ensaio de invasão celular. Em cada experimento, 5 × 10

4 /células mL por poço, em meio sem droga (controlo) ou contendo a droga, foram carregados no topo da câmara de invasão de células de Matrigel, ou para a câmara de inserção de controle sem Matrigel, de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação durante 24 h a 37 ° C, as células invasoras que alcançam a câmara inferior foram corados com violeta de cristal ,, e contadas por microscopia de contraste de fase. O número de células invasoras foi estimada como sendo o número médio invadir através da membrana de Matrigel inserir em cinco campos aleatórios de microscópio.

Fluxo citofluorométricas analisa

As células foram expostas a gefitinib (20 umol /L) , NS-398 (100 umol /L), ou docetaxel (0,01? mol /L), isoladamente ou em combinação. Após 24 h de incubação, tanto para o crescimento e meio de lavagem foram guardados, e as células foram colhidas com tripsina. Os sobrenadantes foram removidos e os sedimentos foram ressuspensos em 400 ul de iodeto de propídio (PI) solução (50 ug /mL de PI, 0,1% de Triton X-100, e 0,1% de citrato de sódio em PBS). As amostras foram então incubadas durante a noite a 4 ° C no escuro antes da análise. A citometria de fluxo foi quantificada para determinar a percentagem de células contendo células apoptóticas, necróticas.

A transcrição reversa e PCR em tempo real

PC-3M e DU-145 células cultivadas em FBS a 1% foram expostos durante 24 h a gefitinib (20 umol /L), NS-398 (100 umol /L), ou docetaxel (0,01? mol /L) sozinhos ou em combinação. As células expostas a DMSO como veículo, foram utilizados como controlos. O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol. Um micrograma de ARN foi transcrito de forma inversa utilizando um sistema de transcrição inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em Tempo Real foi utilizado para quantificar a expressão de ARNm. As sequências dos iniciadores utilizados são os seguintes: MMP9 (para a frente: 5′-TC GAACTTTGACAGCGACAAGA-3 ‘e inverso 5′-TCAGGGCGAGGACCATAGAG’-3), o NF-kB (a seguir: 5′-TGGACCGCTTGGGTAACTCT-3’and reverso 5′-GGCTATTGCTCATCA TGGCTAG-3 ‘), de VEGF (para a frente: 5′-CTATCAGCGCAGCTACTGCCAT-3’and reverso 5′- GCACACAGGATGGCTTGAAGAT-3’). GADPH foi usada como um controlo interno para corrigir a variação potencial no carregamento de ARN. Os genes alvo e GADPH foram corridos sob as mesmas condições. Todas as reacções foram realizadas num volume de 20 pL contendo o ADNc de amostra, TaqMan PCR rápidos universais Mastermix, iniciadores e sondas. As condições de PCR foram 40 ciclos a 45 a 95 ° C durante 15 s, seguido por 1 min em 59 ciclos a 65 ° C.

ensaio Western Blot

PC-3M e DU-145 células expostos aos fármacos descritos acima foram colhidas por raspagem das cavidades e as lavagens duas vezes com PBS frio. O sedimento celular foi suspenso em 125 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), sonicadas durante 10 s antes da adição de um volume igual de SDS a 4%. Os lisados ​​foram fervidas durante 10 min. A concentração de proteína foi determinada utilizando um ensaio de proteína do ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL).

As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose, bloqueados e incubados com anticorpos primários como se segue: VEGF diluída 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, EUA), MMP -9 (4 ug /ml, R D Systems), NF-kB ((Abcam Ltd., Reino Unido).), e β-actina 1: 10000 (Sigma) /GADPH 1: 10000 (Bioworld). A membrana foi em seguida lavada e incubada com os anticorpos secundários (Bioworld) conjugado com peroxidase. detecção da proteína foi realizada utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência (Thermo).

As experiências com animais

Quatro a seis semanas de idade, ratinhos BALB /c nu /nu foram obtidos do Laboratório de animal Co. SLAC Ltd (Xangai, China). Os tumores foram crescidos bilateralmente em ratos nus atímicos, por injecção subcutânea de 5 × 10

4-10

5 células PC-3M (suspensas em PBS) por animal. tumores 0,2 cm

3 de diâmetro foram detectados após 7 dias bem estabelecida. Os ratinhos foram então distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos de seis: controlos não tratados, gefitinib (50 mg /kg, qd, p.o.), NS-398 (200 mg /kg, qd, p.o.), docetaxel (0,05 mg /kg, qd, PO), gefitinib e docetaxel, NS-398 e docetaxel, gefitinib, NS-398 e docetaxel.

As medições do tumor foram realizadas durante o curso de tratamento e de observação períodos. O volume do tumor foi medido utilizando a fórmula: π /6 x diâmetro maior

×

(diâmetro menor)

2. A cirurgia foi realizada sob anestesia cetamina /xilazina, e todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento.

Análise

Estatística

A análise estatística foi realizada usando SPSS versão 16.0 do software. Os dados são apresentados médias e desvios padrão (± DP). O índice de tratamento de combinação no PC-3M e células DU-145 foi calculada utilizando software CalcuSyn. De acordo com este método, os valores de CI 1, 1 e 1, representado, respectivamente, sinergia, aditividade e antagonismo [21]

in vitro e in vivo dados foram analisados ​​utilizando o teste t de Student.. EGFR e COX-2 expressão em tecidos CaP não-metastáticos e metastáticos foi comparada por meio do teste do qui-quadrado de Pearson .. Os valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

EGFR. e COX-2 níveis de proteína em tecidos de câncer de próstata

expressão de EGFR foi positiva em sete tecidos CaP não-metastáticos (43,8%) e em 18 (85,7%) amostras de tecido de pacientes com PCA metastático (

P

0,01). intensidade de coloração para a COX-2 foi observada em 18 metastático (85,7%) e nove tecidos CaP não-metastáticas (56,3%; P = 0,11). EGFR e co-expressão de COX-2 foi positiva em 16 tecidos metastáticos (76,2%) e em quatro (25,0%) de CaP tecidos não-metastáticas (P 0,01). Os resultados são mostrados na Figura 1 e Tabela 1.

As secções foram examinadas sob um microscópio, e a imunorreactividade foi indicada por uma coloração castanha escura. secções representativas de amostras de tecido de câncer de próstata obtida com ampliações originais de × 200 e × 400.

Stage

n

Número (%) pacientes

EGFR + COX 2+

EGFR + COX-2-

EGFR-COX-2 +

EGFR-COX-2-

A + B164 (25,0%) 3 (18,8%) 5 (31,2%) 4 (25,0%) + C Tabela 1. A expressão positiva do EGFR e COX-2 no cancro da próstata metastático e não metastático D2116 (76,2%) 2 (9.5%) 2 (9.5%) 1 (4,8%).

estadiamento patológico do CaP foi definida de acordo com o sistema de estadiamento Whitmore-Jewett como followsA (descobertos incidentalmente PCA), B (PCA limitada), C (invasão de órgãos adjacentes) D (metástases distantes ou linfonodal) estágio .Jewett a e B foi definido como C não metastático e fase ou D como metastático. CSV Transferir CSV

expressão da linha de base e activação da proteína EGFR e COX-2 de PC-3M e células DU-145

O nível basal de EGFR total, o p-EGFR e de COX-2 foi medida em PC-3M e células DU-145. Em seguida, investigou se EGF foi associado com um aumento desses níveis. Os resultados indicaram que activado /EGFR fosforilado (p-EGFR), o EGFR e proteína da COX-2 foram expressos em ambas as linhas celulares (Figura 2A). p-EGFR e expressão de COX-2 foram significativamente aumentados nas duas linhas de células por meio da adição de EGF, mas a expressão do EGFR foi inalterada. A alteração na relação de p-EGFR /EGFR foi dependente da dose (Figura 2B).

Células cultivadas em FBS a 1% foram expostos a 0, 10 e 100 ng /ml de EGF durante 24 h como descrito em Materiais e Métodos. As proteínas celulares resultantes foram sujeitas a SDS-PAGE e análise de Western blot para determinar os níveis de proteína de p-EGFR, EGFR e COX-2 (Figura 2A). Western blot para β-actina é mostrado como controlo de carregamento. O nível de proteínas em relação a p-EGFR /EGFR e COX-2 é mostrado na Figura 2B.

efeito anti-proliferativo induzido por si só ou em combinação com gefitinib e NS-398

ensaios MTT foram utilizados para avaliar o efeito anti-proliferativo dos três medicamentos sozinhos ou em combinações, no PC-3M e células DU-145. Em experiências preliminares, que estabeleceu curvas de concentração-resposta para cada fármaco para determinar a concentração que produziu uma inibição de crescimento a menos do que 30% nas linhas celulares PCA (dados não mostrados). Com base nessas curvas, determinou-se a que as concentrações de docetaxel (0,01? Mol /L), gefitinib (20 umol /L), ou NS-398 (100 nmol /L) foram considerados adequados para utilização nas experiências de combinação. A co-incubação com gefitinib ou NS-398 ligeiramente melhorado o efeito citotóxico do docetaxel. No entanto, a combinação de três drogas induziu uma maior do que um efeito aditivo sobre o crescimento de inibição de células em ambas as linhas celulares, que foi muito mais acentuada do que a observada com qualquer um ou combinações de dois fármacos (figura 3). Análise do tratamento de combinação em PC-3M e células DU-145 indicou que o índice de combinação para a combinação de três agentes era 1, sugerindo um efeito sinérgico (Tabela 2 e 3)

A resposta de concentração-resposta para. cada droga foi usada para determinar a concentração que induziu um efeito anti-proliferativo apropriado para utilização em terapia de combinação (dados não mostrados). As células foram expostas ao docetaxel (0,01? Mol /L), NS-398 (100 pmol /L) e gefitinib (20 umol /L) sozinhos ou em combinação, durante 24 h. Os valores são médias ± DP de quatro expericias independentes. * P 0,05, ** P 0,005 ***, P 0,001 em comparação com valores de controlo. linhas

celular

G (M)

D (nM)

Fa

CI

N (M)

D (nM)

Fa

CI

PC-3M1050.2151.1535050.2110.98220100.2801.049100100.3080.72640200.3631.118200200.3881.023DU-1451050.1861.8395050.2640.96620100.2651.114100100.3830.92440200.3251.092200200.5850.956Table 2. Efeito de gefitinib (L) ou NS-398 (N) em combinação com docetaxel (D) no PC-3M e células DU-145.

CSV Baixar linhas celulares CSV

L

(uM) N (M)

Dl (nM)

Fa

CI

PC-3M105050.3020.74520100100.4650.71240200200.6610.699DU-145105050.2640.96620100100.4230.78340200200.6210.872Table 3. Efeito de gefitinib (L), NS-398 (N) e o docetaxel (D) combinação em PC-3M e DU-145 células.

Tratamentos de combinação com gefitinib (10, 20, e 40 uM), NS- 398 (50, 100, e 200 uM) e docetaxel (5, 10, e 20 nM) em PC-3M e DU-145. As linhas celulares foram avaliadas pelo ensaio de MTT. Fa: Fração de crescimento afetam de células expostas a drogas em comparação com os controles. CI, índice de combinação. Fa e CI foram calculados utilizando software CalcuSyn. CSV Baixar CSV

efeito citotóxico induzido por docetaxel, gefitinib, e NS-398

análises de citometria de

Fluxo foram usados ​​para determinar a apoptose celular induzida por qualquer droga isoladamente ou em combinação. O número de células apoptóticas foi quantificada (Figura 4A e C). Ambos docetaxel e gefitinib, mas não NS-398, um ligeiro aumento no número de células apoptóticas em comparação com o observado em células não tratadas de CaP (Figura 4B e D). Docetaxel em combinação com gefitinib ou NS-398, foi associado com um aumento no número de células apoptóticas em comparação com docetaxel (Figura 4B e D). A combinação de três drogas resultou em um número significativamente maior de células apoptóticas do que qualquer droga única ou duas drogas combinação (Figura 4B e D).

Após a incubação com várias drogas, foram preparadas as células tal como descrito em Materiais e Métodos e taxa de apoptose foi avaliada por análises FACS. A e C: gráficos de pontos representativos ilustram os dados perto da média dos grupos em B e taxa de D. B e D. A apoptose foi calculado a partir de UR (não viáveis ​​por apoptose ou célula de necrose taxa) e LR (taxa de celular precoce apoptótica) associação. Os resultados representativos de três experiências separadas. * P 0,05, ** P 0,005 ***, P . 0.001 em comparação com os valores de controlo

Perda da capacidade invasiva induzida pelo docetaxel, gefitinib, e NS-398

Um ensaio de invasão in vitro foi usado para avaliar a capacidade invasiva de células PC-3M e DU145. O potencial invasivo foi determinada calculando o número de células que penetrou uma câmara de invasão de Matrigel. Como mostrado na Figura 5A e C, as células que expõem a 0,005 umol /L docetaxel, 10 umol /L gefitinib, ou 50 umol /L NS-398 inibiu significativamente a sua capacidade invasiva (Figura 5B e D).

A As células não foram tratados (controlo) ou expostos durante 24 h a 0,005 umol /L docetaxel (D), 10 nmol /L a gefitinib (G) ou 50 umol /LNS-398 (N), isoladamente ou em combinação, durante os ensaios in vitro de invasão, realizada utilizando câmaras Transwell bicamarais como descrito em Materiais e Métodos. No final do ensaio de 24 h, as células invasoras foram coradas e contadas por microscopia de contraste de fase (x 200). Os resultados representativos mostram o número médio de células invasoras através do Matrigel inserir membrana em cinco campos aleatórios de microscópio. * P 0,05, ** P 0,005, ***, P . 0,001 em comparação com valores de controlo

A exposição ao docetaxel em combinação com gefitinib ou NS-398 reduziu marcadamente o número de células DU-145 que penetram no Matrigel em comparação com docetaxel (Figura 5D), mas não foram observadas diferenças nas células PC-3M (Figura 5B). A combinação de três drogas mostraram um efeito inibitório supra-aditivo sobre a capacidade de invasão de células que era mais forte do que qualquer combinação de dois fármacos (Figura 5B e D).

NF-kB, MMP-9 e a expressão de VEGF induzida por alterações docetaxel, gefitinib, e NS-398

de proteína e ARNm foram quantificados e para investigar se a NF-kB, MMP-9 e VEGF, foram envolvidos nas respostas celulares ao docetaxel, gefitinib ou NS-398. Os resultados na Figura 6A e 6B, mostram que o docetaxel, gefitinib e NS-398 cada um separadamente regulados negativamente NF-kB, MMP-9 e a expressão de ARNm de VEGF em ambas as linhas de células APC. NF-kB a expressão de ARNm foi mais acentuadamente regulada negativamente quando as células foram expostas a combinações de fármacos. As três combinações de fármacos mostraram um efeito inibidor mais forte do que as duas combinações de fármacos (Figura 6A e B).

Células cultivadas em 1% de FBS foram expostas a 0,01 umol /L de docetaxel (D), 20 pmol /L gefitinib (L) or100 umol /LNS-398 (N), sozinho ou em combinação, ou com DMSO como controlo, durante 24 h. NF-KB, MMP-9 e ARNm de VEGF (A e B) e os níveis de proteínas (C e D) foram medidas como descrito em Materiais e Métodos. Os valores são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

Nem gefitinib nem NS-398 teve qualquer efeito aditivo sobre a regulação negativa induzida pelo docetaxel de expressão de MMP-9 e VEGF ARNm (Figura 6A e B ). No entanto, a co-incubação com todos os três agentes, resultou na inibição mais acentuada dos níveis de VEGF MMP-9 e comparado com uma combinação única ou duas drogas em células PC-3M (Figura 6A) mas não em células DU-145 (Figura 6B),

Western blotting foi realizado para avaliar os níveis de proteína de NF-kB MMP-9 e VEGF após exposição a cada uma das drogas. Como mostrado na Figura 6C e 6D, a adição de docetaxel a gefitinib e /ou NS-398 em combinação duplo e triplo mudaram de NF-kB, MMP-9 e os níveis de proteína de VEGF em ambas as linhas celulares. Estes resultados são geralmente consistentes com as mudanças de ARNm, excepto para as mudanças na proteína de NF-kB após a exposição a uma combinação de docetaxel e NS-398, (Figura 6C e D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a resposta benéfica de células PC-3M à exposição ao docetaxel, gefitinib e NS-398 combinação, é influenciada por uma redução no NF-kB, MMP-9 e VEGF (Figura 6C).

Efeitos de gefitinib, NS-398 e docetaxel no crescimento do tumor da próstata in vivo

docetaxel em combinação com gefitinib ou NS-398 inibiu o crescimento tumoral e a uma extensão significativamente maior do que nos controlos não tratados ou animais tratados com um único fármaco (Figura 7). Nestes grupos de combinação duplas apenas um aumento modesto no tamanho do tumor foi registado no fim da experiência de 6 semanas após a injecção das células tumorais e 2 semanas após a interrupção do tratamento. O tratamento combinado com quaisquer duas drogas ou com todas as três drogas foi bem tolerada; não se observaram perda de peso ou outros sinais de toxicidade aguda ou atrasada.

Os ratos foram injectados no flanco dorsal com células PC3M. Após 7 dias (o tamanho médio do tumor: 0,2 cm

3), os ratinhos foram tratados tal como descrito na secção Materiais e Métodos. A mudança do volume do tumor foi avaliado após exposição a doe, gefitinib e NS-398 sozinho ou em combinação. Os dados são apresentados como médias ± SD.

Discussão

Docetaxel desempenha um papel importante no tratamento de CaP avançado. No entanto, o tratamento de longo prazo geralmente resulta em efeitos secundários e resistência à quimioterapia, resultando em recidiva da doença e sobrevivência pobre. Numa tentativa para ultrapassar a resistência aos medicamentos, os estudos recentes têm-se centrado sobre o docetaxel de baixa dosagem combinada com outras drogas ou em silenciar alguns genes [22-25].

EGFR e de COX-2 são sobre-expresso num certo número de doenças malignas incluindo CaP. Um crescente corpo de evidências mostram que a COX-2 e actividades de sinalização de EGFR desempenham um papel crucial no desenvolvimento de doenças malignas. Ambas as vias, portanto, fornecer alvos atraentes para a terapia anticâncer e quimioprevenção [5-8,26,27]. Consequentemente, EGFR e os inibidores da COX-2 têm sido investigados por quimioterapia e prevenção do câncer [28-31].

A sobre-expressão do EGFR e de COX-2 e a interacção entre o EGFR e de sinalização da actividade de COX-2 têm sido implicados como factores causais para o cancro [32,33]. No nosso in vitro e estudos in vivo, que demonstraram significativa sobre-regulação da expressão de EGFR e de COX-2 em tecido avançado CaP (Tabela 1) e em linhas celulares correspondentes (Figura 2). Foi previamente relatado que a activação ou a sobre-expressão de EGFR [12,13] e COX-2 [20] está correlacionada com a resistência ao docetaxel. Isso nos levou a especular que a segmentação simultaneamente EGFR e COX-2 pode ser uma estratégia terapêutica mais eficaz para superar a resistência docetaxel de mirar qualquer via de sinalização separadamente.

Nossos resultados mostram que, simultaneamente, bloquear o EGFR com gefitinib e COX-2 com NS-398 em células submetidas a CaP de baixa-dose de docetaxel resultou num efeito benéfico sobre a inibição do crescimento celular (Figura 3). análise de efeito mediano utilizando o método de Chou e IC Talalay confirmou uma interacção sinérgica entre moderadamente estes três medicamentos em ambas as linhas celulares de CaP (quadro 2 e 3). Na apoptose celular e ensaios de invasão o efeito combinado das três drogas era ligeiramente maior do que o aditivo nas duas linhas celulares. Estes resultados são consistentes com os resultados do teste de proliferação MTT, o que sugere que esta nova combinação de drogas pode ser eficaz na prevenção do crescimento tumoral e metástases distantes.

também demonstrado que a combinação de três drogas foi associada com apoptose celular marcada (Figura 4) e perda da capacidade invasiva (Figura 5). Num estudo anterior gefitinib não tinha actividade de agente único, mas a sua combinação com docetaxel foi associada com a mesma taxa de resposta em CaP avançado como o docetaxel em monoterapia [7]. Também tem sido mostrado que a inibição da ciclo-oxigenase-2 aumenta a apoptose induzida por docetaxel [17], que é consistente com os resultados do nosso estudo. No entanto, a longo prazo, a terapia de dose elevada com esta combinação está associado com toxicidade e efeitos colaterais que impede a sua utilização na prática clínica. docetaxel alta dose é associada a uma lesão do sistema nervoso, a repressão hematopoiéticas e quimiorresistência o que o torna adequado para un muitos pacientes com doença avançada

Importante, mostrámos que a adição de um inibidor de EGFR e de COX-2 inibidor específico para uma dose baixa de regimes docetaxel pode fornecer uma estratégia para reduzir os efeitos secundários relacionados com a dose. Simultaneamente segmentação EGFR e COX-2 parece sensibilizar as células APC, para os efeitos do docetaxel in vitro. Os nossos resultados in vivo foram consistentes com estas descobertas in vitro, indicando que o tratamento combinado é superior à de um único ou terapia de duplo agente. A combinação de quaisquer dois medicamentos, ou todas as três drogas, foi bem tolerada. Nenhuma toxicidade aguda ou tardia foi observada em qualquer dos animais.