Abstract

Introdução

Recentemente, os benefícios pleiotrópicos de terapia baseada em incretina foram relatados. Descrevemos previamente que a exendina-4, um agonista de receptor de glucagon-like peptide-1 (GLP-1), atenua o crescimento do cancro da próstata. A metformina é conhecida pelo seu efeito anti-cancro. Aqui, nós examinamos o efeito anti-cancro de Exendina-4 e metformina usando um modelo de cancro da próstata.

Métodos

células de cancro da próstata foram tratados com exendina-4 e /ou metformina. A proliferação celular foi quantificada por curvas de crescimento e de 5-bromo-2′-desoxiuridina de ensaio (BrdU). ensaio TUNEL e a proteína quinase activada AMP-fosforilação (AMPK) foram examinados em células LNCaP. Para

In vivo

experiências, as células LNCaP foram transplantadas subcutaneamente na região do flanco dos ratinhos atímicos, que foram depois tratados com exendina-4 e /ou metformina. ensaio TUNEL e imunohistoquímica foram realizados em tumores.

Resultados

A exendina-4 e metformina aditivamente diminuiu a curva de crescimento, mas não a migração, de células de cancro da próstata. O ensaio BrdU revelado que tanto a metformina Exendina-4 e diminuiu significativamente a proliferação de células de cancro da próstata. Além disso, a metformina, mas não de exendina-4, activado e AMPK induzida apoptose em células LNCaP. O efeito anti-proliferativo de metformina foi abolida pela inibição ou derrubar de AMPK.

In vivo

, Exendina-4 e metformina diminuiu significativamente o tamanho do tumor, e maior redução do tamanho do tumor significativa foi observada após o tratamento combinado. A imuno-histoquímica em tumores revelaram que a expressão P504S e Ki67 diminuiu Exendina-4 e /ou metformina, e que a expressão de fosfo-AMPK metformina e aumentou o número de células apoptóticas.

Conclusão

Estes dados sugerem que Exendina-4 e metformina atenuado o crescimento do cancro da próstata através da inibição da proliferação, e que a metformina inibiu a proliferação através da indução de apoptose. O tratamento combinado com Exendina-4 e o crescimento do cancro da próstata metformina atenuadas mais do que os tratamentos separados

citação:. Tsutsumi Y, Nomiyama t, Kawanami t, Hamaguchi Y, Y Terawaki, Tanaka, T., et ai. (2015) tratamento combinado com Exendina-4 e Crescimento Cancer Metformina Atenua próstata. PLoS ONE 10 (10): e0139709. doi: 10.1371 /journal.pone.0139709

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 28 de junho de 2015; Aceito: 16 de setembro de 2015; Publicação: 06 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tsutsumi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. MSD dotado de uma cadeira em nosso departamento e forneceu apoio sob a forma de salários para o autor, Tomoko Tanaka, PhD. No entanto, Dr. Tanaka não é um funcionário da MSD. MSD doa uma cadeira doada ao nosso departamento, e nosso departamento de empregá-la usando uma parte da subvenção da MSD. Eli Lilly forneceu apoio financeiro, como investigação conjunta. No entanto, essas empresas não têm qualquer papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Eli Lilly forneceu apoio financeiro, como investigação conjunta. MSD doa uma cadeira doada ao nosso departamento, e nosso departamento emprega autor Tomoko Tanaka, PhD usando uma parte da subvenção da MSD. TN recebeu honorários por palestras da AstraZeneca, Astellas, Boehringer Ingelheim, Eli Lilly, MSD, Novartis Pharma, Ono farmacêutica Co. Ltd., Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co. Ltd., Mitsubishi Tanabe Pharma e Sumitomo Pharma Dainippon e fundos de pesquisa de Astellas e MSD. TY foi apoiado financeiramente pela sua investigação pela MSD, Sanofi, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., a Daiichi Sankyo Company Ltd., Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd., Sanwa Química Co., Ltd., Eli Lilly, Novo Nordisk Pharma Ltd ., Novartis Pharma, Kowa Company Ltd., e Fujifilm Pharma Co., Ltd. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre dados e materiais de partilha

Abreviaturas:. Proteína quinase AMPK, AMP-ativada; AR, receptor de androgénio; DPP-4, inibidores da dipeptidil peptidase-4; Ex-4, a exendina-4; ERK-MAPK, extracelular da proteína cinase cinase activada por mitogénio regulada por sinal; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; GLP-1, o glucagon-like peptide-1; GLP-1R, receptor de GLP-1; IGF-1, insulin-like growth factor-1; mTOR, alvo da rapamicina em mamíferos; NFkB, fator nuclear kappa-light-chain-potenciador de células B ativadas; PSA, antígeno prostático de soro

Introdução

terapia baseada em incretinas, incluindo inibidores e glucagon-like receptor do peptídeo-1 agonistas (GLP-1R) dipeptidil peptidase-4 (DPP-4), tem tornar-se um popular tratamento para a diabetes tipo 2. Recentemente, muita atenção tem sido focada em incretina, devido aos seus efeitos de tecido de proteção além baixando os níveis de glicose [1]. Nós demonstramos os efeitos vasculares de protecção de Exendina-4 (ex-4), um agonista de GLP-1R, uma vez que atenua a formação da placa de ateroma em apoE

– /- ratos através da inibição da activação de NFkB em macrófagos [2], e reduziu o espessamento da íntima após lesão vascular através da proteína cinase activada por AMP (AMPK) na activação de células do músculo liso vascular [3]. Além disso, demonstraram recentemente que o inibidor de DPP-4, linagliptin, diminuição da formação da neointima após lesão vascular [4]. Assim, a terapia à base de incretina pode melhorar a qualidade de vida e taxa de mortalidade de pacientes com diabetes através de seus efeitos vasculares-protetora. No entanto, o cancro é uma outra causa principal de morte em pacientes com diabetes [5], especialmente no Japão, onde é a causa principal de morte em pacientes com diabetes tipo 2 [6]. Consequentemente, o Japão Diabetes Society e do Japão Cancer Association emitiram um aviso sobre o risco aumentado de câncer em pacientes diabéticos [7]. No entanto, o número de estudos que examinaram o efeito anti-câncer de incretina é limitado.

Recentemente, nós investigamos o efeito anti-cancro da próstata de Ex-4, tanto

in vivo

e

in vitro

[8]. Detectamos expressão GLP-1R em linhas de células de tecido de cancro da próstata e cancro da próstata humanos e Ex-4 atenuado o crescimento do câncer de próstata, tanto

in vitro

e

in vivo

através da inibição da extracelular sinal-regulada -quinase mitogen-activated protein kinase (MAPK-ERK) de activação, o que leva à inibição da proliferação de células [8]. Como meta-análise sugeriu, a relação entre câncer de próstata e diabetes ou síndrome metabólica ainda está em discussão [9-13]. No entanto, um estudo recente sugeriu que a diabetes pré-existente também está associada com maior mortalidade em pacientes com câncer de próstata, de forma semelhante a outros tipos de câncer [14]. Além disso, um estudo de follow-up em 2.546 pacientes com câncer de próstata, revelou que tanto o índice e plasma alta concentração de massa corporal peptídeo C aumentou o risco de mortalidade [15]. Além disso, já anteriormente relatado que a insulina e insulina-like growth factor-1 (IGF-1) acelera a proliferação de células de cancro da próstata através do receptor de androgénio (AR), a activação por perturbar a sua interacção directa com FoxO1 [16]. Estes dados favorecem a hipótese de que a resistência à insulina e hiperinsulinemia em estados diabéticos pré ou precoce e síndrome metabólica está associada com mau prognóstico para pacientes com câncer de próstata. No entanto, a metformina tem sido conhecido como um agente anti-diabético que também tem um efeito anti-cancro [17, 18]. Metformina atenua o crescimento do câncer indiretamente através da redução da insulinemia e concentração de IGF-1 causada pela melhora na sensibilidade à insulina, e diretamente através de parada do ciclo celular e inibição do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) após a ativação da AMPK [19]. Além disso, um exame detalhado demonstrou um efeito anti-cancro da próstata directa de metformina

in vivo

e

in vitro

[20].

No presente estudo, examinamos os efeitos anti-câncer de Ex-4 e /ou tratamento com metformina

in vivo

e

in vitro

, utilizando um modelo de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Animais

atímicos CAnN.Cg-

Foxn1nu

/CrlCrlj camundongos machos não-diabéticos foram adquiridos de Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japão) e alojados em pathogen- específica instalações sem barreiras na Universidade de Fukuoka. Os ratos foram tratados quer com solução salina (n = 10) ou Ex-4 (Sigma-Aldrich, Tóquio, Japão) em 300 pmol kg de peso corporal

dias -1

-1 (n = 10), emitido por um mini-bomba osmótica (ALZEST, modelo 1004; DURECT, Cupertino, CA, EUA), ou com metformina (indústrias Wako Pure Chemical, Ltd, Osaka, Japão) a 750 mg kg

-1 dia

-1, misturando com a alimentação (n = 10), ou combinado com metformina Ex-4 e (n = 10). Com a idade de 6 semanas, 1 × 10

6 (passagem 4-8), as células LNCaP foram misturados com 250 mL de Matrigel (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, EUA) e transplantadas subcutaneamente na região do flanco, e o bomba osmótica foi transplantada sob a pele do dorso de cada rato sob anestesia com 2% de inalação de isoflurano. Com a idade de 12 semanas, as amostras de sangue foram recolhidas, e os ratinhos foram sujeitos a eutanásia. Um rato tratado com Ex-4 morreu com a idade de 10 semanas, 4 dias após o transplante de uma nova bomba de infusão de Ex-4, por causa dos confrontos. O volume do tumor foi calculado com uma fórmula elipsóide modificado: comprimento x largura

2 × 0,52. tumores fixados em formalina e embebidos em parafina foram cortados em secções de 5 | iM e preparadas para coloração de imunofluorescência, conforme descrito anteriormente [8]. As concentrações de antigénio (PSA) de proteínas de soro de próstata em soro de ratinho foram medidos usando um EIA na SRL Inc. (Tóquio, Japão). As concentrações séricas de insulina foram medidos usando um kit EIA comprado de Morinaga Institute of Biological Science Inc. (Yokohama, Japão). Todos os procedimentos de experiências com animais foram revistos e aprovados pela subcomissão Animal Care institucional no Hospital Universitário de Fukuoka.

celular cultura e proliferação celular ensaios

As linhas de células cancerosas humanas da próstata, LNCaP, PC3 e células DU145, foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). células LNCaP e DU145 células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina, as células PC3 foram cultivadas em Ham F-12. Todos os meios foram suplementados com 10% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina. Os ensaios de proliferação celular foram realizadas como descrito anteriormente [8] com pequenas modificações. Resumidamente, as células (3 x 10

4 células /placa) foram semeadas em 3,8 cm

2 placas e mantidas num meio contendo 10% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina, com ou sem metformina 0,1-10 mM, 10 nM Ex-4, uma combinação de metformina 10 nM Ex-4 e 0,1 mM, 0,1 uM ou composto C, um inibidor de AMPK (Sigma-Aldrich). A proliferação celular foi analisada após 0-4 dias através da contagem de células utilizando um hemocitómetro. Para todas as experiências, foram usadas similarmente passadas células (passagem 4-8). As experiências foram realizadas em triplicado utilizando três diferentes preparações de células.

Bata de siRNA para baixo da expressão da AMPK e Ensaio de Proliferação celular

siRNA knock down e o ensaio de proliferação celular foram realizadas como anteriormente descrito [8] . Para knockdown AMPK, um possível alvo de metformina, foi utilizado AMPKɑ1 2 siRNA /(h) (SC-45312, Santa Cruz, Santa Cruz, EUA) e Controle siRNA (SC-36869, Santa Cruz). Para a transfecção, as células LNCaP foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

5 células /poço em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com 10 nM AMPKɑ1 /2 siRNA (h) ou ARNsi de controlo a utilizar as

® siARN Transfection Reagent (Sigma-Aldrich). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram submetidas ao ensaio de proliferação celular. Resumidamente, as células foram separadas e re-plaqueadas em placas de 12 poços de cultura de tecidos em meio completo com ou sem metformina 0,1 mM. Três dias após o tratamento, as células foram colhidas e contadas utilizando um hemocitómetro.

ensaios BrdU

Para avaliar a proliferação de células LNCaP, o bromodesoxiuridina (BrdU) ensaio de incorporação foi realizada utilizando kits de ELISA de proliferação celular ( 1647229; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), como descrito anteriormente [8]. Resumidamente, as células LNCaP com ou sem siARN transfecção foram plaqueadas a 5000 células /poço em placas de cultura de 96 cavidades em meio completo. Depois de atingir 60-70% de confluência, as células LNCaP foram tratadas com ou sem 10 nM de Ex-4, 0,1 mM de metformina, uma combinação de metformina e 10 nM a 0,1 mM Ex-4, ou composto C em meio com FBS a 10% durante 24 h . solução de BrdU (10 uM) foi adicionado durante as últimas 2 h de estimulação. Em seguida, as células foram secas e fixas, e o ADN celular foi desnaturado com solução de FixDenat (Roche Applied Science) durante 30 min à temperatura ambiente (TA). Um anti-BrdU de anticorpo monoclonal de ratinho conjugado com peroxidase (Roche Applied Science) foi adicionada às placas de cultura e incubou-se durante 90 min à temperatura ambiente. Finalmente, o substrato tetrametilbenzidina foi adicionado durante 5 min à temperatura ambiente e a absorvância das amostras foi medida utilizando um leitor de microplacas (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japão) a 450-620 nm. Valores médios são expressos como uma razão entre a proliferação de células de controlo (não tratado).

ensaios de apoptose

Para núcleos marcação das células apoptóticas, 1,5 × 10

5 células LNCaP foram plaqueadas em placas de vidro lamelas em Lab-Tek Câmara Slides (177.380; Nunc, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e fixados em paraformaldeído a 4% durante 25 min. Para pré-tratamento de tecido embebido em parafina, os cortes foram desparafinados, lavou-se com xileno e etanol e fixados em paraformaldeído a 4% durante 15 min. Cada secção foi incubada com uma solução de 20 ug /ml de proteinase K, durante 10 min, lavadas e re-fixados em paraformaldeído a 4% durante 5 min. TUNEL foi realizado utilizando o sistema de TUNEL deadend fluorométrico (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Durante a final de 24 h, as células LNCaP foram incubadas com metformina 0,1 ou 10 mM. células LNCaP tratadas com 1 unidade /100 uL de ADNase RQ1 isenta de RNase (M6101; Promega) durante 10 min foram utilizadas como um controlo positivo. Três experimentos independentes foram conduzidos.

Imunohistoquímica

Uma seção de parafina foi feita a partir do centro de um tumor. As secções de parafina foram incubadas com anticorpo anti-1R-GLP (NBP1-97308; Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA), anti-P504S anticorpo (SC-81710; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anticorpo anti-Ki67 (ab66144; Abcam , Cambridge, Reino Unido), o anticorpo anti-AR (SC-816; Santa Cruz Biotechnology Inc.) ou anticorpo anti-fosfo-AMPKα (Thr172) (# 2535; Cell Signaling, Danvers, MA, EUA). Secções analisados ​​para GLP-1Rand fosfo-AMPKα (Thr172) foram subsequentemente incubadas com Alexa Fluor de IgG anti-coelho de 488 cabra (A-11008; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), e secções analisadas para P504S, AR e de Ki67 foram subsequentemente incubadas com IgG Alexa Fluor 546 anticorpo de cabra anti-coelho (A-11010; Life Technologies). As secções foram contra-coradas com DAPI e visualizados por uma LSM710-Zen 2008 microscópio confocal (Carl Zeiss Japão MicroImaging Co., Ltd., Tóquio, Japão). Foram observadas quatro campos de uma secção, e células positivas foram contadas utilizando um hemocitómetro. Os dados são a média de quatro contagem independente numa mesma secção.

análise Western blot

transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [8]. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-mTOR (# 2983; Cell Signaling), anti-fosfo-mTOR (Ser2448) (# 2971; Cell Signaling), anti-fosfo-AMPKɑ (Thr172) (# 2535; Cell Signaling), anti-AMPKɑ (# 2532; Cell Signaling) e anti-GAPDH (SC-20375; Santa Cruz). A expressão destas proteínas foi examinado em células LNCaP que foram incubadas em meio com FBS a 10%, e subsequentemente estimuladas com ou sem 10 nM de Ex-4, metformina 0,1 mM, ou uma combinação de 10 nM Ex-4 e 0,1 mM de metformina para 24h

a migração celular ensaio

ensaio de migração celular foi realizada utilizando a migração de células de ensaio CytoSelect 24 poços colorimétrico Format (CBA-100-C; célula Biolabs)., seguindo o manual do fabricante do produto. Cada poço continha uma câmara de Boyden, com uma membrana de poro de 8-policarbonato e meios contendo FBS a 10%, com ou sem 10 nM de Ex-4, 0,1 mM de metformina, ou uma combinação de 10 nM metformina Ex-4 e 0,1 mM. As câmaras foram laminada com 1,5 × 10

5 células LNCaP ou células PC3 em meio livre de soro e incubadas a 37 ° C o excesso de noite. Células dentro poços foram lavados, e as células migratórias foram coradas e contadas usando um leitor de microplacas a OD 570 nm.

A análise estatística

Unpaired

t-

testes e um- a análise de variância (ANOVA) foram realizados para a análise estatística conforme o caso.

foram considerados P valores

abaixo de 0,05 como sendo estatisticamente significativo. Os resultados são expressos como média ± SEM.

resultados

Exendina-4 e Metformina Diminuir Prostate Cancer Crescimento aditiva

In vivo

ratos atímicos

Nós tratados, que foram transplantados com células LNCaP, administrada por via subcutânea com Ex-4, metformina alimentados por via oral ou o tratamento combinado. Após 6 semanas de tratamento, amontoa tumor estava ausente em um rato do grupo tratado com Ex-4, dois ratos do grupo tratado com metformina e três ratos do grupo de tratamento combinado. Cálculo do tamanho do tumor utilizando a fórmula elipsóide modificado revelou que o volume do tumor diminuiu de forma significativa após o tratamento com ambos Ex-4 e metformina, em comparação com o controlo, mas foi observada uma maior redução no tamanho do tumor nos ratinhos de tratamento combinado (FIG 1A e 1B). Medição do peso dos tumores formados demonstraram que o tratamento combinado com Ex-4 metformina e o peso do tumor significativamente reduzida em comparação com a do controlo e do tratamento separado com EX-4 ou metformina (Figura 1C). Estes dados sugerem que Ex-4 e metformina crescimento atenuado do câncer de próstata

in vivo

, eo tratamento combinado com os dois diminuiu ainda mais o crescimento do tumor de forma aditiva.

(A) atímicos CAnN.Cg-

Foxn1nu

/CrlCrlj ratos (com idade de 6 semanas) foram transplantados com 1 × 10

6 células LNCaP (passagem 4-8) e tratados com veículo (n = 10), Ex-4 (300 pmol kg peso corporal

-1 dia

-1; n = 9), metformina (met; 750 mg kg

-1 dia

-1; n = 10), ou um tratamento combinado de Ex- 4 e metformina (n = 10). Os tumores foram fotografadas com 12 semanas de idade. de volume (B) do tumor foi calculado pela fórmula elipsóide modificado. Unpaired

t-

testes foram realizados para calcular a significância estatística (**

P Art 0,01 vs. controlo). Nos ratinhos sem um tumor que amontoa, o volume do tumor foi calculado como de “zero”. (C) O peso do tumor foi medido em escalas. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (**

P Art 0,01 vs. controlo;

#

P Art 0,05 vs. Ex -4). Nos ratinhos sem um tumor que amontoa, o peso do tumor foi calculado como de “zero”.

Nestes ratos, o nível de peso do corpo e de glucose no plasma final foram significativamente menores no grupo tratado com metformina, em comparação com o o controlo e os grupos tratados com Ex-4 (Tabela 1). O nível de PSA no plasma diminuiu ligeiramente após Ex-4 ou metformina sozinha tratamento em comparação com o controlo, e um ainda mais e foi observada uma redução significativa após o tratamento combinado em comparação com o controlo (Tabela 1). Ex-4 aumentou significativamente o nível de insulina no soro; no entanto, o tratamento combinado Ex-4 e metformina diminuiu para o nível de controle (Tabela 1).

Exendina-4 e Metformina Diminuir a proliferação celular e aumentar GLP-1R Expressão

a análise imuno-histoquímica de secções embebidas em parafina de tumores de cancro da próstata subcutâneas demonstraram que a expressão de Ki67, que estava claramente localizada dentro do núcleo, foi suprimida de forma significativa pela Ex-4, metformina e o tratamento combinado (Fig 2A e 2B). No entanto, uma diminuição adicional na células Ki67-positivas não foi observado no grupo de tratamento combinado em comparação com os tratamentos separados. A expressão de P504S, um marcador do cancro da próstata, drasticamente diminuída pela Ex-4, metformina e o tratamento combinado (Fig 2C). Quantificação da expressão de P504S com base no número médio de células P504S-positivos dividido pelo número total de núcleos confirmou que houve uma redução significativa nas células cancerígenas após Ex-4, metformina e o tratamento combinado (figura 2D). Curiosamente, o número de células de cancro da próstata expressam GLP-1R aumentou após Ex-4 e /ou tratamento com metformina (Figura 2C). Quantificação das células proporção de GLP-1R-positivos revelou que o tratamento combinado aumentou significativamente o número de células de GLP-1R-positivos, quando comparada com o controlo (Figura 2E). Além disso, foram detectadas células AR-positivos no tumor do cancro da próstata (Figura 2F). Nenhuma mudança foi observada na expressão AR após Ex-4 e metformina tratamento no tumor do câncer de próstata (Fig 2G).

parafina-embedded secções de tumor (5 mm) foram submetidos à imuno-histoquímica para (A) Ki67, ( C) P504S e GLP-1R, e (f) Ar, e contrastadas com DAPI. Ampliação, × 400. (B) Ki67, (D) P504S, (E) GLP-1R, e (g) as células AR-positivo foram quantificadas por análise da fracção de células coradas no tumor em relação ao número total de núcleos. Os valores são expressos como uma percentagem de células positivas. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo).

Exendina-4 e metformina Attenuate do cancro da próstata proliferação celular, mas não migração celular

a seguir, examinou o efeito do Ex-4 e metformina sobre o câncer de próstata células

in vitro

. No nosso estudo anterior [8], observou-se que Ex-4 reduziu significativamente o número de células das células dependentes de androgénio humano, células LNCaP, e das células independente de androgénio humano, as células PC3 e células DU145, nas curvas de crescimento em uma de dose-dependente maneira. Semelhante ao tratamento ex-4, metformina reduziu o número de células de células LNCaP (figura 3a), as células PC3 (figura 3B) e células DU 145 (Fig 3C) de um modo dependente da dose. Além disso, o tratamento combinado de metformina 0,1 mM e 10 nM de Ex-4 aditivamente atenuou a progressão da curva de crescimento de células LNCaP (figura 3D) e células PC3 (Figura 3E), mas não de células DU145 (Figura 3F). A seguir, examinou o mecanismo pelo qual Ex-4 metformina e inibir o crescimento de células de cancro da próstata. Em primeiro lugar, foi realizado um ensaio de incorporação de BrdU para avaliar a síntese do ADN. Ex-4 e o tratamento com metformina sozinha durante 24 horas diminuiu significativamente a sintese de ADN em células LNCaP (figura 3G). Embora o tratamento com metformina sozinha não causou uma redução estatisticamente significativa na incorporação de BrdU nas células PC3 (Fig 3H), Ex-4 e metformina diminuiu incorporação de BrdU em ambas as células PC3 e DU145 células (Fig 3I), de forma semelhante às células LNCaP. O tratamento combinado de metformina e Ex-4 diminuiu ainda mais a incorporação de BrdU, sugerindo que a metformina e Ex-4 aditiva diminuição da síntese de DNA em células de câncer de próstata (Fig 3G-3I). Além disso, foi realizado um ensaio de migração de células LNCaP e células PC3. No entanto, Ex-4, metformina e o tratamento combinado não atenuou a migração celular em células LNCaP (Figura 3J). Em células PC3, observou-se uma pequena redução por meio de tratamentos, mas não foi estatisticamente significativa (Fig 3K). Estes dados sugerem que o ex-4 e metformina atenua a proliferação de células de cancro da próstata, mas não migração celular.

células LNCaP (A), (B) PC 3 e células DU145 (C) foram mantidas em meio suplementado com FBS a 10%, com ou sem metformina (0.1-10mM). Depois de 0, 24, 48, 72 e 96 h, as células foram colhidas e a proliferação celular foi analisada por contagem de células utilizando um hemocitómetro. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo). (D) As células LNCaP, (E) células PC3 e DU145 células (F) foram mantidas como descrito em A-C, mas com os tratamentos indicados. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo). (G) As células LNCaP, (H), as células PC3 e (I) células DU145 foram semeadas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços em meio suplementado com 10% de FBS e incubadas com soro fisiológico (controle), Ex-4 (10 nM), a metformina (0,1 mM), ou ambos Ex-4 (10 nM) e metformina (0,1 mM) durante 24 h. solução foi adicionado BrdU durante as últimas 2 h, e as células foram recolhidas para medição da síntese de ADN, utilizando um leitor de microplacas a 450-620 nm. Valores médios são expressos como uma razão entre a proliferação de células de controlo. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo,

#

P Art 0,05 vs. Ex-4,

††

P Art 0,01 vs. metformina). (J) e células LNCaP As células PC3 (k) foram semeadas como 1,5 × 10

5 em cada câmaras para o ensaio de migração. Depois de atracção quimio com 10% de FBS com ou com soro fisiológico (controle), Ex-4 (10 nM), a metformina (0,1 mM) ou ambos Ex-4 (10 nM) e metformina (0,1 mM), as células foram coradas e examinadas em DO570nm. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística.

Metformina induz a apoptose e atenua a proliferação celular em células de câncer de próstata através da ativação da AMPK

A seguir, examinou a apoptose utilizando o ensaio TUNEL. Apesar de as células apoptóticas não foram observadas em células LNCaP tratadas com Ex-4 no nosso estudo anterior [8], um pequeno mas significativo número de células apoptóticas foi detectada em células de 0,1 ou 10 mM tratados com metformina LNCaP (Fig 4A). Uma vez que a activação da AMPK é um dos mecanismos moleculares mais importantes pelos quais a metformina actua como um metabólico e agente anti-proliferativo [21], examinámos a fosforilação da AMPK em células LNCaP tratadas com metformina. Como mostrado na Fig 4B, AMPK foi fosforilada após o tratamento com metformina. A quantificação da banda detectada densitometria revelou uma indução significativa da fosforilação da AMPK em células LNCaP tratadas com metformina quando normalizada contra a AMPK total (Figura 4C) e o gene de manutenção da casa, GAPDH (Figura 4D). Para esclarecer se AMPK é o principal alvo de metformina para a atenuação da proliferação de células LNCaP, foi utilizado o inibidor da AMPK, Composto C, ou derrubado AMPK por siRNA. Como mostrado na Fig 4E e 4F, tanto o composto C e siAMPK claramente cancelou o efeito anti-proliferativo de metformina em células LNCaP. Além disso, tratamentos com o composto C ou siAMPK aumentou significativamente o número de células de células de LNCaP tratadas metformina. Além disso, a redução na incorporação de BrdU induzida pela metformina foi claramente abolida por tanto o composto C e siAMPK (Figura 4G e 4H), e estes tratamentos aumento da incorporação de BrdU nas células LNCaP tratadas com metformina na forma consistente com a análise da curva de crescimento. Porque o principal alvo do efeito anti-proliferativo da AMPK é inativação de mTOR, o próximo examinou a ativação de mTOR usando western blot. Como mostrado na Fig 4I, mTOR fosforilação foi suprimida pelo tratamento com metformina. No entanto, a análise de densitometria resultado mostrou que não foi estatisticamente significativa. Estes dados sugerem que a metformina induz apoptose e atenua a proliferação das células LNCaP através da activação da AMPK. Células LNCaP

(A) foram plaqueadas em lamelas de vidro em Lab-Tek 2 bem Secção slides. Após incubação com metformina 0,1 ou 10 mM durante 24 h, ou uma unidade /100 uL de ADNase RQ1 (controlo positivo) durante 10 min, as células apoptóticas foram detectados com coloração TUNEL. As imagens mostradas são representativos de três experiências independentes. células (B) LNCaP mantidas em meio com 10% de FBS foram estimuladas com soro fisiológico (controle), Ex-4 (10 nM), a metformina (0,1 mM) ou ambos Ex-4 (10 nM) e metformina (0,1 mM) durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram colhidas e submetidas a transferência de Western para avaliar a AMPK AMPK fosforilada e expressão. AMPK fosforilada /os níveis de proteína de AMPK (C) e os níveis de proteína AMPK /GAPDH fosforilados (D) foram quantificadas por densitometria. Os dados foram calculados a partir de três experiências independentes e estão apresentados como uma razão entre o controlo (*

P

0,05, **

P

0,01 vs. controlo,

#

P Art 0,05,

##

P Art 0,05 vs. Ex-4). células LNCaP (E) foram mantidas em meio suplementado com FBS a 10% com o Composto C (0,1 uM; CC) ou veículo de controlo (NT), e com ou sem Met (0,1 mM). Depois de 0, 24, 48 e 72 h, as células foram colhidas e a proliferação celular foi analisada por contagem de células utilizando um hemocitómetro. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. NT-controle,

#

P Art 0,05 vs. NT-Met 0,1 mM). células LNCaP (F) foram mantidas em meio suplementado com FBS a 10% após a transfecção de 10 nM de ARNsi de controlo (STCI) ou siRNA para AMPKα1 /2 (siAMPK) com ou sem Met (0,1 mM). Depois de 0, 24, 48 e 72 h, as células foram colhidas e a proliferação celular foi analisada por contagem de células utilizando um hemocitómetro. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (**

P Art 0,01 vs. SICT-controle,

##

P Art 0,01 vs STCI-Met 0,1 mM). (G) As células LNCaP foram plaqueadas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços em meio suplementado com 10% de FBS e incubadas com Composto C (0,1 uM) (CC) ou veículo de controlo (NT), e com ou sem Met (0,1 mM) durante 24 h. solução foi adicionado BrdU durante as últimas 2 h, e as células foram recolhidas para medição da síntese de ADN, utilizando um leitor de microplacas a 450-620 nm. Valores médios são expressos como uma razão entre a proliferação de células de controlo. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (**

P Art 0,01 vs. Met (-) e Composto C (-),

#

P

0,05 vs. Met (+) e composto C (-)). células LNCaP (H) foram plaqueadas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços em meio suplementado com FBS a 10% após a transfecção de controlo 10nM de siRNA (STCI) ou siRNA para AMPKɑ1 /2 (siAMPK) com ou sem Met ( 0,1 mM) durante 24 h. solução foi adicionado BrdU durante as últimas 2 h, e as células foram recolhidas para medição da síntese de ADN, utilizando um leitor de microplacas a 450-620 nm. Valores médios são expressos como uma razão entre a proliferação de células de controlo. Unpaired

t

-Testes foram realizados para calcular a significância estatística (**

P Art 0,01 vs. Met (-) e siControl,

##

P

0,01 vs. Met (+) e siControl)

metformina Induz AMPK activação e apoptose em câncer de próstata

In Vivo

Finalmente, para confirmar a.