Sumário
As variantes em regiões reguladoras são previstos para desempenhar um papel importante na susceptibilidade à doença de doenças comuns. Polimorfismos mapeamento de microARN (miARN) sítios de ligação têm sido mostrados para perturbar a capacidade de miARN alvo genes resultando em ARNm diferencial e a expressão da proteína.
susceptibilidade tumor de pele 5
(
Skts5
) foi identificado como uma susceptibilidade conferindo locus quimicamente induzida por câncer de pele em NIH /Ola por SPRET /retrocruzamentos F1 isogênicos. Para determinar a expressão se polimorfismos entre as cepas que mapeados para locais putativos de ligação de miRNA na região 3 ‘não traduzida (3’UTR) de genes em
Skts5
influenciado, foi realizada uma avaliação sistemática dos 3’UTRs de genes candidatos através deste local. Nove genes tinham polimorfismos em suas 3’UTRs que se encaixam os dados de ligação e oito destes polimorfismos contidos suspeitas de interferir com ou introduzir obrigatório miRNA. 3’UTRs de seis genes,
Bcap29
,
Dgkb, HBP1, Pik3cg, Twistnb
, e
Tspan13
diferencialmente afetados expressão de luciferase, mas não pareceu ser regulados diferencialmente pelos miARNs avaliadas previsto para se ligar a um e apenas um dos dois isoformas. Foram avaliadas 3’UTRs de quatro genes adicionais escolhidos de entre o locus que se encaixam critérios menos rigorosas.
Ifrd1
e
ETV1
mostraram diferenças e continha polimorfismos previstos para interromper ou criar locais de ligação de miRNA, mas não mostrou diferença na regulação pelos miRNAs testados. Em resumo, vários 3’UTRs com variantes funcionais putativos entre cepas sensíveis e resistentes de ratos influenciado expressão diferencial independente da ligação previsto miRNA
Citation:. SKEELES LE, Fleming JL, Mahler KL, Toland AE (2013) A impacto da 3’UTR variantes na expressão diferencial de genes candidatos Cancer de suscetibilidade. PLoS ONE 8 (3): e58609. doi: 10.1371 /journal.pone.0058609
editor: Akio Kanai, da Universidade Keio, Japão
Recebido: 16 de outubro de 2012; Aceito: 06 de fevereiro de 2013; Publicação: 05 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 SKEELES et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte do MGO RSG-07-083 da Sociedade americana do Câncer, CA134461 do National Cancer Institute e do Centro de Câncer OSU Comprehensive. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Dr. Toland é um editor Académica da PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Mus spretus
camundongos são resistentes ao câncer de pele em comparação com
Mus musculus
ratos. Em estudos de ligação anteriores de dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) /12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) – induzida por cancro da pele um número de cancro da pele susceptibilidade loci foram identificados em SPRET /outbred por ratinhos NIH /Ola F1 retrocruzamento [1] – [4]. Estudos de ligação também foram realizadas utilizando SPRET /EIJ por FVB /N, SPRET /EIJ pelo NIH /Ola e STF /Pas por ratos NIH /Ola F1 retrocruzamentos que identificaram loci susceptibilidade adicional. Um dos loci susceptibilidade pele,
tumor de pele susceptibilidade 5
(
Skts5
), foi encontrado no SPRET /exogâmicas pelo NIH /Ola cruzes, mas não no STF /Pas por NIH /Ola F1 ou SPRET /eij por FVB /N atravessa [3], [4]. resultados de ligação para SPRET /EIJ por NIH /Ola foram ambíguos para esta região. Análises de sequências de genes e elementos 54 de codificação ao longo de uma região de picos de ligação 14 Mb-a
Skts5
levou à identificação de um número de alterações de codificação consistentes com a ligação análises (Mahler et al. 2008).
expressão gênica diferencial é postulada como sendo tão importante, se não mais importante, para a susceptibilidade à doença, como alterações de codificação não sinónimas [5]. diferenças de expressão de genes devido a factores herdados pode ser causada por variações na potenciador ou sítios de ligação de promotores, variações na regulação epigenética impacto de metilação ou de cromatina modificações, variações na expressão de factores que actuam em trans ou a diferenças na regulação por microRNAs (miRNAs) [6] – [9]. polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que caem especificamente na região 3’untranslated (3’UTR) de genes podem interferir com a estabilidade do mRNA e tradução através dos efeitos sobre poliadenilação e regulamentar proteína-mRNA e interações miRNA-RNAm [10] – [12]. Estudos preliminares em humanos identificaram variações na 3’UTR de genes que parecem afetar o risco de câncer por perturbar miRNA normal de ligação [13], [14]. Uma tal variante no
gene KRAS2
aumenta o risco de cancro do pulmão e ovário, alterando a capacidade de miRNA
let-7
para ligar [15], [16]. Outro estudo em ratinhos olhou para sítios complementares miRNA por três miRNAs que foram introduzidas ou interrompidas por SNPs por alélicas-desequilíbrio sequenciamento [17]. As diferenças na expressão de montagem, com os dados de sequências de ARN foram observados para uma grande percentagem de genes alvo putativas, sugerindo que as variações na 3’UTRs ter um papel chave nas diferenças de expressão genética entre indivíduos.
Para determinar se polimorfismos em putativo miRNA sítios de ligação estavam afetando a expressão do gene e podem ser candidatos funcionais para
Skts5
, foi realizada uma análise sistemática das regiões 3’UTR para os genes em todo o lugar. Foram identificadas variantes de sequência em nove genes que se encaixam com a análise de ligação (foram polimórficos entre SPRET /não consanguíneos e NIH /Ola e não diferentes entre STF /PAS e NIH /Ola ou SPRET /EIJ e FVB /N). SNPs de oito desses 3’UTRs foram previstos para mapear sítios de ligação putativos microRNA. Um adicional de 18 genes foram polimórficos entre SPRET /não consanguíneos e NIH /Ola e SPRET /EIJ e FVB /N, mas não entre STF /PAS e NIH /Ola. Aqui, descrevemos os efeitos das variantes a partir destes genes de susceptibilidade candidato sobre a expressão.
Materiais e Métodos
linhas
materiais de animais e celulares
Nenhum animal de vida foram utilizados neste estudo ; DNA e tecidos existentes foram fornecidas por colaboradores ou através de fontes comerciais. A UCSF e Universidade de Roswell Park Animal Care Institucional e utilizar comités (IACUC) aprovou o animal de trabalho original, que produziu as amostras utilizadas neste estudo. origens de laboratório de cada uma das estirpes de ratinhos no estudo são as seguintes: STF /PAS (linha pura mantida pelo Instituto Pasteur), SPRET /eij (linha pura mantida por Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), não consanguíneos
spretus
(/exogâmicas linha SPRET, não consanguíneos mantido por Hiroki Nagase, Roswell Park Institute), FVB /N (linha pura mantida pelos laboratórios Jackson) e NIH /Ola (linhagem mantido por Allan Balmain). NIH /Ola e SPRET /não consanguíneos são homozigotos em todo
Skts5
. Tecidos para ratos NIH /Ola foram fornecidos pelo Dr. Allan Balmain e tecidos para SPRET /ratinhos não consanguíneos foram fornecidos por Hiroki Nagase. O ADN foi isolado a partir de baços de caudas ou SPRET /não consanguíneas e NIH /Ola ratinhos, utilizando métodos convencionais [18]. SPRET /EIJ e FVB DNA /N e os tecidos foram adquiridos a partir dos Laboratórios Jackson. STF /DNA PAS foi um presente de Xavier Montagutelli, DVM, PhD, do Instituto Pasteur. C5N, uma linha celular de queratinócitos de murino não imunogénicos obtidos a partir de Allan Balmain, foi mantida em 1x de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina antibiótico.
Sequência análise
3’UTRs do mapeamento 39 genes para
Skts5 Compra de que nós não temos dados de sequência para todas as estirpes utilizadas nas análises de ligação foram identificados utilizando o banco de dados Ensembl, constrói 35-48 . Nós projetamos iniciadores de PCR utilizando programa baseado na web SciTools PrimerQuest de Tecnologia Integrated DNA [https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest; San Diego, CA]. Os produtos de PCR foram tratados com Exo /SAP-TI (USB, Cleveland, OH) para remover o ADN de cadeia simples. sequenciação automática dos produtos de PCR foi realizada num ABI 3700 (Applied Biosystems /Life Technologies, Carlsbad, CA), através de métodos padrão. Os iniciadores utilizados para a PCR foram também utilizados para a sequenciação. Para a frente e sequência inversa leituras foram analisados e comparados usando Lasergene /DNAstar 3.0 (DNASTAR, Madison, WI). Os traços de sequência foram inspeccionadas visualmente sempre que uma substituição de nucleotídeos foi indicado.
identificação de potenciais microRNA sítios de ligação
polimorfismos 3’UTR que foram observados apenas entre NIH /Ola e SPRET /não consanguíneos foram avaliados para determinar se eles interrompida ou introduzida
in silico
locais de ligação de microRNA previstos. Quatro programas foram usados: Miranda (www.microRNA.org) [19], MicroInspector (https://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/) [20], Patrocles Finder (www.patrocles.org) [21] e MicroSNiPer (https://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper/getSeqByNM.php) [22]. Miranda permitiu-nos para prever se os nossos SNPs de interesse interrompido locais de ligação de miRNA na estirpe de referência do mouse, o que era muito semelhante ao NIH /Ola 3’UTRs. Os outros três programas permitem que sequências únicas a serem analisados para sítios de ligação de microRNA. Para os locais previstos por MicroInspector, consideramos primeiro as que tinham uma energia previu livre mínimo (MFE) superior a -15 kcal /joule de uma forma e uma MFE inferior a -20 kcal /joule na outra forma. Quando reavaliada, apenas os que foram estimados para ter um maior do que o MFE de -18 kcal /Joule, em uma forma e um MFE de -22 kcal /Joule ou menos na outra forma, como já foi utilizado anteriormente para
Mus musculus
[20], foram ainda testados experimentalmente. -22 Kcal /J ou menos foi considerado forte ligação e -18 kcal /J ou superior foi considerado nenhum ou muito fraca ligação. Patrocles e MicroSNiPer permitem a comparação de duas sequências únicas para as diferenças de sítios de ligação previstos. MicroSNiPer requer SNPs a ser inseridos no programa de previsão, assim que esta ferramenta não foi capaz de prever os sites criados ou interrompidas por inserções ou exclusões. Usando MicroInspector, Patrocles e MicroSNiPer, nós escolhemos miRNAs candidatos que foram previstos para se ligar a apenas a cepa de rato (NIH /Ola ou SPRET /não consanguíneos), que demonstraram menor expressão medida pelo nosso expressão ensaio 3’UTR luciferase e que continha uma polimorfismo no sítio de ligação do miRNA que se encaixam com os resultados de ligação mouse.
Clonagem
a secção de cada 3’UTR gene candidato que incluiu sítios polimórficos que se encaixam com a ligação do rato e foram previstos para interferir com a ligação de miARN foi clonado no vector de controlo pGL3 Clontech (mountain View, CA) (Tabela S1). O vector foi linearizado por PCR inversa (IPCR) utilizando Advantage HD Polymerase Mix (Clontech), de acordo com o protocolo do fabricante. iniciadores IPCR foram projetados usando software IDT PrimerQuest. produtos lineares foram separadas a partir do vector circular usando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Frederick, MD). iniciadores de PCR para clonagem utilizando In-fusion protocolo do kit HD clonagem de Clontech foram projetados usando software IDT PrimerQuest (Tabela S2). Os produtos de PCR foram amplificados a partir de células NIH /Ola e SPRET ADN /outbred, purificado e clonado no vector 3 ‘do gene da luciferase por recombinação utilizando o kit de clonagem in-HD Fusão de Clontech, de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA de plasmídeo foi analisado por digestão de restrição e os clones foram sequência é verificada por sequenciação de Sanger.
Site-Directed Mutagenesis
para os genes nos quais o NIH /Ola ou SPRET /outbred 3’UTR era difícil clone sítios polimórficos, que encaixam com a ligação de ratinho foram alterados por mutagénese dirigida (SDM) usando plasmídeos contendo o 3’UTR da outra estirpe como molde. primers SDM foram projetados usando Design programa Primer QuikChange de Stratagene, e SDM foi realizada utilizando QuikChange relâmpago multi Site-Directed Mutagenesis Kit de Stratagene por fabricante de condições (Agilent, Santa Clara, CA) recomendado. plasmídeos mutados foram sequência verificada.
ensaios
Transfec�es /luciferase
células C5N foram co-transfectadas com os PGL3 produtos In-Fusion, PRL-TK Renilla luciferase de pirilampo vector (Promega, Madison, WI) e pré-miRNAs ou precursores Mirvana mímica miRNA (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) para ensaios de miRNA. As transfecções foram realizadas utilizando Lipofectamine com o Plus Reagent (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island NY) para transfecções de DNA 3’UTR e Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para transfecções usando plasmídeos (600 ng /poço de cada plasmídeo) e precursores de miRNA ou controles mexidos ( 13 pmol /cavidade para uma placa de 12 poços). Vinte e quatro horas após a transfecção, a proteína foi isolado utilizando M-PER (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL), e o ARN foi isolado utilizando Ribozol (ISC BioExpress, Kaysville, UT). Para medições de luciferase, adicionou-se uma D-luciferina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mistura, que continha DTT e glicilglicina 30 ul isolados de proteína numa Vertias Microplate Luminometer utilizando o programa Veritas de Ensaio de Luciferase (Promega, Madison, WI). Para activar a reacção de uma mistura de ATP, com DTT, glicilglicina, EGTA, MgSO
4, e K2PO
4, foi adicionado. Um ensaio de repórter controle incluiu Coelenterizine nativa (NanoLight Technologies, Pinetop, AZ) com ATP, DTT, glicilglicina, EGTA, MgSO
4, e K2PO
4, adicionado a 30 ul a proteína isolada de seguir o protocolo Promega Renilla. unidade de luz relativa luciferase leituras foram normalizados para Renilla luciferase. proporções relativas de luciferase em células pseudo-transfectadas são mostrados. As transfecções e os ensaios de luciferase foram realizados um mínimo de duas vezes para cada conjunto de construções 3’UTR e ensaio de miARN com a excepção de
miR-3064-3p (
Pik3cg
), que só foi testada mostrou uma vez e resultados convincentes de não haver diferenças. Estudante testes t foram utilizados para calcular significância das diferenças de expressão.
condições experimentais adicionais foram testados para transfecções com o
Twistnb
3’UTRs juntamente com
miR-3074-5p
e /ou
miR-691
. As experiências foram realizadas como descrito acima, excepto que as células foram colhidas em C5N 24, 48, e 72 horas, utilizando uma concentração mais elevada de miARN (26 pmoles) ou ambos os miARNs juntos (26 pmoles de cada um). Uma dose mais baixa de miARN transfectadas (7 pmoles) ou ambos os miARNs juntos (7 pmol cada) também foi avaliado quanto a um efeito de
Twistnb
3’UTRs às 24 e 48 horas. Experimentos adicionais para avaliar os efeitos da
miR-3074-5p no
Twistnb
isoformas incluídos transfecções em células C5N com um anti-miRNA para
miR-3074-5p ou um inibidor de controlo negativo às 24 e 48 horas após transfecção em duas concentrações (13 pmoles e 30 pmoles).
confirmação de miRNA transfecção por PCR quantitativa (qPCR)
Para confirmar miRNA transfecção, RNA foi isolado como descrito acima. A transcrição reversa (RT) foi realizada utilizando o kit de RT MultiScribe da Applied Biosystem de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Life Technologies /Applied Biosystems, Carlsbad, CA). As sondas TaqMan qPCR para miARNs foram adquiridos a Applied Biosystems.
Sno202
foi usado para calcular a expressão relativa. qPCR foi realizado em triplicado para cada amostra. Experimentos incluído nenhum controle modelo não-RT e. limiar de ciclo de valores (CT) foram na média entre triplicados e valores CT delta foram calculados entre cada teste miRNA e controle simulada.
Identificação dos candidatos microRNA
Para refinar a nossa lista de microRNAs candidatos (miRNAs) , analisamos tanto o NIH /Ola e SPRET /formulários Endogâmicas destes sítios de ligação em duas ferramentas de previsão mínimos energia livre (MFE), RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) [23] e RNAcofold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAcofold.cgi) [24]. Nós refinado ainda mais a nossa lista de 3’UTRs candidatos para aqueles cujas SNPs foram previstos para induzir a 5 kcal /J ou maior diferença de miRNAbinding MFE entre NIH /Ola e SPRET /exogâmicas por ambas as ferramentas de previsão (Tabela S3).
Avaliação da expressão do mRNA por qPCR
para identificar genes que mostram uma expressão diferencial, o ARN foi isolado a partir de caudas de NIH /Ola e SPRET /ratinhos Endogâmicas utilizando Trizol (Invitrogen) de acordo com o fabricante do sob as condições recomendadas. Um micrograma de ARN a partir de cada animal foi revertida transcrito utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). Para avaliar a expressão do mRNA do candidato
Skts5
genes, sondas Taqman foram adquiridos da Applied Biosystems (Ciências da Life Technologies). Cada amostra foi medida em triplicado. Três genes de controle,
L19
,
Ppia
e
Hprt
, foram utilizados para calcular a expressão relativa e a diferença média de expressão foi calculado em todos os três controles. Experimentos incluem espaços em branco de água e controles não-RT. Significado da expressão diferencial foi determinada pela T-testes do estudante.
Resultados
Identificação de 3’UTRs candidatos para o estudo
Skts5
é um tumor de pele locus de susceptibilidade previamente identificado em camundongos retrocruzamentos F1 entre suscetíveis NIH /Ola e SPRET /cepas Endogâmicas [4], [25]. Ligação a este lugar não foi encontrado no retrocruzamentos F1 entre NIH /Ola e STF /PAS ou entre FVB /N e SPRET /EIJ, outras estirpes resistentes da pele de Mus spretus sugerindo que variantes de sequências potencialmente funcionais que estavam presentes na SPRET /não consanguíneos, mas não no STF /PAS ou SPRET /eIJ, poderia ser considerado como variantes candidatos. Em estudos anteriores, nós sequenciado codificação exons para 54 genes no mínimo
Skts5 e região ligação em linhagens de camundongos suscetíveis ao câncer de pele (NIH /Ola e FVB /N) e camundongos resistentes ao câncer de pele (SPRET /exogâmicas , SPRET /eIJ, STF /PAS) [4]. No nosso estudo inicial, que não completaram genotipagem de todo o 3’UTRs para todos os genes em todas as estirpes de ratinhos utilizados no estudo. Para gerar dados de sequência em falta, que sequenciou a versão mais longa 3’UTR de 39 genes para as cepas para o qual fomos falta de dados, principalmente STF /PAS. Dos genes avaliados, havia 24 polimorfismos 3’UTR de nove genes que se encaixam os dados de ligação mais conservadores na medida em que só eram polimórficos entre NIH /Ola e SPRET /não consanguíneos, mas não foram polimórficos entre STF /PAS e NIH /Ola ou entre FVB /N e SPRET /eIJ (Tabela 1).
Efeito da 3’UTR variantes na expressão
espera-se que apenas um subconjunto dos 24 polimorfismos 3’UTR faria se prever que alteram a ligação miARN. Para identificar esses SNPs, entramos tanto o NIH /Ola e SPRET /sequências Endogâmicas em dois programas de miRNA de previsão de ligação, MicroInspector [20] e Miranda [19]. Quinze polimorfismos foram predisposição para afetar a ligação miRNA.
Cbll1
era o único gene com uma variante 3’UTR montagem da ligação que não têm pelo menos um candidato SNP previsto para interromper ou introduzir um local de miARN (Tabela 2; Tabela S3; Figura S1).
para determinar se 3’UTRs polimorfismos afetados expressão, nós clonados fragmentos dos 3’UTRs de 245 a 1652 pb de tamanho que continha as variantes de interesse para os oito genes com os polimorfismos de ajuste dos dados de ligação e previu para interferir com a ligação de miARN (Tabela S1). A 3’UTR para
Cbll1
também foi clonado. Seguindo a clonagem de fragmentos 3’UTR de
Bcap29
,
Cbll1
,
Dgkb
,
HBP1
,
Meox2
,
Pik3cg
,
Stxbp1
,
Tspan13
, e
Twistnb
, no vetor de controle de pGL3 luciferase, nós transfectadas as construções em células de queratinócitos normais C5N e medidos os níveis de luciferase das duas isoformas. Colocámos a hipótese de que se a variante dentro da 3 ‘UTR foi previsto que mostram ligação apenas numa estirpe de miARN, não deve ser inferior a expressão de luciferase em comparação com a variante não previsto para se ligar a miARN. As regiões não traduzidas para
Bcap29
,
Dgkb
,
HBP1, Pik3cg
,
Stxbp1
, e
Twistnb
tiveram sítios polimórficos que foram previstos para ambos os sítios de ligação de miRNA putativos introduzir e perturbam. Assim, para esses seis genes, não era claro como o polimorfismo pode afetar a expressão. Dos nove 3’UTRs avaliadas, seis apresentaram expressão da luciferase diferencial estatisticamente significativa entre as estirpes (Figura 1 e os dados não mostrados). As diferenças mais acentuadas na expressão de luciferase foram nos 3’UTRs de
HBP1
e
Bcap29
(Figura 1). Para muitos dos genes, ambas as isoformas 3’UTR mostrou diminuição da expressão de luciferase em comparação com o vector pGL3 sugerindo que miARNs ou outros mecanismos de regulação têm efeitos sobre ambas as formas 3’UTR.
unidades relativas de luciferase normalizada para representativos simuladas para o vetor luciferase pGL3 (cinza escuro), NIH 3’UTR (preto) e SPRET /exogâmicas 3’UTRs (cinza claro) por seis genes são mostrados. Os valores P de expressão diferencial entre NIH /Ola e SPRET /não consanguíneos são indicados. A.
Bcap29
; B.
Dgkb
; C.
HBP1
; D.
Pik3cg
; E.
Twistnb
; F.
Tspan13
.
Identificação de variantes que afetam sítios de ligação putativos microRNA
Como variantes nas regiões 3’UTR foram mostrados para afetar a ligação miRNA e gene posterior e expressão da proteína [15], [16], a hipótese de que 3’UTR variantes de ajuste dos dados de ligação poderia afectar a regulação de genes e, portanto, afetar a diferença de suscetibilidade ao câncer entre NIH /Ola e SPRET ratos /isogênicos. Seis dos nove 3’UTRs avaliado,
Bcap29
,
Dgkb
,
HBP1
,
Pik3cg
,
Twistnb
e
Tspan1
, mostrou expressão de luciferase diferencial entre NIH /Ola e SPRET /não consanguíneos, ainda que muitos destes tinham múltiplos SNPs que foram previstos para afectar a ligação, queríamos priorizar quais SNPs e miRNAs foram mais propensos a fazer isso. Além disso, como alguns SNPs foram previamente determinado para tanto apresentar e interromper locais de ligação potenciais, queríamos usar os nossos dados de luciferase para escolher miRNAs que se encaixam os dados de expressão. Para refinar ainda mais a nossa lista SNP candidato e escolha potenciais miRNAs para o estudo, sequência de 3’UTRs de genes com variantes candidatos foram avaliados através de programas adicionais de previsão de ligação de miRNA Patrocles e MicroSNiPer. Nós também utilizado MicroInspector, para identificar locais de ligação com um MFE inferior a -22 kcal /J, de uma forma (forte ligação) e maior do que -18 kcal /j na outra forma (fraca ou nenhuma ligação), tal como recomendado para Mus musculus [20]. Para todos os locais de ligação previstos miARN, determinou-se em que extensão o polimorfismo foi previsto para afectar a força de ligação. Usando RNAhybrid e RNAcofold, calculamos a energia livre de ligação dos miRNAs putativos. Testamos diferenças de todas as interacções de miARN que mostraram diferenças de preditos maior do que 5 kcal /J entre as duas formas variantes em ambas as ferramentas de previsão de expressão. Todos os seis genes com variantes que se encaixam os dados de ligação e que demonstraram diferenças na expressão da luciferase tinha variantes com diferenças significativas na previu livre de ligação de miARN, alguns dos quais continham SNPs na região de semente previsto (Tabela 2, Figura S1).
Efeito de microRNAs na expressão
Para determinar se os miRNAs preditos poderiam influenciar diferenças expressão de luciferase de
Bcap29
,
Dgkb
,
HBP1
,
Pik3cg
,
Twistnb
e
Tspan13
, nós células C5N co-transfectadas com o NIH /Ola ou SPRET /construções de luciferase isogênicos e um precursor miRNA previsto para vincular para as variantes consistentes com a ligação e os nossos dados de expressão de luciferase inicial (Tabela 2). Nós escolhemos 13 miRNAs candidatos para avaliação. Começamos nossos estudos apenas por avaliar a isoforma previsto para ficar vinculado pelo miRNA e avaliados ambas as isoformas quando vimos um efeito na direção esperada do miRNA sobre os níveis de luciferase. miRNAs para
Pik3cg
(
miR-707
),
HBP1
(
miR-127
,
miR-183
e
miR-873
),
Twistnb
(
miR-718
, e
miR-691
), e
Dgkb
(
miR-489
) não teve impacto sobre a expressão da luciferase (Figura 2A e dados não mostrados).
miR-1940
com o
Tspan13
3’UTR e
miR-31
com o
HBP1
3’UTR diminuição da expressão de luciferase de ambas as isoformas semelhante sugerindo que estes miARNs ligados os 3’UTRs para o mesmo grau (Figura 2B e dados não mostrados). Outros miRNAs,
miR-128 (Bcap29), miR-3064-3p (Pik3cg)
,
miR-3074-5p (
Twistnb
) e
miR -485 (Dgkb)
diminuiu a expressão de luciferase do vector vazio de controlo pGL3 para o mesmo grau que o vector que contém o 3’UTR clonado (Figura 2C e dados não mostrados). Estes dados sugerem que os miRNAs que escolhemos para análise não foram responsáveis pelas diferenças observadas na expressão de luciferase entre SPRET /não consanguíneos e NIH /Ola.
experimentos representativos que mostram nenhum efeito de miRNA na expressão de luciferase e efeitos semelhantes da miARN em ambas as isoformas são mostrados. A.
Dgkb
3’UTR com
miR-489
; B.
Tspan13
3’UTR com
miR-1940; C. Dgkb com miR-485
. pGL3, pGL3 vector luciferase sem inserção; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /exogâmicas 3’UTR; NC, mexidos miRNA de controle; barras cinza escuro, pGL3 luciferase vector; barras pretas, vector pGL3 com o NIH /Ola 3’UTR; barras cinza claro, vector pGL3 contendo a SPRET /exogâmicas 3’UTR.
Para descartar a possibilidade de que nos faltava efeitos diferenciais dos miRNAs na expressão de luciferase por causa das condições experimentais utilizadas, avaliamos
Twistnb
3’UTR usando doses adicionais de miRNAs
miR-3074-5p e
miR-691
e pontos de tempo adicionais após a transfecção. Este 3 ‘UTR foi escolhido para estudo mais detalhado por conter variantes previsto para se ligar à região de semente de ambos estes miARN (Figura S1). Foi observado não haver diferenças no efeito dos miARNs em comparação com as nossas experiências iniciais (Figura 3A, 3B e dados não mostrados). Como miRNAs podem atuar em combinação, também avaliamos
miR-3074-5p e
miR-691
em combinação no
Twistnb
3’UTR NIH /Ola e SPRET /isoformas não consanguíneos e descobriu que os resultados para a combinação de
miR-691 Comprar e
miR-3074-5p
foram idênticos aos do
miR-3074-5p
sozinho (Figura 3A, 3B e dados não mostrados). Estes resultados sugerem que os nossos dados não é susceptível de ser um artefato das condições experimentais utilizadas.
experimentos representativos mostrando efeito não específico de
miR-3074-5p e /ou
miR-691
em ambas as isoformas de
Twistnb
são mostrados em uma transfecção dose baixa de precursores de miRNA. A.
Twistnb
3’UTRs às 24 horas pós-transfecção com
miR-3074-5p,
miR-691
ou ambos os miRNAs. B.
Twistnb
3’UTRs às 48 horas pós-transfecção com
miR-3074-5p,
miR-691
ou ambos os miRNAs. pGL3, pGL3 vector luciferase sem inserção; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /exogâmicas 3’UTR; NC, mexidos miRNA de controle; barras cinza escuro, pGL3 luciferase vector; barras pretas, vector pGL3 com o NIH /Ola 3’UTR; barras cinza claro, vector pGL3 contendo a SPRET /exogâmicas 3’UTR.
Para melhor avaliar o efeito da
miR-3074-5p em pGL3 e NIH /Ola e SPRET /consanguíneos
Twistnb
3’UTRs, nós transfectado um inibidor para a
miR-3074-5p
e expressão em comparação com um inibidor de controlo negativo e
miR-3074-5p. Se os miRNA foram alvo diretamente o SPRET previu /exogâmicas
Twistnb
isoforma e o efeito observado no vector pGL3 eo NIH /Ola
Twistnb
eram efeitos não específicos (Figura 3A e B) , seria de esperar que a adição do inibidor iria ter o maior efeito sobre o vector pGL3 com o SPRET /outbred 3’UTR. A adição do anti
miR-3074-5p
mostrou o maior aumento de vezes na expressão de luciferase do vector pGL3 e mostraram aumentos não específicos na expressão do SPRET /não consanguíneas e NIH /Ola isoformas sugerindo que a reduzida expressão da luciferase é não-específico (dados não mostrados).
é possível que miARNs endógenos podem ser exercendo máxima knock-down e adição de miARN precursor para nossas células C5N não induziria diminuições adicionais na expressão de luciferase. Para avaliar esta possibilidade medimos expressão miRNA do nosso RNA colhidas a partir de células C5N que estavam mock-transfectadas. É de notar que todos os miARNs avaliados apresentaram evidência de expressão no não-transfectadas por qPCR, mas a maioria destes foram expressos em níveis relativos de 1% ou menos do controlo,
sno-202
. Assim, para a maioria dos miARNs neste estudo, os níveis endógenos de expressão nas células C5N não são susceptíveis de causar Queda máxima da 3’UTR de destino previsto. MicroRNAs que apresentaram maior nível de expressão endógena incluídos
miR-31
(252% do controle),
miR-183
(12,5% do controle),
miR-675-3p
(2,2% do controle) e
miR-3074-5p (3,7% do controle).
expressão de mRNA de genes alvo candidatos
Um dos efeitos da miRNA ligação a ARNm é a degradação do produto de ARNm e expressão diminuída. Genes de mapeamento para
Skts5
foram avaliados por qPCR para determinar se havia diferenças na mRNA rabo entre NIH /Ola e SPRET /não consanguíneos. Dos genes testados contendo variantes 3’UTR candidato encontramos diferenças significativas na expressão de mRNA em
Bcap29
,
HBP1
,
Pik3cg
,
Twistnb e Tspan13
, mas não há diferenças significativas na expressão de
Dgkb
e
Meox2
(Figura 4 e dados não mostrados). Expressão para
Stxbp6
era demasiado baixo para comparação. Genes que mostraram resultados consistentes entre os ensaios de expressão de luciferase e da qPCR são
Bcap29
(maior expressão na NIH /Ola),
HBP1
(maior expressão em SPRET /não consanguíneos),
Meox2
(sem diferença significativa na expressão),
Twistnb
(maior expressão no NIH /Ola) e
Tspan13
(maior expressão no SPRET /exogâmicas).
Bcap29
apresentou o maior grau de diferença, cerca de 15 vezes maior expressão no NIH /Ola do que SPRET /não consanguíneos (Figura 4).
Dgkb
mostrou nenhuma diferença significativa na expressão de mRNA, mas maior expressão luciferase do NIH 3’UTR.
Pik3cg
apresentaram maior expressão de mRNA SPRET /não consanguíneos, mas menor expressão de luciferase. Assim, cinco dos sete genes avaliadas por qPCR mostraram padrões de expressão de mRNA e consistentes entre o efeito da expressão de luciferase em 3’UTR. Como miARNs funcionar em dois modos, um ARNm, aumentando a degradação e a outra por interferência com a tradução, é possível que não houve diferença na expressão de mRNA que ser observado mesmo quando a ligação diferencial miARN ocorre [26], [27].
Quantitative PCR de sete genes avaliados para expressão de luciferase diferencial entre SPRET /não consanguíneos e NIH /Ola 3’UTR são mostrados.