Abstract

O efeito da prevenção papilomavírus humano (HPV) de vacinação na redução do câncer cervical (CC) fardo não será conhecido por 30 anos. Portanto, ainda é necessário melhorar os procedimentos para o rastreio CC e tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar alvos celulares que poderiam ser considerados potenciais marcadores para rastreamento ou alvos terapêuticos. Utilizou-se uma estratégia piramidal. Inicialmente, a expressão de 8.638 genes foi comparada entre 43 CCs HPV16-positivos e 12 epitélios cervicais saudáveis, utilizando microarrays. Um total de 997 genes foram desregulada, e 21 genes que mostraram a maior desregulação foram validados utilizando qRT-PCR. Os 6 genes mais upregulated (

CCNB2, CDC20, PRC1, SYCP2, NUSAP1

,

CDKN3

) pertencem à via mitose. Eles foram ainda explorados em 29 neoplasias de baixo grau intra-epitelial cervical (CIN1) e 21 de alto grau CIN (CIN2 /3) para investigar se eles poderiam diferenciar CC e CIN2 /3 (CIN2 +) a partir CIN1 e controles.

CCNB2

,

PRC1

, e

SYCP2

foram maioritariamente associados a CC e

CDC20

,

NUSAP1

, e

CDKN3

também foram associados com CIN2 /3. A sensibilidade e especificidade do

CDKN3

e

NUSAP1

para detectar CIN2 + foi de aproximadamente 90%. As proteínas codificadas pelos genes de todos os 6 foram mostradas regulada positivamente em CC por imuno-histoquímica. A associação desses marcadores com a sobrevivência foi investigada em 42 pacientes CC acompanhados por pelo menos 42 meses. Só

CDKN3

foi associada a menor sobrevida e foi independente do estágio clínico (HR = 5,9; IC95% = 1,4-23,8, p = 0,01).

CDKN3

e

NUSAP1

podem ser potenciais alvos para o desenvolvimento de métodos de rastreio. No entanto, são necessários mais estudos com amostras maiores para definir a sensibilidade e especificidade ideal. A inibição da mitose é uma estratégia bem conhecida para combater os cancros. Portanto,

CDKN3

pode ser não apenas um marcador de rastreio e sobrevivência, mas um potencial alvo terapêutico em CC. No entanto, se é indispensável para o crescimento do tumor continua a ser demonstrada

Citation:. Espinosa AM, Alfaro A, Roman-Basaure E, Guardado-Estrada M, Palma Í, Serralde C, et al. (2013) A mitose é uma fonte de potenciais marcadores para triagem e Sobrevivência e alvos terapêuticos no câncer cervical. PLoS ONE 8 (2): e55975. doi: 10.1371 /journal.pone.0055975

Autor: Michael Scheurer, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2012; Aceito: 04 de janeiro de 2013; Publicação: 06 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Espinosa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT, www.conacyt.mx), conceder números 8135 /A1, 24341 (JB) e 80680 (a SK), e da Universidade Nacional do México (www.unam.mx ), número do auxílio SDI.PTID.05.2 (a JB). AME, AA e IMM foram destinatários de uma bolsa de estudos do CONACYT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o vírus do papiloma humano (HPV) é o principal factor causal para o desenvolvimento de cancro cervical invasivo (CC), e HPV é encontrado em quase 100% destes tumores [1], [2]. CC resultados da progressão da neoplasia intra-epitelial cervical pré-invasivas (CIN), que é histologicamente classificados em leve (CIN 1), moderado (NIC 2) ou grave (3 CIN) displasia. CC ocorre principalmente a partir de CIN3 e CIN2, mas raramente de CIN1; as taxas de progressão destas lesões estimados para CC são de 12%, 5% e 1%, respectivamente, [3]. Actualmente, existem vacinas no mercado que previnem a infecção por HPV tipos oncogénicos 16 e 18, que estão associadas com 65-70% de CCs em todo o mundo [4]. Estas vacinas têm uma eficiência muito alta para a prevenção da infecção e ao desenvolvimento de neoplasias intra-epiteliais cervicais de elevado grau (CIN2 /CIN3) [5], [6]. No entanto, as mulheres vacinadas devem ainda participar de programas de detecção precoce de CC uma vez que estas vacinas só proteger contra certos tipos de vírus, e ainda não se sabe quanto tempo a proteção imunológica contra os restos de vírus alvo [7], [8]. Em muitos países, as vacinas preventivas para HPV 16 e 18 foram incorporadas ao programa nacional de vacinação, para meninas de 9 a 12 anos de idade [9], [10]. No entanto, porque o pico de incidência de CC ocorre em mulheres de 45-50 anos de idade, o efeito destes programas de vacinação preventiva em reduzir a prevalência de CC não será conhecida há 30 anos. Portanto, é necessário melhorar os procedimentos para o rastreio CC e tratamento. Porque a cada ano 530 000 novos casos de CC e 275 CC 000 mortes são relatados em todo o mundo, a incidência de taxa de mortalidade é de aproximadamente 50% [11], [12].

Por muitos anos, o Papanicolaou (Pap) teste tem sido o procedimento de triagem mais importante para a detecção precoce de CC, e a sua aplicação em massa em países desenvolvidos diminuiu a incidência de CC em mais de 50% nos últimos 40 anos [13]. Mulheres com Paps anormais são encaminhadas para a colposcopia para confirmar, rejeitar ou esclarecer o diagnóstico com um estudo histopatológico. No entanto, a sensibilidade média da citologia para a detecção de lesões CIN é de 50-60%; Embora a especificidade é muito elevada, cerca de 90% [14]. Uma vez que o HPV é indispensável para o desenvolvimento de CC, vários procedimentos para detectar o genoma de HPV foram incorporados rastreio CC. Em comparação com a citologia convencional, HPV teste de DNA tem maior sensibilidade, mas menor especificidade para a detecção de lesões CIN2 ou superior (CIN2 +). A elevada sensibilidade e alto valor preditivo negativo (NPV) de testes de ADN de HPV para a detecção de lesões CIN2 + sugerem que ele pode ser usado para prolongar os intervalos de rastreio. No entanto, a baixa especificidade dos testes de DNA do HPV iria aumentar o número de testes de acompanhamento e encaminhamento de colposcopia, o que aumentaria o custo da triagem [15]. Portanto, a necessidade de desenvolver novos métodos para a detecção precoce de CC, com elevada sensibilidade e especificidade é clara. Vários marcadores tumorais associados com CIN2 + foram identificadas, especialmente

CDKN2A,

TOP2A

, e

MCM2

. No entanto, estes marcadores não têm sido propostos para o rastreio, mas para o diagnóstico, prognóstico ou tratamento clínico [11], [16].

cancro cervical invasivo é actualmente tratada com cirurgia, quimioterapia, radioterapia, ou uma combinação destas terapias, dependendo do estágio clínico da doença. O sucesso destas terapias convencionais e sobrevida do paciente diminui à medida que a doença progride para estágios mais avançados [17]. Na verdade, a percentagem de mulheres que sobrevivem 5 anos diminui de 93% para o estágio IA a 15% para estágio IVB (www.cancer.org). Em contraste com outros tipos de câncer, para os quais vários medicamentos moleculares específicos foram desenvolvidos [18], não há terapias moleculares-alvo específicos para CC. A maioria das drogas contra alvos específicos no cancro são dirigidas para proteínas mutadas, especialmente cinases de proteína [19]; No entanto, alguns medicamentos alvo proteínas normais que são sobre-expressos, tais como HER2 /neu no cancro da mama [20], [21]. O primeiro passo no desenvolvimento de uma droga molecular específica é identificar alvos moleculares universais que estão presentes em pacientes com CC e ausente em mulheres saudáveis.

O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar alvos celulares presentes na maioria dos CCs e ausente de tecido cervical normal que diferem bastante entre os 2 grupos de ser considerados quer como potenciais marcadores para a triagem, com uma sensibilidade e uma especificidade de quase 100%, ou como alvos terapêuticos potenciais.

Métodos

Ética Declaração

o protocolo de estudo foi aprovado pelas Comissões científica e de Ética do Hospital Geral de Mexico (número de aprovação DIC /03/311/04/051) e foi realizada de acordo com os princípios éticos descritos 1964 Declaração de Helsinki. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da sua inclusão no estudo.

assuntos, amostras e Experimental Design by

Os sujeitos do estudo incluiu 69 pacientes com câncer cervical invasivo (CC) diagnosticada em o Departamento de Oncologia, 29 pacientes com baixo grau CIN (CIN1), 21 pacientes com NIC de alto grau (NIC2 e CIN3), e 25 mulheres, com o epitélio cervical normal avaliada no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital Geral de México na Cidade do México. As amostras CC eram um subconjunto selecionado de um total de 462 pacientes com CC que foram recrutados sequencialmente a partir de novembro de 2003 a julho de 2007, o que representou cerca de 80% dos pacientes recém-diagnosticados com CC durante este período devido aos critérios de inclusão restritivas (sem prévia tratamento, caso incidente, nascido no México, com ascendência mexicana para 2 gerações). Os critérios de selecção para o subconjunto CC foram baseados na disponibilidade de uma biópsia de tumor fresco para a extracção de RNA com células de tumor mais de 70% na análise morfológica (veja abaixo), na maior parte FIGO estágios I /II e tipo viral. Este subconjunto incluiu 47 amostras positivas para HPV16 e 22 amostras positivas para outros tipos de vírus, incluindo HPV18, 31, 33, 45, 51, 58 e 59. Entre eles, 54 amostras eram de carcinomas de células escamosas, 14 amostras eram de adenocarcinomas, e 1 amostra era de um carcinoma adeno. A idade média dos pacientes com câncer foi de 48 anos (variação de 23-78 anos; Tabela S1). Todos os pacientes receberam avaliações clínicas completas. Os tumores de pacientes CC foram encenadas de acordo com o último protocolo revisto internacional para câncer ginecológico [22]. Uma ou duas biópsias, conduzidas sob exame colposcopia, foram retiradas de tumores. Uma biópsia foi dividido em 2 partes iguais, uma parte foi fixada em formol tamponado para a análise morfológica e o outro, em conjunto com a segunda biopsia, foi congelados instantaneamente em gelo seco e armazenadas a -80 ° C até à análise. Todos os pacientes CC foram encaminhados para cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou uma combinação destes tratamentos de acordo com as diretrizes da American Cancer Society (ver abaixo). amostras cervicais de controle foram obtidos de pacientes submetidas a histerectomia devido a miomatose no Serviço de Ginecologia do Hospital Geral de Mexico. Eles foram previamente diagnosticados com um colo normal por citologia e colposcopia. Imediatamente após receber um fragmento de colo do útero da sala de cirurgia, os epitélios exocervical e endocervicais foram dissecadas sob um microscópio estereoscópico para evitar as células estromais. Os tecidos foram então congelados rapidamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Para a detecção de HPV e tipagem, uma raspagem de endocérvix e ectocérvix foi recolhido com um cytobrush dos pacientes e controlos, as células foram suspensas num frasco com tampão de extracção, e, em seguida, armazenada a -20 ° C até à análise. Análise da expressão génica global (8.638 genes) foi realizada em RNA extraído a partir de 43 biópsias de tumores positivos para HPV16 frescos e a partir de 12 amostras de epitélio cervical normal utilizando o microarray de HG-focagem. expressão gênica global foi validado em 24 amostras, incluindo 19 CCs e 5 controles epitélio cervical, por um segundo microarray rendimento elevado (HG-ST1.0). Os 23 genes que mostraram a maior desregulação foram validados por PCR em tempo real (qRT-PCR) em 44 amostras de 25 CC e de controlo de HPV16-positiva. Os 6 genes mais diferencialmente expressos (

CCNB2

,

CDC20

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

, e

CDKN3

) foram mais explorado em 29 neoplasias de baixo grau intra-epitelial cervical (CIN1) e 21 de alto grau CIN (CIN2 /3) para investigar se eles poderiam diferenciar CC e CIN2 /3 (CIN2 +) a partir CIN1 e controles. A imuno-histoquímica (IH) foi realizado por 10 proteínas seleccionadas em 26 amostras de CC e 10 amostras de controlo. A associação de 9 marcadores com a sobrevivência foi investigado por análise de sobrevida de 42 pacientes com CC HPV16-positivos que foram acompanhados durante pelo menos 42 meses.

DNA e RNA Isolation

O ADN foi purificado a partir de arranhões cervicais e alguns espécimes de biópsia, utilizando o ADN genómico PureLink Kit (Invitrogen, Grand Island NY) e mantidos a -20 ° C até à análise. O ARN total foi isolado a partir de uma metade da biópsia dividido utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade do RNA foi confirmada por electroforese em gel de agarose, como foi demonstrado pela presença de ARN ribossómico intacto, com a banda 28s duas vezes tão intensa quanto a banda 18s.

Detecção e HPV Typing

detecção do HPV foi realizada por PCR usando primers universais localizados na HPV

gene L1

MY09

/

MY11

,

GP5

+ /

6 +

, e

L1C1

como descrito anteriormente [23] – [25]. O

gene HBB

foi usado como um controlo interno para avaliar a qualidade do DNA. Os tipos de HPV foram identificados por sequenciação das bandas amplificadas em amostras positivas utilizando um método de ciclo de sequenciação fluorescente (kit BigDye Terminator Pronto Reacção, Applied Biosystems, Foster City, CA). A análise de sequência foi realizada utilizando um analisador genético ABI PRISM 3130XL (Applied Biosystems). Cada sequência a partir das amostras positivas de HPV foram analisados ​​com a ferramenta sequência FASTA semelhança [26]. A identidade percentual médio destas sequências para os tipos de HPV foi de 98,7% (intervalo de 91-100%).

Profiling Gene Expression e Análise de Dados

O perfil de 43 CCs positivos para HPV16 expressão gênica e 12 controles saudáveis ​​epitélios cervicais foi examinada usando o Human Gene Focus (HG Focus) oligonucleotídeo Microarray (MA) (Affymetrix, Santa Clara, CA). Esta matriz contém 8,794 conjuntos de sondas correspondentes aos genes humanos 8.638 caracterizado por a base de dados de genes de referência. preparação de ARN total (10 ug), a síntese de ARNc marcado com, hibridação, digitalização e análise de imagem foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante (Affymetrix GeneChip manual do Ensaio de expressão). Para avaliar a qualidade das experiências, utilizaram-se os seguintes parâmetros: aumento da expressão dos controlos de poli-A exógenos (Lys Phe Thr DAP), na presença de B2 oligo usado para fazer alinhamentos de grade de fundo com uma gama aceitável de 20 para 100, igual ruído em todas as amostras, a percentagem de presente chama superior a 50%, uma ‘/5’ proporção 3 de um gene constitutivo (GAPDH ou β-actina) inferior a 3, e o aumento da expressão dos controlos de hibridação (BIOB BIOC biod CRE). Foram analisados ​​apenas os MAs com controles ideais de qualidade. Além disso, algumas amostras foram realizadas em duplicado para avaliar a reprodutibilidade da experiência, que foi superior a 99%.

valores de intensidade MA foram normalizados utilizando o algoritmo robusto Multichip médio (RMA) usando o software FlexArray [27]. Os valores de intensidade normalizados foram referidos como unidades de intensidade (IU). Genes expressos de forma diferente entre os tumores e os controles foram identificados usando a análise de algoritmos Significado de Microarrays (SAM versão 3.0, https://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) usando os valores de corte de uma mudança vezes ( FC) de ≥1.5, uma taxa falsa descoberta geral (FDR) de 1%, e um FDR locais de 10% [28]. agrupamento hierárquico não supervisionado e análise de componentes principais (PCA) foram realizadas utilizando software dChip (versão 1.6, www.dCHIP.org) e linguagem R na plataforma de Java, respectivamente.

Validação de Gene Expression global por uma segunda alta capacidade microarray (HG-ST1.0)

o perfil das 24 amostras exploradas com o microarray HG-Focus, incluindo 19 CCs e 5 controles epitélio cervical, também foi examinada usando o gene humano 1.0 ST oligonucleotídeo microarray de expressão gênica ( Affymetrix, Santa Clara, CA). Esta matriz contém 33,297 conjuntos de sondas que correspondem a cerca de 20.741 genes da base de dados de referência gene humano de acordo com o navegador UCSC Genome Assembleia março 2006 NCBI 36 /hg18, disponível em https://genome.ucsc.edu/. preparação de ARN total (300 ng), a síntese de ADN marcado, hibridação, digitalização e análise de imagem foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante (Affymetrix GeneChip manual do Ensaio de expressão). Para avaliar a qualidade das experiências, utilizaram-se os seguintes parâmetros: expressão dos controlos exógenos de poli-A, a presença de B2 oligo usado para fazer alinhamentos de grade, e área sob a curva (AUC) valores acima de 0,8. Foram analisados ​​apenas os microarrays com controles ideais de qualidade. Microarrays foram normalizados utilizando o algoritmo de RMA no console expressão Affymetrix. Os valores de intensidade normalizados foram referidos como unidades de intensidade (IU). As intensidades normalizadas (log

2 valores) dos 8.370 genes que foram examinados em ambos os microarrays (HG ST1 e HG Focus) foram comparados, e o nível de correlação foi avaliada com coeficiente de correlação de Pearson.

Validação da expressão génica global por real-time PCR quantitativa retrotranscrição (qRT-PCR)

a transcrição reversa do RNA total foi realizada utilizando o kit High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems) num volume total de 20 uL. A mistura incluía 2 mg de RNA, 2 uL de tampão 10 × RT, 0,8 ul de dNTPs 100 mM, 2 ul de 10 × RT aleatórios iniciadores, 1 mL de MultiScribe ™ transcriptase inversa (5 U /uL), e 1 uL de inibidor de RNase (2 U /mL). As reacções foram incubadas a 37 ° C durante 120 minutos, e, em seguida, armazenada a -20 ° C. Um conjunto de 23 genes foi utilizado para validar a expressão do gene em 44 CC HPV16-positivo e 25 amostras de controlo saudáveis ​​com epitélio cervical qRT-PCR utilizando sondas TaqMan. Os genes incluídos são

CCNB2, CDC2, CDC20, CDKN2A, CDKN3, CKS2, MCM2, MKI67, NUSAP1, PCNA, PRC1, RFC4, RRM2, SMC4, SYCP2, TOP2A, Tyms, ZWINT, CFD, EDN3, NDN, SLC18A2 de viajantes e

WISP2

.

GAPDH

foi utilizado como controle interno. Os ensaios de expressão de genes TaqMan foram usadas (Tabela S2; Applied Biosystems). Sete genes também foram explorados em 22 CC positivo para outros HPVs (

CCNB2

,

CDC20

,

CDKN3

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

,

Tyms

), eo primeiro 6 deles, juntamente com

CDKN2A

,

PCNA

,

MKI67

genes, foram ainda explorados em 29 CINs de baixo grau e 21 CINs de alto grau. Os experimentos foram realizados em duplicado num volume final de 20? L, dos quais 200 ng de ADNc molde, 10 mL de 2 × TaqMan Universal Master Mix de PCR (Applied Biosystems), 1 mL de 20 × TaqMan Gene Expression Assay, e 7 mL de livre de RNase água. O programa de ciclos foi executado num rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Austrália), o qual foi definido como se segue: um passo de activação inicial de PCR a 50 ° C durante 2 minutos seguido de 95 ° C durante 10 min, em seguida 40 ciclos de ponto de fusão a 95 ° C durante 15 s e emparelhamento /extensão a 60 ° C durante 1 min. A média dos desvios padrão Ct em duplicados oscilaram entre 0,09 e 0,24 (média = 0.16) entre os 23 genes, o que sugere que as variações entre os duplicados foram muito pequenos [29]. Medição da expressão do gene foi com base nas curvas padrão relativos construídos a partir de um pool de 10 vezes diluído em série de CC ou cDNAs epiteliais cervicais normais compreendida entre 500 e de 0,05 ng. A primeira curva foi utilizada para calcular os valores de genes regulados positivamente e a segunda curva os valores de genes regulados negativamente. Curvas para cada gene foram testados em três experiências diferentes correu em duplicado e as médias dos coeficientes de correlação (r) foram maiores que 0,98. A expressão de genes alvo foi normalizada em cada amostra de tumor e de controlo para a intensidade da referência interna (

GADPH

) usando um método anteriormente descrito [30]. Os valores de intensidade medidos foram normalizados em ng /mL. Um teste de normalidade (Shapiro-Wilk) foi realizado com o teste para uma distribuição normal dos dados de expressão de genes. A expressão dobra-mudança foi calculada dividindo a intensidade normalizada mediana de amostras de tumores pela intensidade mediana normalizada das amostras de controlo. A significância estatística entre as médias de tumores e controles foi calculado com o Mann-Whitney (MW) teste não-paramétrico. As correlações entre os resultados MA e os dados qRT-PCR foram realizadas usando

2 valores de log e medida pelo coeficiente de correlação de Pearson.

Imunohistoquímica

A expressão da proteína de 10 genes foi determinada em 26 CC e 10 amostras de controlo com IH. Dois microarrays de tecido caseiros (TMA) foram construídos, um contendo 14 CCs HPV16-positivas e 5 controles e os outros 12 CC positivo para outros HPVs e 5 controles. NUSAP1 foi explorada apenas em amostras do primeiro TMA. amostras cilíndricas de regiões representativas dos embebidos em parafina blocos de tecido, previamente seleccionados pela H lâminas E coradas, foram tomadas com uma agulha de punção-biópsia (2 mm de diâmetro), transferidos para blocos de parafina de destinatários em posições de matriz definidos e recém-embebidos em parafina. Todos os blocos de tecidos doentes combinados foram obtidos do Departamento de Patologia do Hospital. Cortes seriados (4 mm de espessura) do TMA foram cortadas e o 10º lâmina foi corada com H E para confirmar o diagnóstico histopatológico. As secções foram imersos em xileno para remover parafina e, em seguida, re-hidratadas com álcool graduado (100%, 95%, 90%, 80%, e 70% v /v em água). Epitopo recuperação foi realizada por aquecimento das lâminas, e introduzindo-os em Alvo Retrieval Solution a pH 6.0 (Dako, Carpinteria, CA) a 121 ° C durante 5 minutos numa panela de pressão. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das lâminas com peróxido de hidrogénio a 1% em PBS durante 10 min. Em seguida, foi adicionado um bloqueador fundo não específico e incubou-se durante 10 min. Os anticorpos primários contra PCNA (SC-53407); p16 para CDKN2A (SC-71804); SCP-2 para SYCP2 (SC-20048), PRC1 (SC-56345); Ciclina B2 para CCNB2 (SC-81241); CDKN3 (SC-475); e CDC2 para p34 (SC-70822), foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra CDC20 (cat. 34-1900), Ki-67 para MKI67 (Cat. M7187) e NUSAP1 (cat. H00051203-B01) foram obtidos de Invitrogen, da Dako (Glostrup, Dinamarca), e Nova Biológica (Littleton, CO ), respectivamente. A diluição utilizado para todos os anticorpos foi 1:100, excepto para CDC2, (1:50) e NUSAP1 (1:250), e o diluente de anticorpo utilizado foi da Dako. Um volume total de 300 uL foram adicionados a cada secção, e as lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. complexos antigénio-anticorpo foram detectados pelo método da peroxidase avidina-biotina, utilizando 3,3′-diaminobenzidina-tetrahydrocloride como um substrato cromogénico (Cat KO679 LSAB + sys /HRP;. Dako Cytomation-Carpinteria, CA), e as secções foram contrastadas com hematoxilina. Os ensaios foram realizados em triplicado. Os anticorpos para SYCP2, PRC1, CCNB2, CDKN3, CDC2 e CDC20 foram testados em tecidos conhecidos por expressar esses antígenos. SYCP2 foi testado no neonato testículo; PRC1, CDC2 e CCNB2 foram testados em câncer de cólon; e CDKN3 foi testado em biópsias de câncer de pulmão. Todos os tecidos foram obtidos a partir dos arquivos do Departamento de Patologia. A percentagem de células coradas foi calculada a partir de uma análise de 10 sucessivos campos de alta potência de células neoplásicas. A localização celular da imunorreacção foi identificado, e a intensidade da imunorreacção foi pontuada de 0 a 4, onde 0 indicava nenhuma coloração. sinais reacção imunitária raramente foram encontrados no estroma, com todos os anticorpos e não foram pontuados para a análise. lâminas imunocoradas foram analisados ​​e marcados por 2 patologistas, que estavam cegos para os resultados. Raros casos com pontuações discordantes foram reavaliados e marcados com base na opinião de consenso.

Análise de Sobrevivência de pacientes com câncer

De acordo com o estadiamento da FIGO pacientes com câncer cervical receberam tratamento individualizado com base nas diretrizes de tratamento para o cancro do colo do útero da American Cancer Society (Ver Tabela 1). Após o término do tratamento, cada doente foi clinicamente avaliada a cada 3 meses, ou 6 por um oncologista experiente. Os dados clínicos do estudo de follow-up foi obtido dos pacientes registros médicos. Além disso, um assistente social realizada telefonemas e visitas domiciliares aos pacientes a cada 6 meses durante o estudo. Os pacientes registrados como vivos no estudo foram acompanhados com sucesso durante pelo menos 42 meses após o tratamento. Censurado e pacientes falecidos foram acompanhados pelo número de meses indicados na Tabela 1. Os casos designados como censurado referido aqueles pacientes que foram perdidos com o estudo, no período de acompanhamento ou falecidos de outros do que o cancro do colo do útero causas. Os pacientes foram considerados perdidos quando não compareceu às consultas médicas para o controle da doença, não foram encontrados em visitas domiciliares ou não responder a chamadas telefônicas. Nesta coorte, os pacientes registrados como mortos eram apenas as mulheres que morreram por tumor primário câncer cervical como causa principal. A causa da morte de todos, mas um paciente que morreu durante o seguimento foi confirmado pelo registro médico e a certidão de óbito. Apenas 42 dos 44 pacientes com CC HPV16-positivos exploradas com qRT-PCR foram incluídos no estudo seguiu-se. Quatro casos foram considerados certo censurados e oito mortes foram registradas. O tempo seguinte média dos 42 pacientes foi de 50,5 meses. A associação de expressão FIGO e gene (

PRC1, CCNB2, CDC20, CDKN3, NUSAP1, SYCP-2, CDKN2A, PCNA, MKI67

) com a sobrevivência foi investigado por análise de sobrevivência. Com todo o conjunto da amostra, 500 conjuntos de treinamento de 21 amostras foram criados aleatoriamente para cada gene explorado. Para categorizar os dados de expressão gênica quantificados por qRT-PCR, a análise ROC foi realizada em cada conjunto de treinamento. Esta análise foi feita para definir um ponto de corte para a expressão do gene que esses valores representados com a maior sensibilidade e especificidade para a diferenciação entre os pacientes que faleceram e sobreviventes. O conjunto da amostra inteira foi então analisada com o cut-off média, calculada a partir dos valores dos 500 conjuntos de treinamento. As amostras com valores de expressão de genes acima do cut-off foram definidos como 1 e aqueles com valores abaixo do cut-off foram definidos como 0. O tempo de sobrevida global cumulativa foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. FIGO estadiamento e da expressão gênica foram incluídos como co-variáveis ​​em um modelo de riscos proporcionais de Cox.

Gene Ontology Análise de Classificação

O banco de dados para anotação, visualização e integrado Discovery (DAVID) funcional ferramenta de anotação (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [31], [32] e a Análise de Caminho Ingenuity (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) foram usados ​​para classificar os genes desregulados. Genes foram classificados usando cluster anotação funcional considerando os processos biológicos ontologia gene. rigor classificação foi definida no nível máximo e médio porte.

Anotação Gene e Análise de Dados

A posição física dos genes foi mapeada de acordo com o navegador UCSC Genome Assembleia março 2006 NCBI 36 /hg18, disponível em https://genome.ucsc.edu/. A análise dos dados foi realizada utilizando o Access 2010 (Microsoft Inc.). Os dados MA-prima é Miame compatível e foi depositado em um banco de dados compatível Miame (GEO, https://www.ncbi.nih.gov/geo/) sob o número de acesso GSE39001. operador receptor análise característica (ROC) foi realizada e foi usado índice de Youden [33] para selecionar os melhores pontos de corte para distinguir os tumores de controles e CIN2 + de CIN1- usando os valores dos genes selecionados obtidos por qRT-PCR de expressão. Para cada marcador, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) foram calculados de acordo com fórmulas previamente descritos [34]. Todos os testes foram 2 lados, e os valores de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise dos dados foi realizada utilizando Sigma Stat e SPSS ver. 17 software.

Resultados

Análise da expressão de 8.638 genes em cancro do colo

A quantidade de mRNA transcrito a partir de 8.638 genes foi comparada entre amostras de 43 CC positivos para HPV16 e 12 normais amostras epiteliais cervicais usando o microarray HG-foco. Um total de 997 genes foram expressas diferencialmente entre os grupos de cancro e de controlo; 600 foram regulados positivamente e 397 foram reprimidos (Tabela S3). Quase metade dos genes regulados positivamente regulada negativamente e tinha CFs na gama de 1,5-2,0, e o número de genes em ambos os grupos diminuiu linearmente (r = -0,8; p = 0,002) como o valor FC aumentada (Figura 1). A análise de componente principal (PCA; dados não mostrados) e o agrupamento não-hierárquica supervisionado (painel A na Figura 2) realizado com todos os valores de expressão do gene 997 claramente separadas as amostras cancerosas do grupo de controlo. No entanto, a expressão de muitos genes não foi completamente uniforme entre as amostras de cancro, especialmente no grupo de genes regulados positivamente (sinais mostrados em vermelho na Figura 2A). Muitos destes genes foram regulados positivamente em alguns tumores e regulados negativamente em outros tumores. Isto estava em contraste com a uniformidade dos sinais de expressão em amostras do grupo de controlo. Genes para ser testado como marcadores para rastreamento ou como potenciais alvos terapêuticos foram selecionados de acordo com a classificação Δ-score (a t-teste modificado, usado no SAM), FC ou se eles foram anteriormente utilizados como marcadores para o câncer cervical. Dos 997 genes associados com as amostras de câncer, 163 foram relatados como marcadores para diferentes tipos de câncer (IPA, Ingenuity Systems), incluindo

MCM2,

TOP2A

, e

CDKN2A

, que têm sido utilizadas como marcadores para o diagnóstico de cancro cervical em [35]. Os 997 genes foram listados em ordem decrescente ordenados por Δ-score (Tabela S3). Foram selecionados um total de 23 genes (18 regulada e 5 subregulado) para validação por qRT-PCR (marcados em negrito na Tabela S3 e Tabela 2; círculos coloridos em azul e laranja na Figura 1). Todos os genes regulados negativamente (

CFD

,

NDN

,

WISP2

,

END3

, e

SLC18A2

) e 10 dos 18 genes regulados positivamente (

PRC1

,

CKS2

,

Tyms

,

RFC4

,

RRM2

,

NUSAP1

,

MCM2

,

CCNB2

,

SMC4

, e

CDC2

) foram selecionados de acordo com a classificação Δ-score. Sete dos restantes genes regulados positivamente estão na lista dos 50 genes melhor classificados, 2 deles são genes que foram anteriormente propostos como marcadores em CC (

CDKN2A

e

TOP2A

), 4 (

CDC20

,

CDKN3

,

ZWINT

, e

SYCP2

) foram selecionados com base no valor FC, e

PCNA

(Tabela S3), juntamente com

MKI67

, que ficou no lugar 139, foram incluídos porque esses marcadores são comumente usados ​​para medir a proliferação celular. uma. uma. b. c. b.