Abstract

Fundo

O câncer de próstata (PCA) é uma doença muito heterogêneo em relação ao resultado clínico. Este estudo explorou a metilação do DNA diferencial a priori genes selecionados para diagnosticar APC e prever a falha clínica (CF) em pacientes de alto risco.

Métodos

Um multiplex quantitativa, ensaio de PCR específicos de metilação foi desenvolvidos para avaliar a metilação do promotor do

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2 Comprar e

genes R a R b

em formalina , amostras de tecido embebidos em parafina fixos de 42 pacientes com hiperplasia prostática benigna e espécimes de prostatectomia radical de pacientes com alto risco CaP, abrangendo formação e validação de coortes de 147 e 71 pacientes, respectivamente. testes de log-rank, modelos de Cox univariada e multivariada foram utilizados para investigar o valor prognóstico da metilação do DNA.

Resultados

Hipermetilação de

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

e

RARB

foi altamente específico para o cancro. No entanto, apenas

GSTP1

metilação foi significativamente associada com CF em ambas as coortes PCA-alto risco independentes. Importante, tricotomia em baixa, moderada e alta

GSTP1

subgrupos nível de metilação foi altamente preditivo para CF. Pacientes com qualquer uma baixa ou alta

GSTP1

nível de metilação, em comparação com os grupos de metilação moderados, estavam em um risco mais elevado para CF, tanto na formação (hazard ratio [HR], 3,65; IC 95%, 1,65 para 8,07) e validação conjuntos (HR, 4,27; IC 95%, 1,03-17,72), bem como no grupo combinado (HR, 2,74; 95% CI, 1,42-5,27) em análise multivariada

Conclusões.

a classificação de tumores primários de alto risco em três subtipos baseados na metilação de ADN pode ser combinada com os parâmetros clínico-patológico para um risco para a estratificação mais informativo destes pacientes com CaP

citação:. K Litovkin , Van Eynde A, Joniau S, Lerut E, Laenen A, Gevaert T, et al. (2015) Previsão DNA metilação-guiada falha clínica de alto risco do cancro da próstata. PLoS ONE 10 (6): e0130651. doi: 10.1371 /journal.pone.0130651

Editor do Academic: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 29 de agosto de 2014; Aceito: 25 de maio de 2015; Publicação: 18 de junho de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento: Este trabalho foi financiado pela Fundação Fournier-Majoie (FFM ), o Fundo de Investigação industrial da KU Leuven (IOF-HB 07/04 e IOF-HB /12/011), e do Plano Nacional de Câncer belga (Acção 29_023). DNAlytics SA forneceu apoio sob a forma de salários para os autores [Pg e TH], mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. . Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses: A patente GB, intitulado« prognóstico baseado gene marcador do câncer de próstata “, foi apresentado no Reino Unido, com data de prioridade de 27 de Janeiro de 2014 (GB1401371.8), e com AVE, KL e MB como inventores. TH é o CEO e Pierre Gramme o principal analista de DNAlytics, SA (Chemin du ciclotrão 6, 1348 Louvain-la-Neuve, Bélgica). Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Ao longo das últimas duas décadas, a implementação generalizada de antígeno específico da próstata no soro (PSA) conduziu a um aumento dramático no diagnóstico do cancro da próstata (CaP) [1]. No entanto, muitos dos tumores diagnosticados-PSA são clinicamente irrelevante. Apenas cerca de um quarto dos pacientes com PCA recém-diagnosticados são considerados de alto risco de desenvolver a doença fatal, que se manifesta por falha clínica (CF) e morte relacionada ao câncer (CRD) [2-4]. De acordo com a Associação Europeia de Urologia (EAU) e da National Comprehensive Cancer Network (NCCN) orientações, esses pacientes PCA-alto risco são definidas por estágio clínico ≥T3a, uma pontuação de Gleason biópsia de 8-10 e /ou um nível de PSA no soro 20 ng /ml [5,6]. No entanto, 62-84% dos pacientes CaP de alto risco experimentar específicas de sobrevivência de câncer de pelo menos 15 anos após a prostatectomia radical (RP), demonstrando que nem todos os pacientes deste grupo têm um mau prognóstico [7]. Este resultado clínico heterogêneo dentro do grupo de alto risco é potencialmente explicado pelo uso de modelos de estratificação de risco que não levam em conta subjacente (EPI) características genéticas e moleculares do tumor que determinam a presença de micrometástases. Portanto, um dos principais desafios na investigação CaP contemporânea é identificar biomarcadores que melhoram a previsão da CF e CRD. A melhor caracterização de pacientes com PCA de alto risco no nível molecular deve permitir que um medicamento mais personalizado, combinando a intensidade do tratamento para a agressividade da doença e prognóstico esperado. No entanto, até à data não há nenhuma indicação clínica estabelecida para o uso de ferramentas de previsão moleculares.

Agora é bem reconhecido que ambas as mutações e alterações epigenéticas, em particular, a metilação do DNA diferencial, desempenham um papel na carcinogênese [8]. metilação do DNA, o que ocorre principalmente em resíduos de citosina num contexto sequência de dinucleótidos CpG, tem lugar em diferentes regiões no genoma, ou seja, pelo promotor ilhas CpG (regiões CPG-densa associada ao promotor), margens promotor CpG ilha (região com menor CpG densidade nas proximidades da ilha de CpG), os corpos de genes e sequências repetitivas [9]. No genoma humano adulto maioria dos CpGs metilados são, com excepção do promotor de ilhas de CpG e margens. É geralmente aceite que a PCA é associada com alteração destes padrões, englobando hipometilação de todo o genoma, bem como a hipermetilação do promotor específico do [12/08]. A hipometilação global, é detectado em muitos loci genômica, incluindo elementos repetitivos e corpos de genes, contribuindo para o genoma instabilidade e transcrição espúria iniciações, respectivamente. hipermetilação associada-promotor está associado com o silenciamento do gene e promove a progressão CaP pelo silenciamento de genes supressores de tumores [8,13]. Na APC, vários genes hypermethylated foram identificados, com

GSTP1

ser o mais freqüentemente alterado e estudados [13].

Com o presente estudo, que teve como objetivo desenvolver um ensaio quantitativo confiável para simultaneamente determinar os níveis de metilação do promotor do a priori selecionados genes PCA-ligados

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

RARB

e

PTGS2

, e para avaliar o seu valor diagnóstico e prognóstico para pacientes CaP de alto risco [13].

Materiais e Métodos

pacientes e colheita de amostras

Os pacientes com alta -risco CaP foram selecionados de acordo com os critérios adotados pela EAU e NCCN, ou seja, um estágio clínico ≥T3a, uma pontuação biópsia Gleason de 8-10 e /ou níveis de PSA 20 ng /ml [5,6]. tecidos fixados em formalina (FFPE) da próstata normal, embebido em parafina e PCA foram obtidos a partir da Universidade Hospitais Leuven (UHL, Leuven, Bélgica) e do Hospital Universitário de Würzburg (UHW, Würzburg, Alemanha). No UHL amostras foram obtidas de doentes com hiperplasia prostática benigna (HPB, n = 42) ou com alto risco CaP (PCA2, n = 71). As amostras de pacientes com CaP de alto risco foram também obtidos a partir de UHW (PCa1, n = 147). estadiamento pré-operatório em ambos os grupos incluiu um exame de toque retal, uma tomografia computadorizada de abdominopelvic (TC) e uma varredura do osso. Neoadjuvante hormonal, radioterapia ou quimioterapia eram um critério de exclusão. Preparo e classificação de amostras de cancro da próstata (seções inteiras de montagem, intervalos de 4 mm) foram realizados de acordo com a classificação TNM 2002 e o sistema de graduação de Gleason, como descrito anteriormente [14]. O acompanhamento foi realizado a cada 3 meses para os primeiros 2 anos após a cirurgia, a cada 6 meses, nos 3 anos seguintes, e depois anualmente. CF foi declarado quando qualquer recorrência local ou metástases à distância foram histologicamente comprovada ou confirmado por tomografia computadorizada ou cintilografia óssea. As características clínico-patológicos de todas as coortes estão descritos na Tabela 1. Dos pacientes de PCa1 e coortes PCA2, 84% e 21%, respectivamente, receberam tratamentos (radioterapia adjuvantes e /ou terapia hormonal). O estudo foi aprovado pela Comissão de Hospital Universitário de Leuven Ética Médica. A última autorização concedida para realizar esse estudo retrospectivo, sem consentimento informado, porque só arquivados amostras de PCA (sobras de blocos FFPE) foram utilizados. Todas as amostras foram analisadas de forma anónima.

celular cultura

próstata humano PC-3 (CRL-1435, na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, EUA), LNCaP ( ATCC, ATCC, HTB-81), as células (CRL-1740) e DU 145 foram cultivadas como monocamadas em 50% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 50% de F12, RPMI 1640 e DMEM de Ham, respectivamente, suplementado com soro de vitelo fetal a 10% . células PZ-HPV-7 (ATCC, CRL-2221), uma linha celular imortalizada derivada de células da próstata humana normais, foram cultivadas em meio livre de queratinócitos de soro suplementado com factor de 5 ng /ml humano de crescimento epidérmico recombinante e 0,05 mg /bovina ml extrato de hipófise. Hiperplasia células BPH-1 o prostática benigna foram gentilmente cedido pelo Prof. J. Swinnen (KU Leuven, Bélgica) e foram mantidas em meio RPMI 1640 mais 10% de soro fetal de vitelo a [15].

extracção de ADN e bissulfito conversão

O sangue total DNA genómico humano foi adquirido da Clontech Laboratories, Inc, mountain View, CA, EUA. A partir de linhas de células de ADN genómico foi extraído utilizando o ADN genómico de mamíferos GenElute Purification Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Na coorte de HBP, o DNA genómico foi extraído de toda a secção de parafina, utilizando o kit de ADN WaxFreeTM (TrimGen, Sparks, MD, EUA). Para ambos os grupos APC, o bloco FFPE com a área de maior tumor foi recuperado, e áreas com 90% tecido canceroso, compreendendo tanto epiteliais tumorais e células estromais associadas ao tumor, foram marcados pelo mesmo uro-patologista e, posteriormente, macrodissected. Isolamento de ADN genómico foi executado de acordo com um procedimento de fenol-clorofórmio padrão. Em seguida, o DNA genómico (~ 500 ng) de cada amostra foi bissulfito-convertido utilizando o kit de metilação do DNA EZ (Zymo Research Corp., Orange, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante, e eluída em 25 ul de H

2O .

independente de metilação (MI) PCR e clonagem

primers MI contendo no máximo um sítio CpG perto da extremidade 5 ‘foram concebidos para amplificar fragmentos de 100-200 pares de bases (pb) em torno o local de início da transcrição da

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

e

RARB

(Tabela a em arquivo S1 , a Figura a no ficheiro S1). MI-PCR foi realizada como previamente descrito [16]. Subsequentemente, os fragmentos amplificados foram clonados em células competentes DH5a (Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido), utilizando o Sistema Easy pGEM-T vector (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) e cerca de 4 colónias foram aleatoriamente escolhidas e analisadas por sequenciação de didesoxinucleótidos. Os plasmídeos com as inserções de ADN que corresponde a totalmente metilado (derivado de LNCaP ou células PC-3) regiões promotoras após a conversão de bissulfito ou não metilado (derivado a partir de sangue total humano), denotado como plasmídeos pM e Pu, respectivamente, foram seleccionadas para posterior utilização na segunda etapa do ensaio multiplex quantitativa metilação específicas de PCR (QM-MSP) [16].

QM-MSP ensaio

Um ensaio QM-MSP foi desenvolvido para quantificar o estado promotor metilação

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

e

RARB

(Figura a no arquivo S1). Um protocolo detalhado é descrito em [15], e todos os conjuntos de iniciadores são definidos na Tabela A em Ficheiro S1. Resumidamente, na primeira reacção de PCR uma mistura de iniciadores específicos do gene validado foi utilizado para co-amplificar os promotores de o

GSTP1

,

CCND2

,

RARB

,

PTGS2

e

APC

genes independentes do seu estado de metilação (conjuntos de iniciadores MI na Tabela a em arquivo S1). Para assegurar que o QM-MSP pode ser usada com ADN fragmentado, a qual é muitas vezes problemática no ADN isolado a partir de tecido FFPE, os iniciadores multiplex foram concebidos para amplificar fragmentos de PCR de 100-200 pb ≈. Na segunda reacção de PCR, a quantificação absoluta dos fragmentos de ADN metilado e não metilado foi realizada separadamente para cada um dos genes com os iniciadores específicos metilados e não metilados quantitativo validado (MSP e USP iniciadores conjuntos, respectivamente, na Tabela A em Ficheiro S1, Figura B em S1 Arquivo). Finalmente, para calcular a% de metilação do DNA a quantidade de ADN total foi derivado a partir da soma de ADN metilado e não metilado (U + H). Apenas amostras que contêm 3000 cópias do gene após a pré-amplificação foram aceites para quantificação tal como descrito em [16]. A metilação do

GSTP1

,

APC

e

CCND2

foi quantificado em 147 e 70 amostras do PCa1 e coortes PCA2, respectivamente.

PTGS2

foi quantificado em 147 e 66 amostras e

RARB

em 146 e 66 amostras do PCa1 e PCA2 coortes, respectivamente.

Imunohistoquímica

FFPE seções de PCA2 coorte foram coradas em um BOND MAX Autostainer (Leica). Resumidamente, secções embebidas em parafina foram desparafinados primeira, e a recuperação de antigénio foi realizado em solução epítopo de recuperação BOND 1 (Leica). Monoclonal de ratinho anti-3F2 de GSTP1 (1: 2000, 3369) e anticorpo monoclonal de coelho anti-ERG (1: 100, ab92513) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) e Abcam (Cambridge, Reino Unido), respectivamente. As lâminas foram analisadas por microscopia de luz, examinadas e avaliadas por um uropathologist, de acordo com o método Allred [17]. A pontuação Allred é um sistema semi-quantitativo, que leva em conta a proporção de células positivas (escala de 0-5) e a intensidade da coloração (escala de 0-3). A pontuação proporção e intensidade foram somados para obter a pontuação total de 0, 2-8. Uma pontuação de 0-2 foi considerado como negativo, enquanto 3-8 foi tomada como positiva [17].

A análise estatística

A coorte BPH foi usada para determinar os níveis de metilação de linha de base para todos DNA marcadores de metilação. O receptor-operacional de características (ROC) a análise, a sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo /negativo foram determinadas usando MedCalc para Windows, versão 12.5 (MedCalc Software, Ostend, Bélgica). A associação entre a metilação (como variável contínua) parâmetros e clinico-patológico (escore Gleason e estágio patológico), ERG e GSTP1 colorações imunológicas e estroma conteúdo foi explorada usando o teste U de Mann-Whitney (para duas categorias) ou teste de Kruskal-Wallis ( para mais de duas categorias). teste exato de Fisher é usada para a associação entre duas variáveis ​​categóricas. Correlações entre a metilação de diferentes genes foram estimados pelo coeficiente de correlação de Pearson (

r

).

Categorização de metilação do DNA para o risco-classificação foi baseada em modelos de Cox. A relação funcional entre o grau de metilação do DNA e os resultados de time-to-event (CF) foi explorada, comparando uma tendência linear para funções quadráticas e cúbicas-splines com base usando o teste da razão de verossimilhança [18]. Um ou dois valores de corte foram determinados, em caso de não-linearidade. O primeiro valor de corte foi determinada considerando todos os possíveis dicotomizações, enquanto o segundo foi determinado por fixação do primeiro ponto de corte e considerando todos trichotomizations possíveis. Ambos ajuste do modelo (probabilidade) e evolução clínica por conjunto de dados foram consideradas na seleção final desses valores de corte.

A diferença de risco entre grupos de metilação foi analisada por modelos de Cox univariada eo teste de log-rank . Os resultados são apresentados por meio de taxa de risco (HR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC), e com uma representação gráfica fornecida traçando as estimativas de Kaplan-Meier. análises multivariadas de Cox foram usados ​​para projetar modelos clínico-patológicas com e sem os marcadores de metilação. A precisão da previsão de ambos os modelos foi avaliada por meio da estimativa de concordância de probabilidade (CPE), um índice AUC semelhante para os dados de tempo-a-caso, com valores entre 0,5 (nenhum valor preditivo) e 1 (valor preditivo perfeito) [19 ]. Para assegurar que o CPE medido é reprodutível em pacientes fora da amostra, repetiu aleatória de sub-amostragem de validação cruzada foi utilizado. A categorização de metilação do DNA descrito acima e os pesos de um modelo de Cox estavam sintonizados nos conjuntos de treinamento e de avaliação com os conjuntos de ensaio correspondentes. Realizamos 200 splits aleatórios da coorte em conjunto de treino 80% e 20% conjunto de teste. As análises foram realizadas utilizando o software SAS, versão 9.2 para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

P

-Valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

A metilação dos cinco genes marcadores em linhas de células de próstata humanos e

sangue total

pares de primers específicos para o gene foram concebidos para amplificar as ilhas CpG na região promotora de

GSTP1

,

APC

,

RARB

,

CCND2

e

PTGS2

, independentemente do seu estado de metilação (Tabela a em arquivo S1). Amplificação destes loci foi realizada em ADN genómico convertido de sódio-bissulfito isolado a partir de 5 linhas de células da próstata humanas, incluindo três CaP (LNCaP, PC-3 e DU 145) e duas linhas de células (PZ-HPV-7 e BPH-1) benignas , e em ADN genómico isolado a partir de sangue total humano a partir de uma pessoa livre de cancro. ADN bissulfito sequenciação desses fragmentos clonados mostrou que quase todos os dinucleótidos CpG foram metilados em LNCaP e /ou PC-3 linhas de células cancerígenas, mas não em linhas de células benignas e sangue (ilustrados na Figura A no ficheiro S1 para

APC

). Em seguida, QM-MSP para os cinco genes seleccionados foi desenvolvido como descrito na secção de materiais e métodos e realizada nestes seis genótipos (Tabela 2). Todos os genes foram completamente metilado (≥99% metilação) nas células LNCaP sensíveis a hormona, de acordo com os nossos dados de sequenciação de bissulfito e estudos anteriores [20]. Nas linhas de células hormônio-refratário PC-3 e DU 145, os níveis de metilação do DNA eram menos proeminentes, como apenas dois genes (

APC

e

PTGS2

) foram de 100% metilado no PC- 3 linha, enquanto que nenhum dos genes foi completamente metilado nas células DU 145. metilação do DNA nos genótipos não-malignas, incluindo BPH-1, PZ-HPV7 e sangue total, não foi detectado no

GSTP1

,

RARB

,

PTGS2

,

CCND2

, e

APC

loci de genes, exceto para

CCND2

em BPH-1, que foi de 13% metilado.

Câncer metilação do DNA específico de alto risco CaP

em seguida, a metilação do promotor de

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

e

RARB

foi quantificado em amostras de tecido FFPE da próstata, utilizando o procedimento QM-MSP. As amostras foram obtidas a partir da ressecção transuretral ou adenomectomia amostras de 42 pacientes com BPH e os espécimes de prostatectomia radical de 218 pacientes com CaP de alto risco. Os pacientes CaP compreendia dois grupos, ainda denotada como o PCa1 ou formação de coorte (

n

= 147) e PCA2 ou validação (

n

= 71) coorte. Na coorte de HBP, o nível médio de metilação desses genes marcadores não superior a 2% (Figura 1, Tabela B em Ficheiro S1). No entanto, foi detectado um grau muito mais elevado de CpG metilação para todos os genes em ambos os grupos de CaP de alto risco, indicando uma metilação específico do cancro dos marcadores seleccionados (figura 1, Tabela C e D no ficheiro S1). Com um valor de corte de metilação 1 ou 2%,

GSTP1

mostrou a sensibilidade mais elevada em PCa1 (0,99) e (0,97) PCA2 coortes, a uma especificidade de 1,00 para os cinco marcadores individuais (quadro E, no ficheiro S1 ). Outras combinações de genes marcadores não melhorar ainda mais a sensibilidade, sem diminuir a especificidade (Tabela E no ficheiro S1). Para avaliar ainda mais a precisão no discriminador CaP de alto risco de BPH, análise de receptor-operativos de características (ROC) para cada um dos marcadores individuais foi realizada e foi calculada a área sob a curva (AUC) (Figura 1). As AUC variou de 0,85 (

PTGS2

) para 0,99 (

GSTP1

), confirmando a metilação específico do cancro, com

GSTP1

metilação como o melhor classificador.

A metilação do

RARB

,

GSTP1

,

APC

,

CCND2

e

PTGS2

foi determinada por QM-MSP em amostras de prostatectomia radical a partir de 42 doentes com HBP e de 147 (PCa1) e 71 pacientes (PCA2) com alto risco CaP. Os dados estão apresentados em gráficos de pontos para os genes indicados (A-E, gráficos da esquerda). níveis de metilação de cada gene em cada coorte CaP foram significativamente maiores do que no grupo de hiperplasia prostática benigna, tal como determinado pelo teste U de Mann-Whitney (*, P 0,001). foi realizada, utilizando os dados apresentados nos gráficos de pontos, análise (ROC) receptor-operacional característica os marcadores de metilação de discernir BHP a partir de amostras de alto risco de câncer de próstata (médio, PCa1 e direita, PCA2 A-E). linha cinza, mediana; AUC, área sob a curva.

heterogeneidade metilação em alto risco CaP

O nível de metilação de todos os genes individuais variaram entre 0% e ~ 80%, sugerindo um enorme inter e intratumoral heterogeneidade molecular em tumores da próstata de alto risco (Figura 1). Uma vez que o DNA foi extraído a partir de áreas com 90% de tecido canceroso, que compreendem tanto as células do estroma tumoral-epiteliais e associados a tumores, que possuem semi-quantificado o teor de estroma dos tecidos da coorte PCA2 e analisada a correlação com

GSTP1

metilação do DNA. O teor de estroma variou de 10% a 35% com dois valores extremos de 40 e 60% (Tabela F no ficheiro S1). É importante ressaltar que nenhuma correlação foi encontrada entre o

GSTP1

conteúdo metilação do DNA e estroma, como analisado por Spearman (

P

-valor, 0.1550), Kruskal-Wallis e Fisher teste exato (Tabela G em S1 ficheiro), indicando que a diferença no teor de estroma não é a causa subjacente para heterogeneidade inter e intratumoral da metilação do DNA. Portanto, nossos dados são consistentes com a noção de que há uma grande heterogeneidade inter e intratumoral em CaP de alto risco no nível de metilação do DNA.

Curiosamente, classificando os pacientes da formação e coortes de validação de acordo com a nível de metilação

GSTP1

, o gene marcador mais frequentemente metilado, verificou-se que o nível de metilação dos outros 4 marcadores geralmente seguido o mesmo padrão em ambos os grupos (Figura 2A). Além disso, analisa gráfico de dispersão entre metilação do

GSTP1

e os outros genes (Fig 2B e Figura C no arquivo S1) revelou que os tumores que não foram metilados em

APC

,

CCND2

,

PTGS2

ou

RARB

, muitas vezes foram metilados em

GSTP1

, com níveis variando de ~ 5 a 70%. No entanto, se os tumores foram hipermetilado em

APC

,

CCND2

,

PTGS2

ou

RARB

, o seu grau de metilação foi geralmente proporcional à

GSTP1

níveis de metilação. Estes resultados foram corroborados pelos coeficientes de correlação altamente significativos positivos Pearson dos níveis de metilação desses marcadores (

r

= 0,45-0,82;

P Art 0,001; Tabela H no arquivo S1). Tomados em conjunto, estes dados mostram que a metilação dos cinco genes é moderadamente a fortemente correlacionados e provavelmente ocorre nas mesmas células.

representação de metilação do DNA Cor-dimensionada em tumores a partir de PCa1 e coortes PCA2. (A) Os pacientes foram ordenados de acordo com a sua

GSTP1

valor metilação. A% de metilação dos outros genes marcadores 4 também é mostrada. caixas cinzentas indicam valores em falta. (B) Gráficos de dispersão da correlação entre a

GSTP1

metilação e

RARB

metilação em PCa1 (painel esquerdo) e PCA2 (painel direito) coortes.

Promotor hipermetilação contra parâmetros clínico-patológicos

as correlações entre a metilação do gene loci, o estágio patológico (pT), ea pontuação de Gleason (GS) foram avaliados em ambos os grupos APC. Nenhum dos marcadores mostrou uma associação significativa com a PT, que foi categorizado em quatro grupos (pT2, pT3a, pT3b e pT4). Para GS, os dados foram divididos em grupos de baixo (GS2-6), intermediário (GS7) e alto grau (GS8-10). Os níveis de metilação medianos para estes grupos estão apresentados na Tabela 3. Com base no teste de Mann-Whitney U Kruskal-Wallis e, nenhum dos marcadores estavam significativamente associados com o GS em ambos os grupos (Tabela 3 e Tabel I em Ficheiro S1). comparações de pares dos grupos GS revelou que apenas

PTGS2

metilação foi significativamente aumentada em GS8-10 e GS7, em comparação com GS2-6, em PCa1 (Tabela I no arquivo S1).

APC

e

R a R b

methylations só foram significativamente maiores em GS7, em comparação com GS2-6, em PCA2 (Tabela I no arquivo S1).

GSTP1

metilação prevê falha clínica em alto risco CaP pacientes

em seguida, temos explorado a relação entre o grau de metilação do marcador e falha clínica, utilizando modelos de Cox [21]. falha clínica foi declarado quando qualquer recorrência local ou metástases à distância foram histologicamente comprovada ou confirmado por tomografia computadorizada ou osso. Sem relação linear significativa foi encontrada entre cada um dos cinco genes e CF. Uma vez que está bem estabelecido que os biomarcadores, quando aplicados clinicamente, são muitas vezes dicotomizados, foram utilizados modelos de Cox para a selecção dos pontos de corte óptimas para cada um dos marcadores individuais [22]. A análise de regressão univariada e multivariada de Cox revelou que dicotomização baseado em

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

, ou

RARB

metilação só foi significativamente correlacionada com CF em uma coorte, indicando que é clinicamente irrelevante (Tabela J no ficheiro S1). No entanto, percebemos que

GSTP1

metilação foi significativa associada a CF em PCa1 e PCA2 quando se utilizaram diferentes pontos de corte, ou seja, 15% e 50%, respectivamente (Tabela J no arquivo S1). Por isso, investigamos a evolução clínica de múltiplos

GSTP1

subgrupos de metilação. Os tumores de alto risco foram classificados em três grupos, com base no

GSTP1

nível de metilação, ou seja, baixa metilação (LM, metilação 15%), a metilação moderada (MM, metilação 15-50%) e alta metilação (HM, metilação 50%). Pacientes com baixa ou alta metilação, em comparação com os grupos de metilação moderada, tinham um risco significativamente mais elevado para a FC na coorte de formação PCa1, conforme mostrado por análise univariada de Cox (Tabela 4; HR, 2,96; 95% Cl, 1,38 -6,36;

P

-valor 0,005). Este risco aumentado foi validado na coorte PCA2 (Tabela 4; HR, 3,34; 95% Cl, 1,03-10,89;

P

-valor 0,045), bem como o grupo combinado (Tabela 4; HR, 2,59; 95% Cl, 1,38-4,87;

P

-valor 0,003). Além disso, a análise univariada de regressão de Cox de PSA pré-operatório, GS e PT revelou que apenas GS foi um preditor significativo para a falha clínica em ambos os grupos (Tabela 4). O poder prognóstico da GS nestes coortes está de acordo com vários estudos anteriores [14,23,24].

Para apoiar ainda mais a noção de que tricotomia dos pacientes CaP de alto risco com base em sua

GSTP1

nível de metilação melhora a previsão da evolução clínica, as probabilidades de sobrevivência para cada grupo foram exibidos usando gráficos de Kaplan-Meier (Figura 3). Esta análise revelou uma separação significativa nas curvas, tanto na formação (-rank test log,

P

-valor 0,014) e validação (-rank test log,

P

-VALOR 0,043) coortes bem como no grupo combinado (teste log-rank,

P

-valor 0,006) (Figura 3A, 3C e 3E). Uma comparação entre os grupos HM e MM LM + revelou que mais de metade dos pacientes CaP de alto risco foram classificados no subgrupo MM e tinha uma muito melhor de sobrevivência CF-livre em PCa1 (teste-rank de log,

P

-valor 0,007) eo grupo combinado (-rank teste log,

P

-valor 0,002). No entanto, essa diferença foi limítrofe na coorte PCA2 (-rank teste log,

P

-valor 0,062).

As curvas mostram a sobrevivência CF-livre dos pacientes a partir da baixa (LM, 15%

GSTP1

metilação), moderada (MM, 15-50%

GSTP1

metilação) e alta (HM, 50%

GSTP1

metilação) grupos na PCa1 (A), PCA2 (C) e PCa1 + 2 (e). Comparação de sobrevivência CF-livre entre a grupos HM MM e LM + em PCa1 (B), PCA2 (D) e, em PCa1 + 2 (F) também é mostrado. CF, falha clínica;

P

, teste log-rank

P

-valor.

P

-valor, teste log rank.

Importante, o tricotomizados

GSTP1

metilação emergiu como um preditor independente de CF quando ajustado para a PT, GS final, nível pré-operatório PSA, tanto na formação (Tabela 4; HR, 3,65; IC 95%, 1,65-8,07;

P

-valor 0.001) e coortes de validação (Tabela 4, HR, 4,27; 95% CI , 1,03-17,72;

P

-valor 0,046), bem como na coorte conjunta (Tabela 4; HR, 2,74; IC 95%, 1,42-5,27;

P

-valor 0,003 ). Entre as outras variáveis ​​testadas, apenas o GS também surgiu como um preditor independente de CF em ambas as coortes individuais e combinadas. Assim, a metilação do DNA tem independente poder preditivo de GS de alto risco CaP.

Em seguida, comparamos o valor preditivo do modelo para CF, incluindo todos os parâmetros clínico-patológico, com e sem tricotomizados

GSTP1

metilação, por meio de estimativas Concordância de Probabilidade (CPEs) [19]. As medidas de desempenho foram significativamente melhorados através da inclusão de

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metilação no modelo clínico em ambos os grupos (Tabela 5). Assim, a precisão dos modelos preditivos para a CF com base em parâmetros clínico-patológicos pode ser melhorada pela inclusão do tricotomizados

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modelo de metilação.

guiada por metilação do risco-estratificação de pacientes com alto risco CaP

uma vez que a sobrevivência análises mostraram que os pacientes com qualquer um baixos ou altos níveis de

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metilação estão em um risco mais elevado para CF do que aqueles com moderada

GSTP1 níveis de metilação

, exploramos o nível de metilação do outro testados quatro marcadores nestes subgrupos. Em primeiro lugar, estratificamos os pacientes do treinamento, validação e coortes combinados em três grupos, ou seja, baixa ( 15%), moderada (15% -50%) e alta ( 50%) metilação, classificando-os de acordo com a

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nível de metilação (Fig 4A). Quando os dados de todos os cinco genes marcadores foram combinados, os valores de metilação medianos em grupos LM não exceda 6% e, com excepção de alguns valores aberrantes, os valores absolutos foram menos de 25% em ambos os grupos individuais e combinados (Fig 4B -4D). Isto é consistente com os coeficientes de correlação de Pearson elevadas (Tabela H em Ficheiro S1) e sugere que apenas uma pequena percentagem das células LM em tumores foram metilados nos genes marcadores. Em contraste, os valores de metilação medianos para os genes marcadores nos grupos MM /HM chegou a 18/45% (conjunto de treinamento), 28/50% (conjunto de validação) e 25/50% (conjunto combinado), respectivamente.