Abstract

células cancerosas gigante poliplóide (PGCCs) são um subgrupo morfologicamente distinta de células tumorais humanas com tamanho nuclear aumentada ou múltiplos núcleos, mas eles são geralmente considerados sem importância, porque eles são considerados como nondividing e, portanto, inviável . Temos demonstrado recentemente que estas células cancerosas grandes não só são viáveis, mas também pode dividir assimetricamente e produzir células cancerosas progênie com câncer propriedades estaminais-como via brotação divisão. Para entender melhor os eventos moleculares envolvidos na regulação da PGCCs ea geração de suas células de câncer de progênie, nós analisados ​​comparativamente os perfis proteômicos de PGCCs, PGCCs com células-filhas de brotamento, e células regulares de câncer de controle do HEY e células de cancro do ovário humano SKOV3 linhas com e sem CoCl

2. Utilizou-se uma metodologia baseada em proteómica iTRAQ de elevado rendimento acoplado com espectrometria de massa tandem com ionização por electropulverização cromatografia de líquido para determinar as proteínas reguladas diferenciadas. Foi realizada transferência de Western e imuno-histoquímica para validar as diferenças nos padrões de uma variedade de proteínas entre PGCCs ou PGCCs brotamento e células cancerosas regulares identificadas por iTRAQ abordagem e também um grupo seleccionado de proteínas a partir da literatura de expressão. As proteínas diferencialmente regulados incluídas proteínas envolvidas em resposta a hipoxia, caule geração celular, a remodelação da cromatina, regulação do ciclo celular e a invasão e metástase. Em particular, descobrimos que HIF-1alfa e sua conhecida STC1 alvo são upregulated em PGCCs. Além disso, verificou-se que um painel de factores de células-regulação estaminais e factores de transcrição reguladora epitelial para mesenquimal transição foram regulados positivamente em PGCCs brotamento, enquanto que a expressão da família de histona 1 de proteínas ligantes nucleossomais foi consistentemente mais baixa em PGCCs do que em células de controlo . Assim, os padrões de expressão proteômica fornecer informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes da formação PGCC ea relação entre PGCCs e células-tronco cancerosas em pacientes com câncer de ovário

Citation:. Zhang S, Mercado-Uribe I, Hanash S, Liu J (2013) iTRAQ-Based análise proteômica das células cancerosas gigante Poliplóide e células de brotamento Progeny revela várias vias distintas para o Desenvolvimento cancro do ovário. PLoS ONE 8 (11): e80120. doi: 10.1371 /journal.pone.0080120

editor: Nanette H Bispado, University of Miami School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de junho de 2013; Aceito: 29 de setembro de 2013; Publicação: 14 de novembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho é apoiado pela Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas (CPRIT) Multi-Investigator Grant; National Institutes of Health R01CA131183-01A2; IP50CA83639 (MD Anderson Programas Especializados de Investigação de Excelência [SPORE] no cancro do ovário). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células cancerosas gigante poliplóide (PGCCs) são um subconjunto de grandes células cancerosas atípicos encontrados principalmente em tumores sólidos. PGCCs são o principal contribuinte para a heterogeneidade do tumor epitelial e compreendem de 0,1% a 20% dos volumes tumorais, com estas percentagens aumentando com a fase de malignidade [1,2]. As características nucleares destes grandes células tumorais, incluindo o seu tamanho e forma nuclear, a cromatina padrão, o número de nucléolos, e o número de núcleos, estão entre as características histopatológicas mais descritos de tumores humanos. O número de PGCCs geralmente aumenta com o grau patológico e estágio [3-5]. Os nossos dados recentes demonstraram que PGCCs contribuir para a heterogeneidade de tumores sólidos e desempenham um papel importante na iniciação do tumor, metástase, e quimiorresistência [6] e a formação de células eritróides a partir de fibroblastos normais e células cancerosas [7]. Certos medicamentos de quimioterapia anti-mitótico pode também aumentar a formação de tumores em PGCCs, e PGCCs são muitas vezes consideradas como na fase de catástrofe mitótica e à beira da apoptose [8]. células gigantes poliplóide também pode ser observada em músculos esqueléticos durante o crescimento, osteoclastos, células infectadas por vírus, culturas de tecidos normais, envelhecimento células (senescentes) [9], e submetida à carga (por exemplo, oxidativa ou stress metabólico) células e pode ser gerado através da fusão de células ou ciclos celulares abortivos [10]. PGCCs também pode reverter para células cancerosas de tamanho normal (células cancerosas diplóides) em um processo de divisão chamada deploidization [11-14] ou neosis [15]. Todas estas características indicam que PGCCs pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento do tumor. No entanto, não têm atraído PGCCs grande atenção na comunidade de investigação do cancro devido à sua biologia mal compreendidos em tumores.

é bem conhecido que os tumores crescem num ambiente hipóxico, e hipoxia pode facilitar a formação e manutenção de cancro as células-tronco e, assim, estimular o crescimento do tumor [16-18]. Recentemente, foi utilizado cloreto de cobalto (CoCl

2), uma hipóxia mimética amplamente utilizado para tratar a anemia [19,20], para purificar e atingir um crescimento estável de PGCCs que de outra forma teria diferenciadas em células cancerosas de tamanho normal e demonstraram que PGCCs têm de haste do cancro propriedades da célula-like [6]. Para entender melhor os mecanismos subjacentes envolvidos na regulação diferencial das células cancerosas regulares, PGCCs e PGCCs com células-filhas de brotamento que empregados marcação isobaric para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) para identificar proteínas diferencialmente expressos em PGCCs e células descendentes de brotamento usando o HEY e linhas de células SKOV3 como sistemas modelo.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O tratamento ea utilização dos ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o MD Anderson Institucional.

Cancro linhas celulares e cultura

as linhas de células humanas do cancro do ovário HEY e SKOV3 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection. A cultura de células SKOV3 e HEY foi descrito anteriormente pelo nosso grupo [21]. As duas linhas de células de cancro foram mantidas em meio essencial mínimo completo de Eagle (EMEM), que é o meio essencial mínimo complementado com soro fetal bovino e antibióticos.

Geração e purificação de PGCCs

HEY e SKOV3 As células foram cultivadas em EMEM completo, em frascos T75 até atingirem 90% de confluência. Para a geração de PGCC, CoCl

2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado aos frascos a uma concentração final de 300 uM e cultivadas durante 48-72 horas, tal como descrito anteriormente [6]. Depois de ser lavado com 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram cultivadas em EMEM regular. A maioria das células de tamanho normal HEY morreu após este tratamento, e PGCCs única espalhadas sobreviveram após o tratamento com CoCl

2. Dez a 14 dias mais tarde, os PGCCs recuperados a partir de tratamento com CoCl

2 e brotamento células filhas derivadas de PGCCs foram observadas e fotografadas. Depois de três épocas de tratamentos com CoCl

2 (para adquirir PGCCs purificados suficientes), frascos de PGCCs purificados (1 × 10

6) foram colhidas por Western blot e análise iTRAQ antes dos PGCCs gerados células filhas. Quando os PGCCs foram cultivadas em meio completo e recuperados a partir de três ou quatro tratamentos com CoCl

2, PGCCs (4 × 10

4) com células filhas recém-brotamento (1 × 10

5) (cerca de 30% PGCCs e 70% de células filhas brotamento) foram utilizados para extração de proteínas e análise posterior.

Preparação de extractos de proteína

granulados frescos de PGCCs purificados, 30% recuperado PGCCs e 70% de células filhas pequenas, e as células de controlo foram ressuspensas em 1 ml de tampão de lavagem de células (ProteaPrep Lise celular Kit ; Protea Biosciences, Morgantown, WV, EUA) e, em seguida, centrifugou-se a 12000 ×

g

durante 5 min a 4 ° C. Depois de duas lavagens, as peletes de células foram ressuspensas em 500 ul de tampão de lise celular ProteaPrep e incubadas em gelo durante 30 min. sonicação intermitente foi usada para lisar completamente as células; o lisado celular foi centrifugada a 12000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi transferido para um tubo limpo de 1,5 mL. Antes do armazenamento do sobrenadante a -70 ° C, ácido surfactante aniónico detergente II lábil (Protea Biosciences) construir-se no sobrenadante foi degradado usando ácido fórmico.

iTRAQ rotulagem de amostras de proteína

análise proteômica baseada em iTRAQ foi feito pelo Protea Biociências (por favor, consulte as instruções do fabricante). Resumidamente, após as concentrações de cinco amostras de cada uma das proteínas analisadas foram medidos, as amostras foram precipitadas com acetona a uma relação 6: 1 (acetona: amostra), e a proteína total de isolados de cinco amostras foram ressuspensas em menos de 60 uL de dissolução tampão e 1 ml de desnaturante do kit iTRAQ. Em seguida, 2 ul de agente de redução e de 1 mL de reagente de bloqueio de cisteína foram adicionadas a cada uma das amostras. Após a digestão por adição de 2 ug de tripsina, as amostras foram marcadas com reagentes iTRAQ (Tabela S1), adicionando o conteúdo do frasco iTRAQ para as soluções de amostra (Protea Biosciences). Os reagentes iTRAQ foram reconstituídos com 50 ul de etanol. Depois o frasco foi adicionado iTRAQ, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 60 min. 100 mL de água des ionizada foi adicionado a cada frasco de amostra, e as amostras foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente. As amostras a ser comparadas umas com as outras foram combinados num grupo e foram liofilizadas e reconstituídas em troca catiónica forte (SCX) de tampão de reconstituição.

Alto desempenho cromatografia líquida de fraccionamento

As amostras de proteínas foram fracionados usando SCX ProteaTip SpinTips (Protea Biosciences). As pontas foram primeiro lavadas duas vezes por adição de 50 uL de solução de reconstituição SCX (Protea Biosciences). As amostras foram então carregadas em pontas de spin e centrifugou-se a 6000 rpm durante 3 minutos e depois lavou-se por adição de 50 ul de solução de reconstituição para o início da ponta de rotação. As amostras nas pontas de spin foram então lavadas de novo com solução de reconstituição SCX e eluída sequencialmente com 150 mL de solução de eluição constituído por 20, 40, 60, 80, 100, 150, 250, ou 500 mM de formato de amónio em 10% de acetonitrilo. Oito fracções correspondentes a cada concentração de sal foram recolhidos. Cada fracção foi feita por liofilização repetitivo e tratamento com ácido. Após a liofilização final, as digestões foram reconstituídos em 40 mL de acetonitrilo /água /ácido fórmico (5% /95% /0,1%)

cromatografia líquida-espectrometria de massa com ionização por electrospray

espectrometria de massa ( MS análise) dessas amostras foi realizada utilizando um sistema QTrap 5500 (Applied Biosystems, Toronto, Canadá) para a aquisição de MS e em tandem MS (MS /MS) de dados. Os péptidos foram carregados em um 100.0 coluna C18 Kinetex × 2,1 mm (100 Â, 2,6 uM; Phenomenex, Torrance, CA, EUA) e, em seguida, submetido a eluição da fase móvel em tampão A e tampão B (ver Tabela S2 para obter informações pormenorizadas sobre eluição). Os péptidos foram eluidos a um caudal de 200 mL /min. O eluente de cromatografia líquida foi dirigido a uma fonte de ionização por electropulverização para a análise quantitativa de tempo-de-voo MS. Electrospray ionização foi realizada para a aquisição dependente da informação no modo de ião positivo com uma voltagem de pulverização de 5 kV e selecionados gama massa de 100-1000

m

/

z

. O sistema QTrap 5500 foi operado em modo de aquisição dependente dos dados. Foram selecionados os três péptidos mais abundante carregadas acima de um limiar de 5-contagem por MS /MS.

Os peptídeos foram identificados e quantificados usando ABI software ProteinPilot Protein 3.0 (Applied Biosystems, CA, EUA). O algoritmo Paragon no software ProteinPilot foi utilizado para a identificação de péptidos. Cada espectro MS /MS foi pesquisada contra a base de dados do Índice de proteína humana Proteína Internacional, e as proteínas identificadas com 95% de confiança foram aceites em função das suas pontuações de confiança obtidos usando o software ProteinPilot. cobertura percentual foi calculada como a percentagem dos correspondentes aminoácidos de péptidos identificados com confiança maior que 0, dividido pelo número total de aminoácidos na sequência.

coloração imuno-histoquímica de tumores PGCC derivados em ratinhos

A inoculação em camundongos nus com células regulares Hey cancro ou PGCCs e crescimento do tumor subsequente foram descritos anteriormente [6]. Dez PGCCs e 1 × 10

6 células cancerosas HEY regulares para cada ratinhos nus foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos. Os ratinhos foram mortos e os tumores removidos quando o diâmetro médio do tumor atingiu 0,5-1,0 cm. a coloração imuno-histoquímica do tecido do tumor foi realizada utilizando o método de avidina-biotina-peroxidase, tal como descrito anteriormente [6]. tecido tumoral embebido em parafina foi desparafinados em xilol e reidratados usando diluições graduais de álcool em água. Depois de ter sido lavada com PBS, as secções do tecido do tumor foram submetidas a recuperação de antigénios em 0,01 M tampão de citrato de sódio (pH 6,0) numa autoclave durante 10 min. Depois de a actividade da peroxidase endógena e a ligação não específica nas secções de proteína foram bloqueados, as secções foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C numa câmara humidi ficada (ver Tabela S3 para informações detalhadas anticorpo). Subsequentemente ao tratamento das amostras com uma IgG anti-coelho de cabra biotinilado, e o sinal foi detectado utilizando um sistema de estreptavidina-biotina marcado na presença do cromogénio 3,3′-diaminobenzidina. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina.

análise Western blot

Com base nos resultados proteomic, um grupo de proteínas potencialmente importantes seleccionados a partir da literatura foram determinados por Western blot. Os extractos celulares de PGCCs purificados, PGCCs com células filhas de brotamento, e as células de controlo foram lisadas numa solução de tampão gelado. As proteínas em que as células foram separadas num gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio-10% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin, EUA). Depois de ser bloqueadas com leite desnatado a 5% em solução salina Tris-tamponada com 0,1% de Tween-20 durante 1 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com os anticorpos primários apropriados a 4 ° C durante a noite e, em seguida, com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 1 h. A expressão proteica foi medida usando pré-misturado reagente ECL Plus (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, EUA) e desenvolvido usando um processador de filme X-OMAT 2000 (Eastman Kodak, Rochester, NY, EUA). Todas as experiências de Western blot foram duplicadas, e β-actina foi utilizado como um controlo de proteína de carregamento.

Resultados

CoCl

2 induzida por formação de PGCCs

Como descrevemos anteriormente, a formação de PGCCs pode ser induzida por tratamento com CoCl

2 [6 ]. Altas concentrações de CoCl

2 matar selectivamente células diplóides, enquanto que baixas concentrações pode induzir a formação de PGCC via fusão celular. Como mostrado na Figura 1, o controlo HEY células foram de forma irregular com pequenas apófises. O tratamento com CoCl

2 a uma concentração elevada (300 ^ M para 72 e 48 h para as células HEY e SKOV3, respectivamente) matando a maioria das células diferenciadas, e PGCCs podiam ser claramente visualizadas depois de removidos as células mortas flutuantes. Após as culturas recuperados de CoCl

2 tratamento, os PGCCs sobreviventes gerados células filhas através de brotação, quando cultivadas em meio completo com soro a 10% [6].

(A) Controle HEY células. (B) HEY PGCCs após o tratamento com CoCl

2. células (C) HEY geração PGCCs filha através de brotamento (setas pretas). (D) As células de controlo SKOV3. (E) SKOV3 PGCCs após o tratamento com CoCl

2. células filhas geração (F) SKOV3 PGCCs via brotação (setas pretas).

Identificação de proteínas e quantificação de proteínas relativa em PGCCs e células cancerosas controle

Para determinar a assinatura global de proteínas associadas com a formação de PGCCs, foi realizada a análise proteômica de PGCCs purificadas e comparou a expressão da proteína em-los com aqueles em células de controle e PGCCs submetidos a brotação. Nós isolado extratos de proteína total de Hey PGCCs sozinho, hey PGCCs com células filhas brotamento, controlam HEY células, SKOV3 PGCCs sozinho, e controlar células SKOV3. As proteínas foram digeridas com tripsina, marcadas com reagentes iTRAQ (114-117), e analisados ​​por meio de espectrometria de massa em tandem para identificar diferenças nos níveis de proteína entre estes grupos. Para aumentar a cobertura da identificação de proteínas e /ou a confiança nos dados gerados, foram amostras iTRAQ-rotulado, em duplicado, do seguinte modo: HEY PGCCs, 114; HEY PGCCs com brotamento, 115; controlar HEY, 116; SKOV3 PGCCs, 116; e controle SKOV3, 117. Usando iTRAQ, foram identificadas e classificadas as diferentes proteínas de acordo com ProtScore não utilizado. A proporção de diferentes reagentes de marcação iTRAQ indicou a abundância relativa das proteínas. Um total de 1.188 proteínas singulares foram identificados com 95% de confiança pelo algoritmo de pesquisa ProteinPilot e combinados com proteínas no banco de dados internacional proteína humana Índice de proteína. A quantificação relativa de péptido foi realizada com o software ProteinPilot 3,0 com análise estatística (

P

0,05) para a selecção de proteínas potencialmente expressos diferencialmente. Em HEY PGCCs, 64 proteínas diferentes foram expressas quando comparado com PGCCs com células-filhas de brotamento e células de controlo; 25 proteínas foram regulados positivamente em PGCCs e 39 foram reprimidos (Tabela 1). Em SKOV3 PGCCs, 62 proteínas diferentes foram expressas em comparação com células de controlo, com 40-regulada e 22 sub-regulada (Tabela 2). Os dados iTRAQ dos vários tipos de células de Hey poderia ser classificado em nove categorias funcionais usando o sistema de classificação PANTERA (www.pantherdb.org; Figura S1), incluindo a actividade de ligação, catalítica, actividade reguladora enzima, actividade de canal iónico, a actividade motora, estrutural atividade molécula, a actividade reguladora da transcrição, atividade regulador de tradução e atividade do transportador

Adesão

Nome Protein

Função

Peptides (95%)

% de cobertura

Ratio. (Amostra 1: 3) valor

P (Amostra 1: 3

Ratio (Amostra 2: 3) valor

P (Amostra 2: 3)

regulada (25) IPI00909303.2CTSB cDNA FLJ58073, moderadamente semelhante a Catepsina B ( *) lisossomais cisteína protease2404.701.75E-024.561.46E-02IPI00011229.1CTSD Catepsina DTumor invasiveness132.774.165.22E-031.778.00E-02IPI00183695.9S100A10 proteína S100-A10cell progressão do ciclo e differentiation148.453.386.16E-024.294.91E-02IPI00845339. 1HSPA1B; HSPA1A cDNA FLJ54392, muito semelhante ao choque térmico de 70 kDa proteína 1 (*) dobramento de proteínas e ajudam a proteger as células dos stress849.453.267.62E-061.443.54E-02IPI00737171.1LOC729317 semelhante à tensão dependente canal de ânions 2Mitochondria mediada apoptosis421.842.718.39E-042.658.23E-02IPI00216308.5VDAC1 ânion seletivo proteína de canal de tensão dependente 1Mitochondria mediada apoptosis129.332.538.72E-021.681.73E-02IPI00220827.5TMSB10 timosina beta-10Cytoskeleton479.552.154.82E-012.611.33E- 02IPI00010402.2SH3BGRL3 putativo descaracterizados proteinpotentially envolvido na resistência das células para o TNF-por-α458.412.141.36E 052.191.52E-03IPI00186711.4PLEC isoformas de 2 plectina (*) a ligação entre os três componentes principais do cytoskeleton433 induzida por apoptose. 672.042.02E-031.781.81E-02IPI00020984.2CANX cDNA FLJ55574, muito semelhantes às moléculas CalnexinChaperone (auxiliando o dobramento de proteínas e controle de qualidade) 231.901.981.38E-012.424.26E-02IPI00940656.1LOC723972; ANP32A 28 kDa proteinInhibitor 1 de PP2A443.721.902. 36E-031.851.55E-02IPI00872814.1MSN (moesin) 68 kDa proteinCross agentes de ligação entre as membranas plasmáticas e actina à base de fator de iniciação cytoskeletons443.061.892.20E-041.794.65E-02IPI00025491.1EIF4A1 eucariótica 4A-IProtein synthesis225.371.645.89E-030.969 .17E-01IPI00220362.5HSPE1 10 proteína de choque térmico kDa, mitocondrial (*) Molecular chaperones1081.371.601.84E-020.979.53E-01IPI00019502.3MYH9 de isoformas 1 de miosina-9 (*) A contração muscular e eucariótica motility233.521.574.19E-021.274 .70E-01IPI00795408.1RPL23 15 kDa proteinRibosomal protein355.711.521.68E-020.895.64E-01IPI00012442.1G3BP1 Ras GTPase-activating proteína de ligação da proteína de ligação 1RNA proteins333.481.503.45E-021.058.64E-01IPI00018352.1UCHL1 ubiquitina carboxi-terminal hidrolase isozima L1Protein pós-translacional modification260.091.434.29E-021.153.60E-02IPI00789551.1SNHG4; MATR3Interaction proteína uncharacterized MATR3 putativas com proteínas da matriz nuclear para formar a fibrogranular network431.841.267.42E-011.454.94E-02IPI00021405.3LMNA isoforma a do Prelamin -A /CReassembly do envelope nuclear e celular division1570.481.247.53E-031.057.28E-01IPI00294578.1TGM2 de isoformas 1 de 2absorption gama-glutamil transferase Protein-glutamina e secretion321.401.249.07E-031.213.24E-01IPI00021812.2AHNAK neuroblasto differentiation- proteína associada AHNAK (*) A saliência pseudopod e migration9084.771.204.81E-021.431.18E-02IPI00099550.1UBQLN1 célula de isoformas 1 de Ubiquilin-1Protein pós-tradução de proteínas uncharacterized modification222.241.189.96E-020.664.57E-02IPI00916861.1MDH1 putativo MDH1An enzima que catalisa a oxidação de malato 134.321.115.28E-010.668.16E-03IPI00927101.1RPSA; RPSAP15; SNORA62; SNORA6 putativa proteína não caracterizada família RPSANon-integrina, receptor de laminina 1.231.821.073.88E-010.401.30E-02Downregulated (39) IPI00217030 .10RPS4X 40S proteína ribossômica S4, família X isoformS4E de ribosomal proteins.150.190.988.27E-010.434.20E-02IPI00003362.2HSPA5 HSPA5 proteinMolecular chaperones1454.200.955.95E-010.774.22E-02IPI00554788.5KRT18 queratina, tipo I do citoesqueleto 18A proteína de queratina relacionada com secretora epithelia853.260.883.80E-020.791.58E-01IPI00003865.1HSPA8 isoformas de uma proteína de choque térmico de 71 kDa cognato (*) e chaperones moleculares como uma ATPase na desmontagem de tubos de clatrina vesicles1156.660.843.24E-010.448.60E- 04IPI00646304.4PPIB peptidil-prolil isomerase cis-trans BApoptotic e necrótica death255.560.832.00E-010.491.41E-03IPI00396485.3EEF1A1 celular factor de alongamento 1-alfa 1 (*) Tradução e exportação nuclear de proteins1157.360.811.24E-010.405.84E fator de splicing /rich arginina–03IPI00010204.1SRSF3 Serina 3RNA splicing262.200.813.40E-020.756.19E-01IPI00909232.1HNRNPC cDNA FLJ53542, muito semelhante ao heterogêneo ribonucleoprote�a nuclear CTranscription566.320.798.86E-020.541.71E-02IPI00472119.2- 30 kDa proteinOther450.000.751.33E-020.582.80E-02IPI00025252.1PDIA3 proteína dissulfeto isomerase-A3Other330.100.753.20E-010.673.85E-02IPI00290460.3EIF3G eucariótica iniciação da tradução subunidade fator 3 GProtein synthesis118.440.751.95E-020.442.14E-01IPI00383296.5HNRNPM isoforma 2 de ribonucleoprote�a nuclear heterogêneo MProtein synthesis661.220.741.81E-030.674.79E-02IPI00784154.1HSPD1 proteína de choque térmico de 60 kDa, mitochondrialMolecular chaperones1356.200.723.32E-020.607.56E-02IPI00216691.5PFN1 Profilin-1Cell motility1092.140.721.06E-010.414 .52E-02IPI00465248.5ENO1 de isoformas alfa-enolase de Alpha-enolaseOther2274.420.711.51E-040.418.15E-03IPI00910458.1HNRNPK cDNA FLJ54552, muito semelhante ao ribonucleoprote�a nuclear heterogêneo KProtein synthesis665.830.699.61E-020.461.39E-02IPI00479191.2HNRNPH1 51 kDa proteinOther548.730.691.38E-010.234.10E-02IPI00554648.3KRT8 queratina, tipo II do citoesqueleto 8Cell skeletal655.690.647.05E-020.352.24E-03IPI00382470.3HSP90AA1 de isoformas 2 de proteína de choque térmico HSP 90 alphaMolecular chaperones941.220.621.20E-010.582 .89E-02IPI00215780.5RPS19 40S proteína ribossômica S19Protein synthesis562.070.602.58E-020.274.04E-02IPI00020599.1CALR CalreticulinPromoting macrófagos para engolir canceroso proteína cells331.650.584.41E-040.835.25E-01IPI00008524.1PABPC1 de isoformas 1 de poliadenilato de ligação perigosa 1Tradução initiation533.650.547.06E-040.517.02E-02IPI00010740.1SFPQ isoforma longa do fator emenda, prolina e glutamina-richProtein synthesis347.810.542.56E-030.481.33E-01IPI00005087.1TMOD3 Tropomodulin-3127.270.549.94E-031.106.73E-01IPI00012493 .1RPS20 40S proteína ribossômica S20Protein synthesis147.900.534.10E-020.422.01E-01IPI00465365.4HNRNPA1 de isoformas A1-A do ribonucleoprote�a nuclear heterogêneo A1Protein synthesis1281.560.516.02E-040.463.10E-01IPI00010779.4TPM4 de isoformas 1 de tropomiosina alfa-4 chainCell motility887 ribonucleoprote�a nuclear .500.471.42E-021.591.75E-01IPI00027834.3HNRNPL heterogêneo LProtein synthesis129.710.474.74E-020.572.79E-01IPI00396378.3HNRNPA2B1 de isoformas B1 de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos A2 /B1Protein synthesis1271.390.467.20E-030.392.49E-03IPI00419585. 9PPIA peptidil-prolil cis-trans isomerase AApoptotic e necrótica death992.730.464.23E-030.372.04E-02IPI00796366.2MYL6 celular cDNA FLJ56329, muito semelhante ao miosina polipeptídeo luz 6Cell motility255.040.452.54E-021.171.84E-01IPI00749113.2DUT de isoformas 3 de Desoxiuridina nucleotidohydrolase 5′-trifosfato, mitochondrialCycle de proteína grupo mobilidade DNA repair142.060.451.67E-010.572.32E-02IPI00419258.4HMGB1 alta B1In o núcleo interage com nucleossomos, fatores de transcrição e histonas, organiza o DNA e regula transcription.550.230.446.41 E-021.744.03E-03IPI00410693.4SERBP1 ARNm SERPINE1 proteína de ligação 1, CRA_dInteract isoforma com CHD3 que é um dos componentes de um synthesis333 proteína histona desacetilase proteína complex348.600.442.48E-040.642.95E-01IPI00966060.1SYNCRIP SYNCRIP (fragmento). 330.441.52E-020.261.77E-04IPI00479997.4STMN1 StathminMicrotubule desmontagem e celular estrutura cycle346.310.276.36E-030.513.94E-02IPI00217468.3HIST1H1B histona H1.5Nucleosome do cromossômica fiber980.090.263.88E-021.185.91E-01IPI00217465.5HIST1H1C histona estrutura H1.2Nucleosome do cromossômica estrutura fiber1182.160.231.27E-021.145.41E-01IPI00217466.3HIST1H1D histona H1.3Nucleosome do cromossômica fiber1077.830.232.02E-020.897.04E-01Table 1. proteínas diferencialmente expressos entre HEY PGCCs, HEY PGCCs . com brotamento, e controle HEY

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Nome Protein

Função

Peptides (95%)

% de cobertura

Ratio (PGCC Amostra: controle)

P valor

proteínas sobre-regulada (40) IPI: IPI00923597.2NDRG1 ADNc FLJ39243 fis, clone OCBBF2008283, altamente semelhante à proteína NDRG1Increase fosforilação de NEU /ERBB2 tirosina-cinase do receptor e induzem o crescimento e diferenciação de cells528.296.493.94E-03IPI: IPI00845339 .1HSPA1B; HSPA1A cDNA FLJ54392, muito semelhante ao choque térmico de 70 kDa 1Important para o dobramento de proteínas e ajudam a proteger as células dos stress1245.875.152.95E-04IPI: IPI00169383.3PGK1 fosfoglicerato quinase 1 é uma enzima envolvida na glycolysis1172.662.491.36E- 03IPI: IPI00479186.7PKM2 isoforma M2 de piruvato-quinase isozimas M1 /​​M2M2-PK é uma enzima citosólica que participa na fosforilação de histona-1.1874.392.431.40E 07IPI: IPI00219018.7GAPDH gliceraldeído-3-fosfato enzima relacionada com a glicólise dehydrogenaseAn 1.577,312. 331.51E-04IPI: IPI00015947.5DNAJB1 DnaJ homólogo da subfamília membro do B 1Interact com STUB1 e HSP (proteína de choque térmico) A4132.622.171.27E-02IPI: IPI00302592.2FLNA de isoformas 2 de Filamin-AParticipates na ancoragem de proteínas de membrana para a actina cytoskeleton1945.622.163.50E-02IPI: IPI00018140.3SYNCRIP de isoformas 1 de heterogêneo QInteract ribonucleoprote�a nuclear com ACF, APOBEC1, SYT7 e SYT9126.652.114.37E-02IPI: desidrogenase IPI00947127.1LDHA L-lactato Uma enzima cadeia isoforma 3AN relacionadas com glycolysis859.002.071 .65E-05IPI: proteína de choque térmico IPI00414676.6HSP90AB1 HSP 90 betaMolecular chaperones852.352.064.19E-03IPI:: proteínas de transporte de vesículas e fusion642.062.072.67E-03IPI IPI00022774.3VCP Transitional retículo endoplasmático ATPasePutative ATP de ligação IPI00298994.6TLN1 Talin- 1Assembly dos filamentos de actina e espalhando e migração de células 330.262.042.55E-03IPI: IPI00396485.3EEF1A1 factor de alongamento 1-alfa 1 (*) Tradução e exportação nuclear de proteins1157.362.021.77E-04IPI: IPI00218319.3TPM3 de isoformas 2 de tropomiosina alpha -3 contracção chainMuscle e o citoesqueleto de não-muscular cells765.732.006.43E-04IPI: IPI00900293.1FLNB filamina-B isoforma 1Intracellular comunicação e de sinalização por reticulação da proteína actin1134.181.998.81E-06IPI: IPI00465248.5ENO1 isoformas alfa- enolase de Alpha-enolaseA glycolytic enzyme2784.561.969.69E-07IPI: IPI00003865.1HSPA8 de isoformas 1 de choque térmico cognato proteína 71 kDa (*) chaperones moleculares e como uma ATPase na desmontagem de revestido de clatrina vesicles1455.571.862.00E-04IPI: IPI00019502.3MYH9 isoforma 1 da miosina-9 (*) contração muscular e eucariótica motility538.981.841.17E-02IPI: IPI00218918.5ANXA1 anexina A1Inhibits a activação de NF-kB através da ligação à p65 subunit669.361.775.58E-03IPI: IPI00909232. 1HNRNPC cDNA FLJ53542, muito semelhante ao ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos CInfluence pré-mRNA de processamento e outros aspectos do mRNA metabolismo e transport366.671.754.91E-03IPI: IPI00930688.1TUBA1B Tubulin alfa-1B chainForm microtubules1248.121.742.23E-02IPI: IPI00014898.3PLEC de isoformas 1 de ligação PlectinA entre os três principais componentes do cytoskeleton332.711.713.68E-02IPI: IPI00013808.1ACTN4 Alpha-actinina-4AN proteína de ligação de actina e envolvida em metastático processes321.621.713.42E-02IPI: IPI00549725.6PGAM1 fosfoglicerato mutase 1Catalyzes o transferência interna de um fosfato group235.041.704.29E-02IPI: IPI00007752.1TUBB2C Tubulin beta-2C chainForm microtubules1062.471.661.00E-02IPI: IPI00930226.1ACTG1 cDNA FLJ57283, muito semelhante ao actina, 2Manutenção citoplasmática da cytoskeleton2070.511.638.74E- 03IPI: IPI00179330.6RPS27A ubiquitina-40S proteína ribossômica S27aTargeting proteínas celulares para degradation557.051.586.80E-03IPI: IPI00382470.3HSP90AA1 de isoformas 2 de proteína de choque térmico chaperones HSP 90 alphaMolecular 1051.051.561.10E-02IPI: IPI00000874.1PRDX1 Peroxirredoxina-1 ( *) Um membro do antioxidante enzyme1070.851.552.46E-04IPI: IPI00335930.1DAZAP1 de isoformas 2 de proteína DAZ-associado 1Involved no desenvolvimento de células germinativas e gametogenesis217.721.541.22E-02IPI: IPI00010796.1P4HB proteína dissulfeto-isomeraseprotein isomerase338.391.524 dissulfeto. 68E-03IPI: IPI00909303.2CTSB ADNc FLJ58073, moderadamente semelhante à Catepsina BLysosomal cisteína protease339.271.503.55E-03IPI: Proteína IPI00027463.1S100A6 progressão do ciclo S100-A6Cell e differentiation350.001.451.28E-02IPI: IPI00418471.6VIM VimentinThe componente principal do citoesqueleto de mesenquimais cells3581.761.431.61E-02IPI: IPI00418169.3ANXA2 de isoformas 2 de anexina A2Involved na motilidade celular, a ligação de complexos de proteínas associadas à membrana ao citoesqueleto de actina, endocitose, 1168.351.414.26E-02IPI: ribonucleoprote�a nuclear IPI00017963.1SNRPD2 pequeno Sm D2Pre (B).