Abstract
inibidores de HSP90 estão actualmente em fase de avaliação clínica em combinação com medicamentos antimitóticos no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), mas pouco se sabe sobre os efeitos celulares desta associação medicamentosa romance. Por conseguinte, foram investigados o mecanismo molecular da acção do IPI-504 (retaspimycin HCl), um inibidor potente e selectivo de HSP90, em combinação com o docetaxel microtúbulos segmentação agente (MTA), em modelos pré-clínicos de NSCLC. Foram identificados um subconjunto de linhas celulares de NSCLC na qual estas drogas actuam em sinergia para aumentar a morte celular. modelos de xenoenxerto de NSCLC, mostraram inibição de crescimento do tumor, e em alguns casos, de regressão em resposta a tratamento de combinação. O tratamento com IPI-504 aumentou os efeitos antimitóticos do docetaxel que conduzem à hipótese de que o ponto de verificação mitótica é necessária para a resposta à combinação de drogas. Apoiando esta hipótese, substituindo o ponto de verificação com um inibidor da quinase Aurora diminuiu a sinergia morte celular de IPI-504 e docetaxel. Para investigar a base molecular da sinergia, uma imparcial rotulagem isótopo estável por aminoácidos em cultura de células foi empregado (SILAC) abordagem proteômica. Várias entidades reguladoras mitóticos, incluindo componentes da ubiquitina ligase, anafase promover complexo (APC /C), foram especificamente regulada negativamente em resposta a tratamento de combinação. Perda de APC /C por RNAi células sensibilizadas ao docetaxel e aumentado os seus efeitos anti-mitóticos. O tratamento com um inibidor da PLK1 (BI2536) também sensibilizados células de IPI-504, indicando que os efeitos da combinação pode ser largamente aplicável a outras classes de inibidores mitóticos. Nossos dados fornecem uma base racional pré-clínico para testar a combinação de IPI-504 e docetaxel em CPNPC
Citation:. O’Connell BC, O’Callaghan K, Tillotson B, Douglas M, Hafeez N, West KA, et ai. (2014) HSP90 Inibição Melhora antimitóticos Droga-Induzido mitótico Detenção e morte celular em modelos pré-clínicos de Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (12): e115228. doi: 10.1371 /journal.pone.0115228
editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de julho de 2014; Aceito: 20 de novembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 O’Connell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses: Os autores ainda gostaria de esclarecer que, no vez que o trabalho foi feito, os autores eram funcionários e acionistas da Infinity Pharmaceuticals, Inc. Isso não altera a sua adesão a PLOS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
o mitótico, ou checkpoint montagem do fuso ajuda a manter a integridade genômica, impedindo a segregação errada dos cromossomas. Um sistema de vigilância altamente orquestrada composto por numerosas proteínas detecta cinetócoros não acopladas, ou a falta de tensão adequada entre o fuso mitótico, provocando o chamado “ponto de verificação de resposta”, o que conduz a paragem da mitose. divisão celular normal requer passagem de sucesso pelo posto mitótico. A falha em satisfazer os requisitos de ponto de verificação dentro de um tempo relativamente curto (1-2 dias) pode resultar na aneuploidia, catástrofe mitótica ou derrapagem mitótico seguido por uma variedade de destinos celulares, incluindo a morte celular, senescência, ou endorreduplicação [1]. Embora os mecanismos pelos quais a mitose prolongados conduz à morte das células não são claros, um papel para os membros da família BCL2 anti-apoptóticos foi reportado [2]. Durante paragem da mitose prolongada, quinase dependente (CDK) proteínas ciclina-ciclina fosforilar
BCL2
membros da família, incluindo BCL2, BCL-XL, e MCL1. Fosforilação de BCL2 e BCL-XL resulta na liberação de proteínas pró-apoptóticos BAX /BAK; Considerando fosforilação de MCL1 cria um local de reconhecimento para a ligase E3, APC /CDC20, orientando-o para a degradação proteossómica. redundância funcional é provável que exista entre o
BCL2
membros da família na mediação da resposta morte celular à mitose prolongada.
medicamentos antimitóticos que visam dinâmica dos microtúbulos (MTA) são amplamente utilizados na clínica para tratar uma ampla gama de cancros. Estes incluem agentes de estabilização de microtúbulos, (taxanos, incluindo o paclitaxel e o docetaxel, epotilonas e) e agentes de microtúbulos desestabilizar (incluindo alcalóides da vinca tais como vincristina e vinblastina) [3]. Além disso, maitansinas (DM1, DM4) e auristatinas (MMAE, MMAF) interagir com o local de ligação da vinca em tubulina e são geralmente utilizados como a toxina ligada ao anticorpo conjugados da droga [4]. Enquanto as células tumorais em divisão são suscetíveis a MTA, outros processos celulares dependentes de microtúbulos tais como o tráfico de vesículas, transporte neuronal, e integridade do citoesqueleto também são interrompidas, levando a efeitos colaterais indesejados, incluindo neurotoxicidade e toxicidade mielóide [5]. Em um esforço para superar esses efeitos colaterais, medicamentos antimitóticos que têm como alvo as proteínas do motor do fuso (KSP, Eg5) ou cinases mitóticas (PLK1, Aurora quinase A, Aurora Kinase B) estão sendo desenvolvidos, mas tiveram um sucesso limitado até agora no Clinic [6]. A HSP90 é uma chaperona molecular que é responsável para o enrolamento adequado de numerosas proteínas clientes, incluindo muitos oncogenes e supressores de tumores mutantes [7]. O inibidor de HSP90 IPI-504 demonstrou actividade anti-neoplásica em vários modelos pré-clínicos de cancro, fornecendo lógica para o seu desenvolvimento clínico [7], [8], [9], [10], [11]. Curiosamente, a actividade sinérgica entre a inibição e taxanos HSP90 tem sido observada em modelos pré-clínicos de NSCLC [12] e os inibidores de HSP90 foram avaliadas em combinação com docetaxel em estudos clínicos de NSCLC (NCT01646125, NCT01348126, NCT01798485, NCT01362400). Foram identificados um subconjunto de linhas celulares de NSCLC em que IPI-504 e ato docetaxel em sinergia para reforçar a morte celular in vitro e inibem o crescimento do tumor in vivo. Porque a base molecular exacto para esta sinergia não tenha sido determinada, é investigado o mecanismo de acção molecular (MOA) de IPI-504 em combinação com o docetaxel e outros antimitóticos. Nossos estudos revelaram uma MOA envolvendo um alongamento depende do ponto de verificação da mitose. Além disso, foram identificados componentes APC /C como potenciais novas proteínas cliente HSP90, parcialmente responsáveis pela sinergia de drogas.
Materiais e Métodos
Ética declaração
Este estudo foi realizado em conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório impressos pelo Conselho Nacional de Pesquisa do Academics Nacional. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Infinity Pharmaceuticals, Inc. Os animais foram eutanasiados por CO
2 inalação de acordo com as diretrizes IACUC. Todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento animal.
As linhas celulares
linhagens de células NSCLC Humano H292, A549, H522, H1993, H1793 obtidas da American Type Culture Collection foram mantidos por várias passagens com menos de 5% CO
2 a 37 ° C em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich).
Os estudos em animais
de cinco a seis semanas de idade do sexo masculino NCR nu /nu atímicos ratinhos foram adquiridos a Taconic Farms. Os xenoenxertos foram gerados por implantação subcutânea de 1 a 5 × 10
6 células no flanco direito de ratos, e o tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram um volume médio de 120 a 300 mm
3. IPI-504 foi administrado intraperitonealmente duas vezes por semana a uma dose de 50 mg /kg. O docetaxel (McKeeson Pharmaceuticals) foi administrado uma vez por semana a 15 mg /kg (H1993, A549 e H292 modelos de xenoenxerto) ou 5 mg /kg (modelo de xenoenxerto de H292) por injecção intraperitoneal.
Os tumores foram medidos três vezes por semana utilizando calibradores digitais e o volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: (comprimento x largura
2) /2. Os resultados são apresentados como o volume médio do tumor ± erro padrão da média (SEM).
proliferação celular
As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /cavidade 24 horas antes para o tratamento com combinações de IPI-504 e docetaxel, tal como indicado. A proliferação celular foi medida por Alamar Blue (Life Technologies) ou celular Titer Glo (Promega). A morte celular foi medida através da percentagem de células positivas (7AAD goiaba Viacount Flex) ou pela percentagem de células positivas para a caspase 3 clivada num ensaio à base de luminescência (Promega; Caspase-Glo3 /7)
estudos de sinergia
índices de combinação (IC) foram determinados pelo método de Chou e Talalay [13] utilizando rácios de drogas fixos e não fixos e software CalcuSyn (Biosoft). CI valores 1 indicam sinergia, com valores . 0,5, indicando sinergia robusta
imunotransferência /imunoprecipitação
Para imunotransferência, as células foram lisadas em tampão de lise RIPA (Sigma-Aldrich) suplementado com protease inibidores (Roche) e inibidores de fosfatase (HALT; Thermo Fisher Scientific). Para imunoprecipitações HSP90, os sedimentos celulares foram colhidos tratamento pós fármaco em tampão de lise não-detergente (50 mM de Tris pH 7,4, 20 mM de NaCl, 2 mM MgCl
2, 1 mM de EDTA, 10% glicerol, comprimido inibidor da protease (Roche) e inibidores de fosfatase (Thermo Fisher Scientific)) seguido por três ciclos de congelação descongelação sequenciais para lise. Imunoprecipita�es foram realizadas durante a noite a 4 ° C, utilizando um anticorpo monoclonal HSP90 (Santa Cruz) e contas de Sepharose GammaBind G (GE Healthcare).
Stable Isotope Rotulagem de Aminoácidos em Cultura (SILAC) rotulagem e espectrometria de massa
marcação metabólica de células H292 foi realizada com arginina normal e lisina ou variantes isotópicas mais pesadas dos dois aminoácidos L-lisina-HCl [
13C
6], L-arginina-HCl [
13C
6,
15 N
4] usando de Invitrogen kit SILAC-Flex mídia e arginina pesada comprado de Thermo Fisher Scientific. Para diminuir a complexidade da amostra, de HSP90 imunoprecipitações foram realizadas em células tratadas com droga e as proteínas foram separadas por 1D-SDS-PAGE. Proteínas de fatias de gel foram digeridos com tripsina porcina e analisadas por LC-MS /MS. Peptídeos foram limpos e concentrado usando dicas de palco C18 (Proxeon) e separado usando on-line C18 de fase inversa nanoescala espectrometria de massa de cromatografia líquida tandem em uma bomba Surveyor MS conectado a um gradiente linear de 2 h LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fischer Scientific) usando . Fragmentação dos 10 melhores peptídeos em cada amostra foi realizada por dissociação induzida por colisão. arquivos Raw MS de LTQ-Orbitrap foram analisados utilizando MaxQuant (versão 1.2.2.4) [14]. MS /MS espectros foram comparados com o banco de dados versão 3.68 chamariz IPI-humano utilizando o motor de busca Andromeda. A taxa de detecção falsa de 0,01 foi utilizado em ambos os níveis de peptídeos e proteínas.
estudos RNAi
H292 células foram transfectadas com 30 nM siRNA usando RNAimax (Invitrogen). siRNAs foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific como ON-Target Plus piscinas SMART (mistura de 4 siRNAs individuais por gene). sequências piscina siRNA SMART são: não-alvo (mexidos) controle: UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA; ANAPC3: GGAAAUAGCCGAGAGGUAA, CAAAAGAGCCUUAGUUUAA, AAUGAUAGCCUGGAAAUUA, GCAUAUAGACUCUUGAAAG; e ANAPC4: GCCAGAAAGUUUACUCAUA, GAUGAACAGUGUAGUGCUA, ACACGUAGAUUGUUCAAAU, CGCUUUAGCUCCAGAGAUA. Quatro horas após a transfecção, as células foram semeadas em placas de 96 cavidades, tratado com uma titulação da dose de docetaxel e colhidas por citometria de fluxo (pH 3) ou a proliferação de células (7AAD) 30 h ou 72 h após o tratamento de drogas, respectivamente.
a citometria de fluxo
Os sedimentos celulares foram recolhidos por tripsinização, fixadas em paraformaldeído a 4% a 37 ° C durante 15 minutos, colocada em gelo durante 5 min, e, em seguida, sedimentadas e ressuspensas em metanol arrefecido em gelo durante 30 min em Gelo. Em seguida, os sedimentos celulares foram lavadas em soro de albumina bovina a 1% (BSA) em PBS, duas vezes, seguido por incubação com um anticorpo conjugado com FITC pH 3 durante 2 h RT. Os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com BSA a 1% /PBS e ressuspensas em 2 ug /ml Hoechst (Molecular Probes) /PBS a 37 ° C durante 15 min. As células coradas foram analisadas utilizando um fluxo BD LSRII Fortessa citómetro. células positivas para FITC foram medidas a um comprimento de onda de 488 nm, e o teor de ADN foi medida por coloração de Hoechst usando um laser de UV. A análise dos dados foi realizada utilizando software FlowJo (V7.6.3).
Microscopia
imagens de contraste de fase foram capturados usando um TE2000-S microscópio Nikon Eclipse e software Local para aquisição de imagem (V4.7) .
mitótico agitar-off
as células mitóticas foram colhidas por punção manual do frasco para desalojar as células mitóticas em suspensão. As células mitóticas foram isolados a partir do meio por centrifugação (1500 rpm, 5 min), lisadas em tampão RIPA, e incubou-se na presença ou ausência de fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich).
Anticorpos e reagentes
Anticorpos para HSP90 (Santa Cruz), HSP70 (Santa Cruz), ciclina B (BD Biosciences), Securin (Abcam), ANAPC3 (Bethyl Laboratories), ANAPC4 (Bethyl Laboratories), de quinase Aurora B (Bethyl Laboratories), MCL1 ( Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), Receptor de Glucocorticóides (Cell Signaling Technology), e FITC-S10 fosfo-Histona H3 (Cell Signaling Technology) foram utilizados para a imunoprecipitação, imunotransferência e citometria de fluxo. Aurora A inibidor /B (ZM447439) foi adquirido a Merck e inibidor da PLK1 (BI2536) foi adquirido a partir de SelleckChem. IPI-504 foi sintetizado no Infinity Pharmaceuticals, Inc.
Resultados
IPI-504 e docetaxel em crescimento do tumor suprimir combinação em NSCLC modelos de xenotransplante tumoral
Para identificar linhas celulares de NSCLC demonstrando sensibilidade in vivo para a combinação de IPI-504 e docetaxel, os ratinhos portadores de tumores de xenoenxerto (H1993, A549, H522 e H292) foram tratados com veículo, 50 mg /kg de IPI-504 sozinho, 5 ou 15 mg /kg de docetaxel, ou uma combinação de 50 mg /kg de IPI-504 e 5 ou 15 mg /kg de docetaxel. O tratamento com IPI-504 sozinho inibiu o crescimento tumoral em relação ao veículo em xenoenxertos de H1993, A549, H292 e (22-48%), mas não teve actividade em xenoenxertos H522 (Fig. 1). actividade de agente único, foi observado após tratamento com docetaxel, resultando na inibição do crescimento em comparação com o veículo H1993, A549 e H292 xenoenxertos (56-69%) (Fig. 1A-C). Em contraste com a actividade de agente único, a regressão do tumor foi observada em resposta a combinadas IPI-504 e docetaxel em H1993 e modelos de xenoenxerto A549 (Fig.s. 1A e B). a inibição do crescimento do tumor foi aumentada pela combinação em comparação com qualquer dos agentes sozinho único em tumores de xenoenxerto de H292 (Fig. 1C). Por causa da forte actividade de agente único no modelo de xenoenxerto de H522, foi docetaxel dose reduzida de 15 para 5 mg /kg para o estudo de combinação. A combinação de 5 mg de docetaxel /kg e 50 mg /kg de IPI-504 resultou na inibição do crescimento tumoral de 71%, em comparação com veículo (Fig. 1D). Estes dados indicam potenciais efeitos sinérgicos de IPI-504 e docetaxel na inibição do crescimento em modelos pré-clínicos de NSCLC.
NCR nu /nu ratos machos homozigotos foram implantados subcutaneamente com (A) H1993, (B) A549 (C ) H292 e H522 (D) e as células tratadas com o veículo DMSO (círculos pretos), IPI-504 (quadrados verdes), DTX (diamantes azul), ou a combinação de IPI-504 e DTX (triângulos vermelhos). IPI-504 foi administrada por injecção IP com uma dose de 50 mg /kg, duas vezes por semana para um total de 6 doses. DTX foi administrada a 5 mg /kg (H522) ou 15 mg /kg (H1993, A549, H292) por injecção IP, por semana, durante um total de 3 doses. Números sobre gráficos representam percentagem média de inibição do crescimento do tumor em relação ao grupo tratado com veículo. Onde indicado, * denota significância estatística (p 0,05) entre o tratamento de combinação e DTX braços de tratamento medidos no dia 30 (H1993, H549, H522), utilizando o teste T de Student
IPI-504 e docetaxel. em combinação mostra em sinergia in vitro em linhas de células NSCLC
Para investigar a MOA de melhorada na inibição de tumor in vivo com combinadas IPI-504 e o docetaxel, o efeito da combinação sobre a morte celular e a proliferação de células foi determinada in vitro. Para os estudos de morte celular em células H292, índices de combinação foram calculados usando o método da razão de droga não fixa de Chou e Talalay, com valores de CI 1,0 indicativo de sinergia [13]. Doses de IPI-504 (75-125 nM) eficaz para a inibição do crescimento (S1A Fig.) Foram largamente ineficazes na obtendo-se uma resposta citotóxica acima do controlo em células H292 (Fig. 2A, painel da esquerda). No entanto, a combinação de IPI-504 (75-125 nM) com 50 nM de docetaxel aumentou a morte celular de 24% H292 (docetaxel) a 61-68% (combinação), com valores de CI indicativos da sinergia forte (IC 0,2). Da mesma forma, a combinação de docetaxel (1-4 nM) com 2 uM de IPI-504 aumentou a morte celular H292 de 37% (IPI-504 sozinho) a 63 a 71% (combinação), com valores de CI indicativos da sinergia (CI 0,5) ( Fig. 2A, painel da direita).
(morte A) celular foi medida 48 h após o tratamento com combinações não fixas rácio de drogas de IPI-504 e docetaxel (DTX) por 7AAD em células H292. Índices de valores de combinação (CI) foram calculados utilizando software CalcuSyn (Biosoft) com valores 0,5 indicativo de forte sinergia. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 4). Os valores para todos os tratamentos de combinação foram estatisticamente significativos em comparação com os tratamentos de agente único, tal como determinado pelo teste t de Student (p 0,01). morte (B) das células foi medida 30 h após o tratamento de drogas em células H1993 utilizando o ensaio de luminescência Caspase-Glo3 /7. Os dados representativos são mostradas (N = 2). (C) As células foram tratadas com proporções fixas de drogas de IPI-504 e DTX durante 72 h; proliferação celular foi medida com azul de Alamar. São mostrados os isobologramas normalizados. D = dose ED
50 = dose necessária para alcançar a inibição do crescimento de 50%. Pontos do gráfico referem-se a proporção de D /ED
50 para DTX no eixo-x vs D /ED
50 para IPI-504 no eixo y. Os pontos de dados que caem na diagonal representam aditividade; acima da diagonal, antagonismo; abaixo da diagonal, a sinergia. (D) O tratamento com inibidor PLK1 (BI2436) sensibiliza células H292 ao IPI-504. As células H292 foram tratados durante 72 h, com uma titulação da dose de IPI-504 sozinho (losangos azul) ou em combinação com 5 nM BI2536 (quadrados vermelhos), seguido por ensaio de morte celular (7AAD). As barras de erro representam o desvio padrão (n = 2).
Em H1993 células, as combinações de baixas (2 nM) ou altas (20 Nm) doses de docetaxel com doses de IPI-504 representando o CE
20 (14 nM), CE
50 (59 nM), ou CE
80 (255 nM) para a inibição do crescimento (S1A Fig.) foram examinados para morte celular utilizando um ensaio de caspase-Glo3 /7. Aumentos de 2- a 4-vezes na actividade de caspase foram observados com a combinação de drogas em relação a respostas de agente único para todos, mas a combinação de menor dose de 14 nM IPI-504 e 2 nM de docetaxel (Fig. 2B).
Para os estudos de proliferação celular, um painel de linhas de células foi tratada com proporções fixas de drogas. Uma resposta sinergística a combinação droga foi observada em todas as quatro linhas celulares para os quais os efeitos da combinação foram anteriormente observados in vivo (Fig 2C;. A549, H1993, H292, H522 e). Não houve qualquer indicação de um efeito sinérgico da combinação de drogas em células H1793, sugerindo que certas linhas de células pode não ser sensível a esta combinação específica (Fig. 2C). Infelizmente, os estudos de xenoenxerto de confirmação não eram possíveis com H1793, como as células não crescem tanto em ratinhos nu /nu ou NOD /SCID imunocomprometidos NCR. As células H292 foram escolhidos para a maioria dos estudos sobre os mecanismos subsequentes, uma vez que a resposta exibida mais forte e mais coerente sinérgica para a combinação de drogas in vitro, no entanto, outras linhas de células foram também estudados em casos específicos. No geral, estes resultados indicam que algumas linhas celulares de NSCLC mostram uma diminuição marcada na proliferação de células e aumento da morte celular por apoptose com combinadas IPI-504 e o tratamento com docetaxel em comparação com os agentes individuais por si só.
Inibidores concebidos para direccionar cinases mitóticas, tais como PLK1, representam uma classe alternativa de antimitóticos a MTA. PLK1 é um importante regulador da mitose e uma proteína que interage de HSP90 conhecido [15]. Um inibidor de PLK (BI2536) exibindo 10 vezes maior selectividade para PLK1 em comparação com PLK2 ou PLK3 foi utilizada para investigar os efeitos da combinação com IPI-504. O tratamento de células H292 com um
50 dose de CE de IPI-504 para a inibição de crescimento (175 nM) aumentou a morte celular de 24% quando combinada com o veículo para 45% quando combinada com uma
50 dose de CE de BI2536 para o crescimento inibição (5 nM) (Fig. 2D e S1B Fig.). Estes dados são consistentes com a hipótese de que IPI-504 combina-se com diferentes classes de antimitóticos para promover a morte celular por mecanismos independentes.
IPI-504 e docetaxel tratamento resulta na acumulação de células mitóticas
dado que os efeitos antimitóticos são de docetaxel a base molecular para a sua toxicidade, testou-se a previsão de que IPI-504 aumenta os efeitos antimitóticos do docetaxel. A população mitótico, também conhecido como índice mitótico, foi medida em células H292 tratadas em vários pontos de tempo e dose combinações de IPI-504 e docetaxel. A combinação de dose baixa (2 nM) de docetaxel com IPI-504 resultou em um aumento transitório do índice mitótico (10% em 8 horas para 26% em 30 h) antes de voltar para os níveis basais (4% em 48 h) (fig. 3A). Em contraste, o índice mitótico não subisse acima da linha de base durante toda a duração da experiência em células tratadas com qualquer IPI-504 ou docetaxel como agentes isolados (Fig. 3A). Observou-se um aumento transitório semelhante do índice mitótico seguido por um declínio após o tratamento de células H292 com uma alta dose de docetaxel (20 nM) como um agente único (Fig. 3B, painel esquerdo). A adição de IPI-504 para maior dose de docetaxel aumentou a amplitude e a duração da paragem da mitose (Fig. 3B, painel esquerdo). Em contraste com as células H292, não foi observado um aumento do índice mitótico após tratamento de células A549 com a dose baixa (2 nM) docetaxel e IPI-504 combinação (dados não mostrados), indicando que a resposta a esta combinação de fármacos pode ser a célula tipo específico. No entanto, um aumento na amplitude e a duração da paragem da mitose foi observada em células A549 tratadas com o docetaxel dose elevada (20 nM) e IPI-504 combinação em relação ao docetaxel, comparável ao observado nas células H292 (Fig. 3B, direita painel). Desde que os efeitos observados mitóticas em combinação com IPI-504 foram consistentes em vários tipos de células, de alta dose de docetaxel foi escolhido para estudos MOA subsequentes.
CE
50 doses de IPI-504 foram determinados por 72 h celular Titer Glo (S1A Fig.). H292 (A, B painel esquerdo) e A549 (B, painel da direita) células foram tratadas com DMSO (diamantes azuis), IPI-504 (quadrados vermelhos), DTX (triângulos verdes) ou IPI-504 /combinação DTX (círculos roxos) e colhidas nos pontos de tempo indicados para a presença do marcador mitótico, pH3. Os dados representativos são mostrados (n = 2).
O checkpoint mitótico é parcialmente responsável pelos efeitos de morte celular de IPI-504 e docetaxel
A paragem da mitose precedeu a morte celular em IPI -504 e células tratadas com docetaxel sugerido que a activação do checkpoint mitótico é um determinante importante da resposta a morte celular. Para testar esta hipótese, um inibidor selectivo da quinase Aurora A /Aurora B (ZM447439) foi usado para substituir o checkpoint mitótico em células H292 tratadas com o IPI-504 e combinação de docetaxel. O tratamento de células H292 com ZM447439 resultou na revogação da IPI-504 e barreira de paragem mitótica induzida por docetaxel, tal como determinado por uma diminuição acentuada no índice mitótico (Fig. 4A, painel da esquerda). imagens de contraste de fase fornecida uma confirmação visual das células arredondadas para cima (mitóticas), destaque em culturas de IPI-504 e células de docetaxel tratados, em comparação com a morfologia mais achatada de IPI-504, docetaxel, e ZM447439 células tratadas (Fig. 4A, direita painel). Para avaliar o efeito da substituição de checkpoint mitótico, a morte celular foi medida após o tratamento de células H292 com IPI-504 e docetaxel na presença ou ausência de ZM447439 (Fig. 4B). Enquanto os efeitos da inibição de quinase Aurora na morte celular mostrou efeitos variáveis quando combinado com qualquer IPI-504 ou docetaxel como agentes individuais (S2 Fig.), O tratamento com ZM447439 parcialmente resgatados da sinergia morte celular de IPI-504 e docetaxel, diminuindo a percentagem de células mortas de 40% a 22% (Fig. 4B). Isto é consistente com a hipótese de que o ponto de verificação mitótica é parcialmente responsável por este efeito sinérgico.
H292 células foram tratadas durante 30 h (A, C) ou 48 h (B) com combinações de doses indicadas de IPI-504 (175 nM), DTX (20 nM) e o inibidor de quinase Aurora ZM447439 (9 jiM). As células foram colhidas por (a) a citometria de fluxo (pH 3) e de imagem de contraste de fase, a morte celular (B) (7AAD), e (C) análise de imunomarcação. Uma seta indica uma migração lenta, forma fosforilada de Securin. As barras de erro para índice mitótico e morte celular representam o desvio padrão das réplicas de dois experimentos independentes.
concomitante com paragem da mitose, combinações de dose de docetaxel IPI-504 e levou a uma acumulação das proteínas mitóticas Securin, a ciclina B, e AURKB (Fig. 4C). O aparecimento de uma forma de migração lenta de Securin, pensado para representar a forma activa, fosforilada [16] foi observada especificamente em células tratadas com a combinação de IPI-504 e docetaxel (Fig. 4C, seta). A forma de migração lenta foi convertido para a forma rápida migração após tratamento com fosfatase, confirmando que a forma de migração lenta representa a forma fosforilada (S3 Fig.). Revogação de IPI-504 e docetaxel induzida a regulação positiva de proteínas mitóticas Securin, ciclina B, e AURKB foi observado em presença de co-tratamento com ZM447439 (Fig. 4C). Em contraste, a co-tratamento com ZM447439 não revogar IPI-504 induzida up-regulação da HSP70, um marcador substituto para a inibição HSP90 [17], indicando que IPI-504 ainda está ativa nestas células.
tem sido relatado que durante a paragem da mitose prolongada, a fosforilação do MCL1 proteína anti-apoptótica pela ciclina B-CDK1 inicia a sua destruição APC /C-dependente, levando a morte celular durante a mitose [18]. Curiosamente, foi observada sub-regulação da proteína MCL1 especificamente em células tratadas com H292 a IPI-504 e docetaxel, um efeito que foi anulada após co-tratamento com o inibidor de quinase Aurora (Fig. 4C).
anaphase promovendo complexo (a /C APC) componentes são especificamente empobrecido do interactome HSP90 no IPI-504 e docetaxel trataram células
Após a inibição da HSP90, proteínas clientes deformadas dissociar HSP90 e, posteriormente, são direcionados para a degradação mediada por proteassoma [19]. Para identificar proteínas clientes potenciais que contribuem para a sinergia de IPI-504 e docetaxel, SILAC foi realizada e HSP90 interagindo proteínas que compreendem o “interactoma” foram identificadas em condições de tratamento da droga por espectrometria de massa. O interactoma HSP90 para a experiência para a frente na qual H292 células marcadas com isótopos pesados de lisina e arginina foram tratados com a combinação de IPI-504 e células de docetaxel e H292 marcado com lisina normal e arginina foram tratados só com veículo foi analisada e comparada com os dados obtida a partir da experiência inversa, em que H292 células marcadas com isótopos pesados foram tratados com veículo sozinho e células H292 marcados com os isótopos normais foram tratados com a combinação de IPI-504 e docetaxel (Fig. 5A). Como esperado, a Hsp70 foi fortemente sobre-regulada no interactoma HSP90 sobre IPI-504 e o tratamento com docetaxel (Fig. 5B) [17]. Da mesma forma, Glucocortocoid Receptor (GR), uma proteína conhecida cliente HSP90, foi fortemente regulada para baixo a partir da interactoma HSP90 mediante tratamento de combinação (Fig. 5B) [20]. Foram identificadas várias proteínas clientes potenciais novos HSP90 que foram regulados negativamente em resposta à combinação, alguns dos quais desempenham um papel na resposta checkpoint mitótico (S1 Tabela). Estas incluíram dois componentes do APC /C, e ANAPC3 ANAPC4 (Fig. 5B). Para confirmar os dados SILAC, abundância de proteína foi determinada por análise de transferência de Western de lisados obtidos a partir de células tratadas com H292 IPI-504 e docetaxel em combinação (Figura 5C;.. S4 figura). Semelhante ao GR, a sub-regulação de ambos ANAPC3 ANAPC4 e foi observada após tratamento de H292 com a combinação de IPI-504 e docetaxel em comparação com veículo (Fig. 5C). A sobre-regulação de Hsp70 foi confirmada após o tratamento com IPI-504 sozinho ou em combinação com docetaxel (Fig. 5C) .A contribuição de APC /C para a célula da morte sinergia com a combinação de IPI-504 e o docetaxel foi avaliada examinando se perda de componentes da APC /C poderia substituir IPI-504 na sensibilização de células ao docetaxel. A APC /C componentes ANAPC3 e ANAPC4 foram derrubadas com siRNA individualmente ou em combinação, e os efeitos sobre a proliferação celular foram medidos após o tratamento com docetaxel. Em concentrações de docetaxel superior a 5 nM, o patamar de morte celular aumentou de 63% no controlo siARN mexidos, a 73% sobre knockdown ANAPC4, e 80% aos ANAPC3 knockdown sozinho ou em combinação com knockdown ANAPC4 (Fig. 5D, deixou painel). A perda de componentes da APC /C aumentou os efeitos antimitóticos de docetaxel, aumentando o índice mitótico de 17% com docetaxel (10 nM) sozinho a 33% quando combinada com a perda ANAPC3 /ANAPC4 (Fig. 5D, painel da direita). A análise Western blot confirmou knockdown eficiente dos componentes do APC /C (Fig. 5E).
(A) Stable Isotope Rotulagem de Aminoácidos em Cultura (SILAC) esquemático. Marcadas metabolicamente H292 células foram tratadas durante 24 h com a combinação de 300 nM IPI-504 e 10 nM DTX ou veículo (DMSO), seguido de identificação da interactoma HSP90 por espectrometria de massa. (B) Os dados brutos do estudo SILAC. Os pontos de dados no canto superior direito e inferior esquerdo quadrantes representam proteínas que são up-regulamentados e para baixo-reguladas, respectivamente, no interactome HSP90 no tratamento com a combinação, em comparação com veículo. As duas setas no quadrante superior direito representam fragmentos peptídicos independentes com sequências únicas de segmentação HSP70. (C) Análise de imunotransferência verifica o esgotamento de ANAPC3 e ANAPC4 24 h após o tratamento de células com 300 nM de H292 IPI-504 e 10 nM DTX combinação. GR = Receptor de Glucocorticóides. (D) A perda de componentes da APC /C por RNAi sensibiliza células H292 para DTX morte celular mediada (72 h, 7AAD) (painel da esquerda) e aumenta o índice mitótico (30 h, pH 3) (painel da direita). células H292 foram transfectadas com nontargeting mexidos siRNA (diamantes azuis) ou ANAPC3 de siRNA segmentação (quadrados vermelhos), ANAPC4 (triângulos verdes), ou ANAPC3 /combinação ANAPC4 (círculos roxos). análise (E) Immunoblot mostrando eficiência knockdown. Os dados representativos são mostrados (n = 2).
Discussão
MTAs que perturbam dinâmica dos microtúbulos estão entre os tratamentos antimitóticos mais eficazes para uma ampla gama de cânceres. Infelizmente, as toxicidades relacionadas com o MTA e resistência aos medicamentos continuam a ser grandes desafios.