Abstract

Fundo

Devil Facial doença tumoral (DFID) é um câncer clonal única que ameaça maior marsupial carnívoro do mundo, o Tasmanian diabo (

Sarcophilus harrisii

) de extinção. Este cancro transmissível é passado entre demônios individuais por implante de células durante as interações sociais. O tumor surgiu em uma célula de Schwann de um único demônio mais de 15 anos atrás e desde então tem se expandido por clonagem, sem mostrar sinais de envelhecimento replicativo; em contraste com uma célula somática que exibe uma capacidade finita para replicação, conhecido como o “limite de Hayflick”.

Metodologia /Principais Achados

No presente estudo investigamos o papel do comprimento dos telômeros , medido como Telómero Número de cópia (TCN), e a expressão do gene da telomerase e shelterin, bem como a actividade de telomerase em manter a hiperproliferação de células de tumor do diabo facial (DFT). Nossos resultados mostram que as células DFT têm telômeros curtos. O DFID TCN não diferem entre regiões geográficas ou entre cepas. No entanto, TCN tem aumentado ao longo do tempo. proliferação celular ilimitado é provável que tenha sido conseguido através do observado aumento da regulação da subunidade catalítica da telomerase (

TERT

) e ativação concomitante de telomerase. Aumento da regulação do componente central do shelterin, o

TRF1

-intercating factor nuclear 2 (

TINF2

) fornece DFT um mecanismo de homeostase comprimento dos telômeros. A maior expressão de ambos

TERT

e

TINF2

também pode proteger as células DFT de instabilidade genómica e aumentar a proliferação do tumor.

Conclusões /Significado

células DFT parecem controlar e regular o comprimento dos telômeros individuais: telômeros mais curtos ou seja, são alongadas pelo aumento da regulação de genes relacionados com a telomerase; telômeros mais longos são protegidos de alongamento adicional por membros do complexo shelterin, o que pode explicar a falta de variação espacial e tensão no número de cópias do telômero DFT. O aumento longitudinal observada na expressão de genes em amostras de tecido DFT e atividade da telomerase em linhas de células DFT pode indicar uma selecção para os tumores mais estáveis ​​com maior potencial proliferativo

Citation:. Ujvari B, Pearse AM, Taylor R, S Pyecroft , Flanagan C, Gombert S, et al. (2012) Telomere Dynamics e homeostase um cancro transmissível. PLoS ONE 7 (8): e44085. doi: 10.1371 /journal.pone.0044085

editor: Gabriele Saretzki, da Universidade de Newcastle, Reino Unido

Recebido: 14 Janeiro, 2012; Aceito: 31 de julho de 2012; Publicação: 29 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Ujvari et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pelo Fundo Guiler Eric (Save the Tasmanian Devil Recurso): https://www.tassiedevil.com.au/tasdevil.nsf/Grants- -scholarships/F3F98304778C800ECA2576CB007D1E6B, eo Conselho de Pesquisa australiano: https://www.arc.gov.au/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

maior marsupial carnívoro do mundo, o diabo da Tasmânia (

Sarcophilus harrisii

) tornou-se recentemente ameaçada de extinção devido a um cancro transmissível única, tumor facial do diabo-da-tasmânia (DFTD) [1], [ ,,,0],2], [3]. Antes do surgimento da doença, demônios eram comuns em toda a Tasmânia. No entanto, desde o primeiro avistamento de DFTD em 1996, a doença se espalhou por todo o estado ilha, resultando em declínios populacionais de até 90 [3]%. A doença ocorre agora em mais de 80% da área geográfica do diabo, eo rápido declínio da população levou ao demônio da Tasmânia sendo listada como ameaçada pelo internacional (União Internacional para a Conservação da Natureza [4]), bem como as autoridades nacionais e estaduais [ ,,,0],5].

DFTD são transmitidos entre indivíduos por morder durante as interações sociais [6] e manifesta-se em tumores malignos brutas ao redor da cavidade oral, com metástases frequentes para outros órgãos [7], [8]. Devido à fome, infecções secundárias e falência de órgãos, demônios geralmente sucumbem à doença no prazo de 6 meses de surgimento de tumores [1], [7]. análises citogenéticas revelaram que DFID é causada por uma linha celular clonal ladino [9], que é provavelmente derivada a partir de células da linhagem da crista neural (células de Schwann) [8], [10]. Embora DFID possui um genoma altamente rearranjado, e é caracterizada pelo tumor translocações complexos e rearranjos cromossómicos específico, a linha celular é notavelmente (cromossomicamente) estável [9]. Recentemente, no entanto, quatro, estreitamente relacionados, mas estirpes DFT cariótipo distintos foram identificados, o que sugere que o tumor está a evoluir [11], [12]. Apesar das quatro cepas DFT distintas, estudos genéticos utilizando microssatélites e imunológico de genes marcadores demonstraram que diabo Tumor Facial células (DFT) são geneticamente idênticos [10], [13], [14], [15].

Desde o seu surgimento em 1996 [9] células DFT foram submetidos a divisão contínua e propagação em milhares de demônios sem esgotar a sua capacidade de replicação e comprometer a sua estabilidade genômica. Em contraste, as células somáticas humanas normais exibem uma capacidade finita para a replicação, conhecido como o “limite de Hayflick” [16]. Ou seja, depois de um determinado número de divisões, as células esgotar seu potencial replicativo, devido aos telômeros mais curtos e entrar em um estado conhecido como senescência replicativa. Em doenças hiperproliferativas, tais como a tumorigénese, quando telomere atrito atinge um nível crítico, as células entram numa fase de interrupção de crescimento designado por “crise” [17], [18], [19]. Por up-regulação ou reactivar a enzima transferase terminal dos telômeros (telomerase), as células cancerosas são capazes de emergir do estado de “crise” e manter os telômeros, que são ligeiramente mais longo do que os observados durante a “crise” [17], [20].

os telômeros são complexos de ribonucleoproteínas nas extremidades dos cromossomas eucarióticos essencial na regulação da vida útil das células [18]. Suas funções principais são a assegurar a separação correcta cromossoma durante a mitose, e para evitar a fusão dos cromossomas e paragem do ciclo celular concomitante, causada pela extremidade dos cromossomas a ser tratado como o DNA double-strand breaks [21]. Em vertebrados, incluindo demônios da Tasmânia, os telómeros consistem em número variável de repetições em tandem (nucleótidos TTAGGG) vinculadas por um complexo multiprotein especializado conhecido como shelterin [22], [23]. Telomere comprimento homeostase em células tumorais de linha germinal e é conseguido através do circuito fechado de realimentação negativa do complexo shelterin e a enzima transferase terminal do telómero [24]. A telomerase é activado em embrionárias pluripotentes, células estaminais adultas e, para prender o atrito dos telómeros progressiva através da adição de TTAGGG repete para o cordão de 3 ‘dos ​​cromossomas [24]. A maioria das linhas celulares tumorais humanas têm configurações dos telômeros estáveis, que são alcançados pela regulação negativa da telomerase pelo complexo shelterin [25]. O complexo shelterin consiste em três subunidades shelterin:

TRF1, TRF2

e

POT1

, que são interligados por três proteínas adicionais

TPP1, RAP1

e

TINF2

.

TINF2

(

TRF1

-interacting factor nuclear 2, ou também chamado

TRF1

proteína -Interacting Nuclear 2 (

TIN2

)) ocupa uma posição central no complexo de proteína, através do fornecimento de uma ponte entre os subcomponentes do shelterin (para revisão ver [26]). Demonstrou-se que a baixa expressão de

TINF2

tem um efeito desestabilizante na shelterin [27], [28]. Devido ao papel central e crítico de

TINF2

‘(

TIN2

) na estabilidade shelterin que escolhemos para medir a expressão desse gene, como um proxy da atividade shelterin.

a acumulação de shelterin ao longo da gama de repetição telomérica evite a continuação da telomerase induzida alongamento dos telómeros [23]. estudos de cancro em humanos demonstraram que a junta sobre-regulação da expressão da telomerase e os genes do complexo shelterin pode facilitar na estabilização das células cancerosas por prevenção da activação de respostas de danos no ADN, tais como apoptose [27]. Em aproximadamente 85% dos cancros humanos, a actividade de telomerase foi mostrado para facilitar a transformação maligna, mantendo potencial replicativo [29], [30]. Nos restantes 10-15% dos cancros, a prevenção da perda de telómeros é obtido na ausência de actividade da telomerase, através de um mecanismo mediado por recombinação comutação modelo conhecido como alternativa alongamento dos telómeros (ALT) [31]. Consequentemente, as células tumorais são capazes de escapar apoptose e, portanto, manter a capacidade de replicação infinita.

A linha de células DFTD tem sido continuamente dividindo e adaptação ao microambiente de cada host diferente por mais de 15 anos. Por isso, esta doença clonal transmitidos oferece uma oportunidade sem precedentes para estudar a evolução de células de câncer e progressão

in vivo

. Maior conhecimento da homeostase dos telômeros em esse tipo de câncer transmissíveis podem fornecer novos insights sobre como as células DFT alcançar e manter o seu potencial hiperproliferativo e pode ajudar-nos a compreender as origens, evolução somática e sucesso extraordinário desta linhagem clonal parasitária. Além disso, tanto

TERT

e

TINF2

têm sido sugeridos como potenciais alvos terapêuticos no câncer humano [32], [33] e aumentar a nossa compreensão do papel destes genes no Diabo Doença Tumor Facial pode abrir novos caminhos para o tratamento da doença.

no presente estudo que incidiu sobre o papel do comprimento dos telômeros, quantificado como números Telomere cópia (doravante TCN) em hiperproliferação de amostras de DFT. Como substitutos para a actividade da telomerase em amostras de tecidos tumorais foi investigada a expressão da subunidade catalítica da telomerase (

TERT

) e um dos principais componentes de shelterin,

TRF1

-intercating factor nuclear 2 (

TINF2

). Além disso, as alterações temporais na atividade da telomerase foram quantificados em cinco linhas de células DFT.

Resultados

(a) O comprimento do telômero Fragmento de Restrição analisa

fragmento de restrição Telomere (TRF) comprimento era analisadas em ambos os tumores primários e metastastatic, bem como amostras de baço de quatro demônios da Tasmânia (um total de 12 amostras). Não fomos capazes de atribuir o comprimento dos telômeros em todas as 12 amostras como a digestão de restrição produziu vários repetidas TRF-manchas em vários comprimentos (variando de 2 kpbs até 18 kpbs). (Figura 1)

nomes de exemplo retratam o momento da coleta (10 = 2010). números idênticos representam diferentes amostras de tecido colhidas a partir do mesmo animal, S retrata baço e T representa amostras de DFT. MWM meios marcadores de peso molecular. CTRL 1 indica um baixo nível de ADN de controlo de peso molecular (comprimento: 3,2 kpb), CTRL 2 indica ADN de controlo de peso molecular elevado (comprimento: 10,2 kpb). As amostras de controlo foram fornecidos no kit Telo TAGGG TL Ensaio e teve origem a partir de linhas de células imortais.

(b) Número de telômero Relativa repeat cópia

No total, 65 amostras de tecido, recolhidos a partir de 17 locais através Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, Mt William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale e Oeste Pencil Pine, Figura 2), foram incluídos na análise relativa do número de cópias dos telômeros de repetição. Baço, amostras de pulmão e tumor exibiu uma variação TCN significativa (teste de Kruskal-Wallis: T = 17,1, P = 0,0007, DF = 3); com tumores (primários ou metastáticos), mostrando o menor (média = 3,21 ± 3,28) e baço a mais alta (média = 12,52 ± 4,62), enquanto que amostras de pulmão mostrou TCN intermediário (média = 8,03 ± 2,04, Figura 3). Um teste post hoc Conover-Inman (disponível na StatsDirect) não revelou nenhuma diferença significativa em TCN entre pulmão e baço (P = 0,52), entre o pulmão e metástases (P = 0,08), entre tumores e metástases primários (P = 0,52). O mesmo teste, no entanto, revelam uma diferença significativa na TCN entre tumores do pulmão e do primário (p = 0,006), entre baço e do tumor (P = 0,0001), e entre o baço e metástases (P = 0,01).

progressão do tumor até 2003 representado com tracejado, até 2005, com a tracejado-pontilhada e em 2007 com linhas pontilhadas. Datas indicam as datas de progressão de DFID. Localização abreviaturas: Bo = Bothwell, Br = Bronte Park, Bu = Buckland, Fen = Fentonbury, For = Forestier, Fre = Freycinet, Ham = Hamilton, MTW = Mt William, Na = Narawntapu, Ra = Railton, Rav = Ravenswood, Re = Reedy Marsh, S = Sorell, STM = St. Marys, We = Weegena, Wi = Wisedale, WPP = Oeste Pencil Pine.

As barras de erro representam os desvios padrão. nomes da amostra indicam o tempo de coleta (06 = 2006, 07 = 2007, 10 = 2010). números idênticos representam diferentes amostras de tecido colhidas a partir do mesmo animal. Número de amostras utilizadas na análise: tumores primários coletados em 2006: N = 30, 2007: N = 13 e 2010: N = 8; metástase: N = 4, baço: N = 5, pulmão: N = 5.

(c) Temporal (longitudinal) geográfica e variação de tensão em TCN

A Kruskal-Wallis teste revelou uma variação significativa temporal na TCN de amostras coletadas em 2006, 2007 e 2010 (T = 7,66, P = 0,02, DF = 2) e um post-hoc e um teste de Conover-Inman revelou diferenças significativas na TCN entre os anos de 2006 e 2007 ( P = 0,03) e 2006 e 2010 (P = 0,01), mas não foi observada diferença significativa na TCN entre os anos de 2007 e 2010 (P = 0,6). O teste post hoc sugere, portanto, um aumento temporal na TCN (Figura 4).

As barras de erro representam os desvios padrão. Foram observadas diferenças significativas no número de cópias dos telômeros (TCN) entre os anos de 2006 e 2007 (P = 0,03) e em 2006 e 2010 (P = 0,01), mas não foi observada diferença significativa na TCN entre os anos de 2007 e 2010 (P = 0,6). * Indica diferenças significativas

Nós não no entanto, observar qualquer diferença significativa na TCN entre as três regiões geográficas (Oriental, Central, Norte-Oeste) (teste de Kruskal Wallis:. T = 1,75, P = 0,42, DF = 2), nem entre as quatro cepas diferentes (Kruskal Wallis:. T = 2.1, P = 0,56, DF = 3)

(d) TERT e TINF2 expressão

diabo

TERT

e

TINF2

expressão foi significativamente sobre-regulada em tumores primários em comparação com o baço por um factor médio de 14,63 P 0,0001 (. Std Error (sE) variando entre 4,5 e 37,8) , e 37,86 P 0,0001 (SE variando entre 4,6-272,9), respectivamente (Figura 5).

TERT

e

TINF2

expressão mostrou variação substancial em toda amostras de tumor. Nós não, no entanto, observar qualquer associação significativa entre a TCN e

TERT

ou

expressão TINF2

nas amostras de tumor (Spearman, R = -0,31, P = 0,36, N = 11 ; R = -0,05, P = 0,88, N = 11, respectivamente)

Número de amostras usadas na análise:. tumores n = 11 e n = 5. baço linhas horizontais a ponteado representam a expressão do gene média relativa, boxplots indicar a gama de erro padrão e as barras representam os intervalos de confiança de 95%.

nos tumores, o nível de expressão

TINF2

foi significativamente menor do que a de

TERT

(frente e verso Mann-Whitney U-teste; L = 27, P = 0,03, mediana

TINF2

= 0,51, mediana

TERT

= 3,58). Apesar da diferença de nível de expressão foi observada uma associação significativa entre o

TERT

e

TINF2

(Spearman r = 0,83, P = 0,0017, N = 11). Nós também detectou uma variação temporal significativa no

TERT

e

TINF2

níveis de expressão tanto como

TERT

e

TINF2

mostraram significativamente maiores níveis de expressão em 2010, em comparação a 2007 (frente e verso Mann-Whitney U-teste, L = 28, P = 0,0173 e U = 28,5, P = 0,013, respectivamente;

TERT

média 4,77 e 2,44, respectivamente;

TINF2

mediana 2,84 e 0,47, respectivamente, Figura 6).

As barras abertas representam expressão TERT, barras pretas representam a expressão TINF2. Número de amostras utilizadas na análise: tumores recolhidos em 2007: N = 5 e 2010: N = 6. * retrata diferenças significativas (P = 0,0173 e P = 0,013, respectivamente)

(e. ) a atividade da telomerase ensaio

a atividade da telomerase foi detectada em cinco das amostras de linhas celulares DFT. Além disso, uma mudança temporais positiva foi observada em atividade da telomerase (produto total gerado) 2003-2011 (Spearman, R = -0.9, P = 0,037, N = 5, Figura 7).

Os cinco linhas de células provenientes de amostras de tumores recolhidos em 2003, 2006, 2007, 2010 e 2011. As barras representam erros padrão entre repetições técnicas (N = 3).

Discussão

Como muitos humana cancros [34], [35], diabo tumores faciais têm telômeros curtos.

expressão TERT

gene é regulado para cima 15 vezes em células DFT em comparação com células de baço, e a actividade da telomerase está presente em linhas celulares de DFT. Esta atividade telomerase impede que as células DFT de entrar em senescência replicativa, e em conjunto com a falta de DNA telomérico extrachromosomal (pers Pearse. Com) no cariótipo DFT, aponta para telomerase-regulação, não alongamento alternativo dos telômeros (ALT), como o principal mecanismo para a imortalidade DFT [31].

expressão alta de

TINF2

, um regulador negativo da actividade da telomerase [23], em células DFT sugere que telômero alongamento é altamente regulada na esse tipo de câncer. células DFT parecem controlar e regular o comprimento dos telômeros individuais ou seja, mais curto telomeres são alongadas pela atividade da telomerase; telômeros mais longos são protegidos de alongamento adicional pelo complexo shelterin [27].

O aumento da

TERT

e

TINF2

expressão mais provável explicar a falta de variação espacial na DFT TCN. Além disso, TCN não difere entre as linhagens DFID. No entanto, o aumento temporal

TERT

e

TINF2

a expressão do gene e a actividade da enzima pode ser ligada com a vantagem de crescimento e aumento da progressão do tumor em DFT, como é em cancros humanos [34], [ ,,,0],36], [37].

Os telômeros curtos e up-regulação da telomerase provavelmente contrapor-se mutuamente. Os telômeros curtos levar ao aumento da instabilidade genética, mas a ativação da telomerase facilita o crescimento do tumor inibindo novas instabilidades cromossômicas ou contornando checkpoints que reconhecem os telómeros disfuncionais [37]. Mais telômero comprimentos podem garantir o sucesso e sobrevivência das células DFT, estabilizando rearranjos cromossômicos e prevenir novas instabilidades genômicas.

Amostras

DFT exibiu consistentemente mais baixos TCN em comparação com outros tecidos, mas um considerável (16 vezes) entre-sample foi observada variação do TCN. desafios metodológicos, provavelmente causado pela interrupção de repetições teloméricas com sítios de restrição (uma característica comum dos cromossomas marsupiais) [38], nos impediu de correlacionar a variação no número de cópias a variação no comprimento dos telômeros.

TERT

e

TINF2

níveis de RNA não associamos com TCN, achado também observado em outras linhas de células humanas de câncer [39].

A pesquisa futura deve investigar o impacto da variação do comprimento dos telómeros na aptidão tumor. Existe uma óptima evolutiva em torno comprimento dos telômeros? Não forças seletivas manter telomere comprimento de equilíbrio ou selecione para células tumorais com telômeros mais longos? Será aumentada a

TERT

,

TINF2

expressão do gene, a atividade da telomerase e telômeros mais longos levar ao desenvolvimento de uma forma de DFT mais estável com maior potencial de crescimento e proliferativa?

Desde a sua primeira aparição há 15 anos, DFTD foi passada através de milhares de demônios, matando cerca de 80% dos animais, sem sofrer senescência replicativa. DFTD representa, portanto, um dos mais antigos que vivem naturalmente, e linhas celulares continuamente passadas em natureza. Mostrámos que a interacção dinâmica entre o complexo da telomerase e shelterin é essencial para o sucesso deste parasita cancro, transmissível. Selecção promoveu a progressão de células DFT com o aumento do número de cópia telómeros, bem como o aumento da expressão de genes e a actividade de telomerase, ambos os quais podem por fim, conduzem a um tumor de crescimento mais rápido. DFTD fornece um sistema poderoso modelo para entender tumorigénese não só em vida selvagem, mas também em cancros humanos. Mais estudos com foco na compreensão do mecanismo exato de manutenção dos telômeros e regulação em células DFT levará a uma melhor compreensão das estratégias e mecanismos evolutivos subjacentes e manutenção do potencial proliferativo ilimitado de células cancerosas.

Materiais e Métodos

(a) amostras

As amostras de tecidos foram coletadas de 17 locais em todo Tasmânia (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, MT William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale e Oeste Pencil Pine, Figura 1) pelos membros do Departamento de Indústrias primárias, parques, água e Meio Ambiente (DPIPWE) a partir DFTD euthanised afetados demônios e armazenados nos Laboratórios de Saúde animal (DPIPWE) . A pesquisa foi realizada com a aprovação do DPIPWE (Departamento de Indústrias Primárias, parques, Água e Meio Ambiente, Tasmânia) animais ética comitte, animal Ética No: 101 2010/11. Obtivemos amostras de tecidos de 48 demônios. Tivemos acesso ao baço e do tumor primário, bem como amostras de metástase a partir de quatro demônios. 51 tumores primários, cinco metástases, quatro pulmão e cinco amostras de DNA do baço foram utilizados nas análises (Figura 2).

A fim de investigar a variação geográfica /espacial do número de cópias dos telômeros, as amostras foram divididas em três geográfica regiões (Médio = distribuição antes de 2003, Central = distribuição entre 2003-2005 e North-West = distribuição entre 2005-2007) com base na evolução temporal /espacial das DFTD através Tasmânia [40]. Tivemos informações sobre as cepas específicas de 45 amostras de tumores e usado essas amostras para investigar a variação do número de cópias dos telômeros entre as linhagens DFT.

A variação temporal nas taxas de desgaste dos telômeros foi baseado em números de cópias observadas em amostras coletadas em 2006, 2007 , e 2010 (N = 51). Devido aos procedimentos de recolha de amostras só foram capazes de extrair RNA de cinco baço e 11 (5 a partir de 2007 e 6 de 2010) amostras de tumores primários que foram posteriormente analisadas com o Quantitative PCR em Tempo Real.

A atividade da telomerase Os ensaios foram realizados em cinco amostras de linhas celulares obtidas a partir de lisados ​​de DFT DPIPWE. As linhas celulares tumorais foram geradas e mantidas na DPIPWE de acordo com as descrições de Pearse et ai 2012 [11]. As cinco linhas de células provenientes de amostras de tumores recolhidos em 2003, 2006, 2007, 2010 e 2011.

(b) extração de DNA, medições dos telômeros de tamanho de fragmentos e cópia dos telômeros número quantificação

O DNA genômico foi isolado a partir de amostras de tecido por extracção com fenol-clorofórmio. quantidade de ADN da amostra e qualidade foi medida usando um NanoDrop espectrofotômetro (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

(c) Telomere Fragmento de Restrição analisa

fragmento de restrição Telomere comprimento (TRFL) (TRF) foi quantificado por hibridação Southern blot, seguindo o protocolo delineado no Telo TAGGG TL Assay Kit (Roche, Indianapolis, IN), utilizando electroforese em campo constante. Após digestão do ADN genómico com uma mistura de

Hinf I e

Rsa I

restrição de enzimas para remover o ADN de sequência-diversificada do lado centromérica dos telómeros, o comprimento dos telómeros foi analisado em géis de agarose, as quais foram executados durante 4 horas a 5 V /cm. Os fragmentos TRF foram marcadas com uma sonda marcada digoxigen, e as imagens foram posteriormente TRF desenvolvida em filme de quimioluminescência de alto desempenho (Amersham Bioscience, Waukesha, WI).

(d) PCR quantitativa do número de cópias dos telómeros relativa

número de repetição dos telómeros cópia Relativa foi analisada por PCR quantitativa (Q-PCR), como descrito por Cawthon [41]. primers específicos dos telômeros foram adotadas a partir Cawthon [41], Tel1: 5’GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT -3 ‘; Tel2, 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA -3 ‘.

RPLP0

(também chamado

36B4

) gene foi escolhido como gene de cópia única seguindo a metodologia do Cawthon [41], ea presença única cópia deste gene no genoma Tasmanian Devil [42] foi confirmada por pesquisar o genoma de cópias alternativas do gene. Sem alternativa

RPLP0

cópias ou pseudogenes foram encontrados.

RPLP0

primers específicos de genes foram desenhados com base na sequência do genoma Tasmanian Devil [42], usando o site da Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi),

RPLP0_F

: 5’CTTCCCGTTCACCAAAGAAG -3 ‘e

RPLP0_R

: 5’TGTTCTGGACTGGCAAAGTG -3′. As reacções de Q-PCR foram realizadas na RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) em 15 ul de volume total, contendo 7.5 ul de Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR master mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 uM iniciadores directos e inversos (a As concentrações de primers ideais) e 1 ml de gDNA (1 ng /mL de concentração). condições de Q-PCR foram estabelecidas de acordo com o protocolo do fabricante: 95 ° C durante 5 min de desnaturação seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 30 s (temperatura de hibridação). sinal de fluorescência foi adquirida à temperatura de recozimento. As curvas padrão foram geradas usando série 01:05 (

RPLP0

) e 1:10 (Telomere) diluições de uma amostra composta contendo partes iguais de DNA a partir de extratos de baço e tecido tumoral. Todas as diluições foram realizadas em triplicado. curvas padrão teve um R

2 0,985 (

RPLP0

reacção: R

2 = 0,985 e Telomere reacção R

2 = 0,997) e continha pelo menos quatro (reação Telomere) ou cinco (

RPLP0

reacção) diluições da série de diluição com uma gama dinâmica linear de, pelo menos, 3 ordens de grandeza e tinham eficiências de PCR entre 1.3 e 1.1 (respectivamente). Todas as amostras foram analisadas em quadruplicado, e todos os valores Cq para incógnitas caiu dentro do intervalo quantificável linear das curvas padrão apropriadas. O programa de descanso [43] foi usada para calcular a variação da dobra normalizado do gene alvo em relação ao gene de referência. Este pacote de programas também corrige os diferentes eficiências de reacção. A significância estatística (P 0,05).. foi determinada por uma realocação randomização Teste © Pair sábio fixo, como descrito por Pfaffl

et al

[43]

(e) extração de RNA e quantificar a expressão da telomerase quantitativa por RT-PCR de ARN

foi extraído de amostras de tecido, utilizando uma combinação de Trizol (Sigma, St. Louis, MO) e Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Germantown, MD). qualidade e quantidade de ARN foram quantificados num Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, CA). O ADN genómico foi removido a partir das amostras de ARN por o kit de ADNase I AMPD1 (Sigma, St. Louis, MO) e o cDNA foi sintetizado com o Kit de Transcrição Reversa QuantiTect (Qiagen, Germantown, MD). primers específicos do gene da telomerase, abrangendo limites de exão foram projetados na subunidade catalítica de proteína diabo

TERT

gene, usando o site da Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)

TERT

-F: 5’TGCTGTAGTCCAGAAGAATGC -3 ‘, e

TERT

-R: 5’TGCAGGGAAGAGGTTTCTTG -3′.

TRF1

-interacting factor nuclear 2 (

TINF2

) iniciadores foram concebidos através de exons 6 e 7

TINF2

-F: 5’TTGCCCTGACTCAGTATTGC -3 ‘, e

TINF2

-R: 5’GGATCCTGGAAAACTTGCTC -3 ‘. Dois genes,

GAPDH

(

qGAPDH

) e

GUSB

(

qGUSB

) foram utilizados como genes normalizador seguindo a descrição de Murchison et al. [ ,,,0],10], [14]:

qGAPDHf

: 5’GACTCAACCACGTATTCGGCTC -3’and

qGAPDHr

: 5’ATATGATTCCACCCATGGCAAGTTCAA -3 ‘;

qGUSBf

: 5’CTGCTGCCTATTATTTCAAGAC -3’and

qGUSBr

: 5′-CAAGATCCAATTCAGGCTTAG -3 ‘. As reacções de Q-PCR foram realizadas na RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) em 15 ul de volume total, contendo 7.5 ul de Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR master mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 uM iniciadores directos e inversos (a As concentrações óptimas de iniciadores) e 1 ul de ADNc (5 ng /mL de concentração). transcriptase reversa amostras negativas negativas e de cDNA foram executados juntamente com as amostras de cDNA como controles para detectar a contaminação do DNA genômico e formações de dimeros de iniciadores. condições de Q-PCR foram estabelecidas de acordo com o protocolo do fabricante: 95 ° C durante 5 min de desnaturação seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 30 s (temperatura de recozimento, a AT). sinal de fluorescência foi adquirido no AT. Para avaliar a amplificação específica de uma análise de curvas de fusão final (a partir de até 99 ° C) foi adicionada sob as medições de fluorescência contínuas. As curvas padrão foram geradas utilizando diluições seriadas 1:5 de uma amostra composta contendo partes iguais de amostras de ADNc gerados a partir de extractos de ARN de baço e tecido tumoral. Todas as diluições foram realizadas em triplicado. curvas padrão teve um R

2 0,99 (

GUSB

reacção: R

2 = 0,998,

TERT

reacção: R

2 = 0.990 e

TINF2

reacção: R

2 = 0,993) e continha pelo menos quatro (

TERT

reação) ou cinco (

GUSB Comprar e

TINF2

reações) diluições de a série de diluição com uma faixa dinâmica linear de pelo menos 3 ordens de magnitude e teve eficiências da PCR entre 0,98 e 1,4 (

GUSB

: 1.1,

TERT

: 1,4 e

TINF2

: 0,98). Todas as amostras foram analisadas em quadruplicado, e todos os valores Cq para incógnitas caiu dentro do intervalo quantificável linear das curvas padrão apropriadas. O programa de descanso [43] foi usada para calcular a variação da dobra normalizado do gene alvo em relação ao gene de referência. Este pacote de programas também corrige para as diferentes eficiências de reacção. A significância estatística (P 0,05) foi determinada por uma realocação randomização Teste © Pair sábio fixo, como descrito por Pfaffl

et al

[43]

(f) ensaio de telomerase

a telomerase foi medida utilizando o kit de detecção da telomerase TRAPÉZIO-RT (Millipore, Bedford, MA). As células foram lisadas em 200 ul de tampão CHAPS, e teor de proteína foi quantificada utilizando o kit de Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL). Alíquotas de lisado de células (250 ng de proteína /poço) foram testadas em triplicado. Normas, amostras inactivadas, e as reacções não-molde também foram incluídos no ensaio como controlos de qualidade. amplificações em tempo real foram realizadas com um sistema de detecção por PCR RotorGene6000 multicolor em tempo real (Qiagen, Germantown, MD). curva padrão foi gerado a partir do modelo de controlo TSR8 seguindo as instruções do fabricante.