Uma divisão celular assimétrica produz duas células filhas com diferentes destinos celulares. Este processo é muito importante para a formação e desenvolvimento de cancro e tem um potencial terapêutico significativo. Aqui nós identificar proteínas de longa duração em células que se dividem durante o envelhecimento utilizando a levedura de germinação, Saccharomyces cerevisiae. células-mãe levedura submeter a um número limitado de divisões assimétricas que definem tempo de vida replicativo.

Em primeiro lugar? nós construímos um sistema para identificar as proteínas de longa duração. Usamos de isótopos estáveis ​​pulse-chase e espectrometria de massa total de proteoma para identificar proteínas que eram ambos de longa duração e retidos no envelhecimento células mãe depois? 18 divisões celulares. Foram identificados? 135 proteínas que designamos como longa vida proteínas assimetricamente retidos (LARPs).

Em seguida, tomamos um outro sistema para testar e verificar as proteínas de longa duração. Marcação de uma proteína de interesse com o sistema RITE cria uma proteína de fusão, que expressa a proteína inicialmente-GFP, em seguida, através de um evento de recombinação de estradiol-induzível, expressa a proteína-RFP. A proteína original for rotulado verde, e proteínas subsequentes são rotulados vermelho.

Finalmente, a acumulação de alguns LARPs com divisões celulares sucessivas pode resultar em um aumento eficaz da dose de proteína em células mais velhas. membranas plasmáticas LARPs podem ser ambos modificados e aumento nos níveis com célula sucessiva divisão

proteínas de longa duração contribuir para fenótipos associados à idade e provavelmente existem em outros organismos.

A ligase PARKIN E3 UB é mutado na doença de Parkinson (PD) e controla autofagia mitocondrial. Parkin funções através de um chamado mecanismo híbrido RING-HECT em que um resíduo de Cys catalítica no domínio Ring2 recebe UB de um E2 e transfere-a para substrato. Aqui usamos proteômica quantitativos e live-célula de imagem para dissecar etapas individuais no ligase via controle mitocondrial PINK1 quinase-PARKIN UB anormal na doença de Parkinson.

activação PARKIN por PINK1 produz cadeias UB na mitocôndria, e PARKIN-dependentes montagem da cadeia é necessária para a acumulação de poli-fosfo-UB sobre mitocôndrias. Um conjunto de dez plex massa marcação experimento proteômica quantitativa revelou um aumento de 3 vezes na p-S65 UB 30 min após a despolarização em PINK1 + /+ rato embrionárias? Fibroblastos (MEFs).

PINK1 promove associação PARKIN com cadeias de poli-UB por fosforilação tanto PARKIN e poli-UB.

UB pode ser submetida a prolongamento da cadeia em sete lisinas e a metionina N-terminal, com diferentes destinos para os diferentes tipos de ligação. PARKIN promove a síntese de cadeias de poli-UB canônicos e não canônicos na mitocôndria despolarizadas de uma maneira que depende da sua resíduo Cys catalítico e S65 dentro do seu domínio UBL.

Para resumo, nós tomamos o poder de proteômica para etapas de análise individuais em complexas cascatas UB-driven fosforilação. Será útil para as vias entendimento sinalizando-ubiquitinação no futuro.