Abstract
MYC sobre-expressão, conforme determinado por meio moleculares tem sido relatada como um biomarcador prognóstico favorável no carcinoma colorectal (CRC). No entanto análise de expressão MYC não está disponível na prática clínica de rotina. Investigou-se imuno-histoquímica (IHC) para a proteína myc utilizando um novo anticorpo monoclonal comercialmente disponível coelho [Y69 clone] que está actualmente em uso clínico generalizado para o diagnóstico do linfoma poderia ser utilizada para prever o resultado de CRC ressecado. Myc IHC foi realizada em um tissue microarray (TMA), que compreende uma coorte retrospectiva de 1421 pacientes com CCR e marcou cego como a todos os dados clínicos e patológicos. IHC também foi realizada em um subcoorte dos CRCs seção inteira para avaliar características de coloração e de concordância com a expressão TMA. MYC sobre-expressão foi encontrado em 980 (69%) dos CRCs e foi associada com o estágio do tumor e reparo de DNA incompatibilidade /status BRAF. Houve um acordo substancial entre TMA e seção inteira myc IHC (kappa = 0,742, p 0,01). CRCs com MYC sobre-expressão demonstraram melhora da sobrevida em 5 anos (93,2% vs. 57,3%), com o efeito significativamente modulada pelo efeito dominante do estágio do tumor, a idade no momento do diagnóstico e estado espaço invasão linfática na sobrevivência. Conclui-se que o status myc, conforme determinado pelo IHC por si só pode ser usada para prever a sobrevida global em pacientes com CRC submetidos a ressecção cirúrgica
Citation:. Toon CW, Chou A, Clarkson A, DeSilva K, Houang M, Chan JCY , et ai. (2014) Imuno-histoquímica para Myc prediz sobrevida no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (2): e87456. doi: 10.1371 /journal.pone.0087456
editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de outubro de 2013; Aceito: 27 de dezembro de 2013; Publicação: 04 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Toon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Patologia do Norte Staff Fundo Fiduciário Specialist. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações. Christopher W. Toon é empregado por Histopath Patologia. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para autores
Introdução
A desregulação da MYC (HGNC: 7553). é uma consequência precoce de mutações ativadoras na APC (HGNC: 583), uma mutação condutor chave na via adenoma-carcinoma in câncer colorretal (CRC). Mediada pela beta-catenina através da via Wnt canónica, a sobre-expressão aberrante de myc e de ciclina D1 resulta na proliferação celular descontrolada, que confere uma vantagem de crescimento às células cancerosas [1], [2]. O papel do MYC sobre-expressão na condução CRC tumorigênese foi confirmada pelo perfil de expressão gênica estudos [3], e, mais recentemente, por meio de análise de todo o genoma CRC como parte da iniciativa Cancer Genome Atlas Rede [4].
Curiosamente MYC sobre-expressão como determinado pela análise de transferência de Northern foi relatado como um biomarcador de bom resultado no cancro colorectal, já em 1996. [5] Actualmente seu uso como biomarcador de prognóstico é difícil de justificar por causa da disponibilidade limitada e despesa envolvido do teste molecular. Portanto testes para MYC sobre-expressão na CRC não está actualmente disponível, viável ou garantido no cenário clínico de rotina.
Recentemente, um novo anticorpo altamente sensível e específico monoclonal de coelho dirigido contra a proteína myc (Y69 clone) tornou-se disponível. Este anticorpo foi validado no cenário clínico de rotina em formalina parafina e fixado tecido embebido, onde myc immunohistochemsitry em combinação com imuno-histoquímica BCL2, foi usado para identificar o subgrupo pobre prognóstico de linfoma não-Hodgkin conhecido como “linfoma duplo golpe”. [6], [7] Na verdade MYC e expressão BCL2, conforme determinado pelo immunohistochemsitry em formalina tecido embebido em parafina fixado rapidamente se tornou parte da avaliação de diagnóstico de rotina de pacientes com linfoma de células B de alto grau. [8].
Procuramos rever o uso da expressão MYC como biomarcador no CRC, correlacionando resultado com a expressão MYC determinada pelo anticorpo monoclonal de coelho amplamente disponível.
Materiais e Métodos
A nossa coorte CRC foi descrito anteriormente. [9] Em resumo, casos CRC retrospectivos foram recrutados através de pesquisa na base de dados de patologia do Departamento de Anatomia Patológica, Royal North Shore Hospital, de Sydney para os pacientes que tiveram operações definitivas para CRC entre 2004 e 2009. Durante este período, este centro realizou testes patológica centralizado para dois hospitais de referência quaternário com unidades de cirurgia colorretal dedicados e 4 hospitais comunitários. Portanto, este grupo de pacientes representa um verdadeiro instantâneo de casos CRC encontrados na comunidade australiana como um todo.
Os critérios de exclusão foram os tumores de localização extra-cólon e do apêndice, os tumores tratados exclusivamente endoluminalmente e tipos histológicos diferentes do adenocarcinoma definido pela o sistema da OMS 2010. [10].
Os tumores foram revisados independentemente por três patologistas (CT, KDS e AG) para confirmar o diagnóstico e restage os tumores de acordo com 7
th edição de 2009 AJCC /TNM. [11] Para ressecções envolvendo tumores síncronos, o tumor com o mais elevado estágio patológico foi selecionada e anotada. Tissue microarrays (TMA) contendo núcleos duplicado de 1 mm, em seguida, foram construídos a partir de blocos de tecido de tumor disponível
A imuno-histoquímica foi realizada sobre a TMA com um anticorpo disponível comercialmente de coelho anti-myc (Y69 clone, gato:. ab32072, Abcam, Burlingame CA EUA), utilizando o Autostainer Leica BondIII (Leica Microsystems, Mount Waverley, Victoria, Austrália) de acordo com o protocolo do fabricante. As lâminas foram desparafinados em solução de Bond dewax (AR9222, Leica Microsystems) e hidratados em solução de Bond Wash (AR9590, Leica Microsystems). recuperação de epítopo de calor induzido foi realizada por 60 minutos em solução alcalina de recuperação do fabricante ER2 (VBS parte não: AR9640, Leica Microsystems). As lâminas foram então incubadas com o anticorpo primário a uma diluição de 1 em 100, durante 30 minutos à temperatura ambiente. A detecção de anticorpos foi realizada utilizando o Sistema de Polímero Ligação livre de detecção definida biotina (DS9713 Leica Microsystems), de acordo com o protocolo do fabricante. As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina.
MYC sobre-expressão foi avaliada por IHC myc, registados com um sistema visual de dois níveis por um patologista cirúrgico praticando (CT) cego a todas as informações clínicas, patológicas e resultado. A coloração nuclear de qualquer intensidade maior do que 10% de células neoplásicas foi classificado como positivo (sobre-expressos). Todos os outros padrões de coloração foram marcados como negativos. Um controle externo (a MYC linfoma amplificado) foi executado com cada série de slides.
reparo incompatível DNA (MMR) eo estado BRAF IHC foram determinados por imuno-histoquímica, como descrito anteriormente [9], [12].
a fim de examinar a precisão de interpretação TMA IHC, Myc IHC foi realizada em secções inteiras de CRCs em um subcoorte de 98 CRCs consecutivos a partir de 2004, interpretada pelo mesmo avaliador em TMA (CT) cegos para toda clínicas, patológicas e dados do TMA.
Correlação entre MYC sobre-expressão e CRC variáveis clínico-patológicas de pacientes foram examinados em 2 × 2 mesas contingengy para variáveis categóricas ou usando o teste de Mann-Whitney para a idade (Tabela 1). Variáveis que mostraram uma significância de p 0,10 foram incluídas em um modelo de regressão logística binária para examinar ainda mais a relação entre MYC sobre-expressão e reparação incompatibilidade DNA (MMR) /BRAF estatuto IHC fenótipo (Tabela 2)
.
o acompanhamento foi obtido pelo exame de prontuários hospitalares, os de salas privadas dos cirurgiões e avisos de morte pública de arquivamento e obituários no estado de New South Wales, Austrália. A sobrevivência global foi definido como a duração do tempo vivo da cirurgia definitiva. Os pacientes foram acompanhados até a morte ou a última data de follow-up não mais de 7 anos após a cirurgia definitiva. Análise
Kaplan Meier foi utilizado para relatar 5 anos sobreviventes gerais para CRCs com e sem MYC sobre-expressão , com a diferença avaliada pela Log Rank Test. regressão de Cox multivariada foi utilizada para explorar a associação entre o efeito ajustado de MYC sobre-expressão na sobrevida global, em um modelo integral que incluiu idade ao diagnóstico, sexo, localização anatômica do tumor, estágio do tumor, a deficiência de reparo incompatível combinados e status de BRAF IHC, o tamanho do tumor, grau histológico, presença ou ausência de invasão do espaço linfovascular e status de resposta de linfócitos peritumoral
a p . 0,05 foi tomado como significativo, exceto na modelagem inicial por meio de regressão logística binária (mencionados acima). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o IBM SPSS Statistics v21 no OSX.
Resultados
Um total de 1421 CRCs foram avaliados em TMA. As características clínicas e patológicas estão resumidos na Tabela 1. Em resumo, houve distribuição aproximadamente igual de gênero, com uma idade média de diagnóstico aos 74 anos (variação de 17-100 anos). A sobrevida global em 5 anos para a coorte foi de 66,3%, com uma média de 52,9% (IC 95% = 5,14-5,44).
Myc IHC mostraram imuno-localização nuclear consistente, e não havia uma distinção visível entre os casos que foram negativos (marcados como negativos para a sobre-expressão), e aqueles que mostraram a fraca coloração forte em 10% ou mais das células neoplásicas (classificado como positivo para a sobre-expressão). Exemplos de características myc coloração IHC são apresentados na Figura 1. A prevalência de MYC sobre-expressão no CRC foi de 69%.
As características clínicas e patológicas de myc negativo IHC (n = 441, 31,0% ) e myc IHC positivo (mYC sobre-expressos, n = 980, 69,0%) CRCs estão resumidos na Tabela 1. mYC sobre-expressão foi significativamente associada com o estágio do tumor e MMR /BRAF IHC fenótipo, mas não sexo, localização anatômica, histológica grau, presença ou ausência de invasão do espaço linfovascular, nem status de reacção de linfócitos peritumoral. A relação entre MYC sobre-expressão e idade no momento do diagnóstico tende a significância (p = 0,07).
A Tabela 2 mostra o efeito ajustado de de MMR /BRAF IHC fenótipo sobre o estado de IHC myc. MYC sobre-expressão foi fortemente associada com o fenótipo MMRD /BRAF V600E IHC [odds ratio = 2,17 (IC 95% = 1,45-3,24), p 0,01].
A sobrevida em 5 anos para CRCs com MYC mais -expression foi 93,2% (total de 50
th sobrevivência centile 3,06 anos, intervalo interquartil 0,56-5,22), em comparação com myc CRC negativa de 57,3% (total de 50
th sobrevivência centile 2,32 anos, intervalo interquartil 0,31-4,26) .
O efeito do status de myc na sobrevida global CRC é apresentado na Figura 1. CRCs com mYC sobre-expressão mostrou significativamente melhor sobrevida em comparação com myc casos negativos (Log rank test p 0,01), com um efeito bruto proporção (univariável modelo) de perigo de 0,67 [(IC 95% = 0,54-0,83), p 0,01]. Este efeito bruto sobre a sobrevida global permaneceu significativa mesmo quando estratificada por MMR /BRAF IHC fenótipo [taxa de risco = 0,68 (96% CI = 0,54-0,84), p 0,01].
No modelo multivariável cheia, o efeito ajustado de MYC sobre-expressão na sobrevida global tornou-se insignificante [taxa de risco = 0,91 (IC 95% = 0,69-1,20), p = 0,52], devido ao efeito dominante da idade no momento do diagnóstico, o estágio do tumor eo estado espaço invasão linfática ea MMR deficiente /BRAF V600E mutante IHC fenótipo sobre a sobrevivência (Tabela 3). Tabela 4 exibe o modelo completo, incluindo interação entre myc IHC e estado MMR /BRAF
Houve um acordo substancial entre TMA e seção inteira pontuação IHC myc. (Kappa = 0,742, p 0,01) . Todos os casos positivos de TMA foram positivos em partes inteiras. Houve 11 casos discordantes (negativos no TMA, positivos na seção inteira), todos devido a coloração desigual. regressão univariável Cox também foi realizado em seções inteiras, confirmando a sobrevida global melhorou de CRCs mostrando MYC sobre-expressão (Figura 2)
Painel A:. curvas de Kaplan-Meier mostrando sobrevivência global superior de CRCs com MYC sobre-expressão em comparação com myc CRCs negativos (Log rank teste p 0,01); Painel B:. Análise de regressão univariada Cox mostrando MYC sobre-expressão significativamente correlacionada com a sobrevivência melhorada geral [taxa de risco = (IC 95% = 0,15-0,60) 0,30, p 0,01]
Discussão
estudos anteriores sobre a expressão MYC em CRC têm sido inconsistentes e conflitantes, presumivelmente, devido ao uso de pequenos grupos (N variando de 38 a 310) e a utilização de uma variedade de métodos de detecção incluindo IHC, fluorescente hibridação in situ ( FISH), análise baseada em RNA e DNA número de cópias. [5], [13] – [17]. Estudos anteriores utilizando IHC ter sido limitada pelo uso de anticorpos que demonstraram aberrante (citoplasmático) de imuno-localização, presumivelmente devido à fraca especificidade. [18].
O desenvolvimento e validação de um anticorpo monoclonal de coelho altamente específico para myc tem feito um grande impacto no diagnóstico de linfoma, onde a combinação de MYC e superexpressão BCL2, conforme determinado por imuno-histoquímica sozinho tem sido usado para definir um grupo de mau prognóstico de linfoma Hodgkin não-células B conhecidos como linfomas duplo golpe. [6], [7] Curiosamente, nestes estudos linfoma onde myc IHC e avaliação FISH resultaram em resultados conflitantes, MYC expressão como determinado por IHC tem sido um melhor preditor de resultado do que a FISH padrão ouro anterior. Presumivelmente isto é porque MYC sobre-expressão pode ser devido a uma variedade de processos celulares, em vez de apenas amplificação simples.
Neste contexto, o nosso estudo, que se baseia em um grupo muito grande e não seleccionado em coortes 1421 CRC utilizando esta nova geração de anticorpo monoclonal de coelho específico, demonstra a alta prevalência de mYC sobre-expressão em CRCs, e mais importante, o papel potencial de myc como um poderoso biomarcador prognóstico em CRCs. O fato de que MYC sobre-expressão é significativamente associada com uma melhor sobrevida global na análise univariável é talvez surpreendente, dado o entendimento atual do potencial tumorigénico de MYC desregulação [1] – [4]. Apenas um estudo anterior mostrou este efeito no CRC [5]. Enquanto não há dados suficientes para postular sobre o mecanismo subjacente, a correlação entre o potencial tumorigénico (oncogênese) e sobrevivência, pelo menos para MYC, é ser mais complexa do que se pensava inicialmente.
Neste estudo nós temos escolhido para examinar a sobre-expressão MYC no contexto de CRCs agrupados de acordo com o seu estado MMR e BRAF, em vez de estado MMR e BRAF individualmente. está agora bem estabelecido que a MMR e BRAF interagem de formas complexas em relação ao seu efeito sobre a sobrevivência. Por exemplo, na MMR CRCs proficientes, a presença da mutação BRAF V600E confere um pior sobrevivência, enquanto que na MMR CRCs deficientes, BRAF V600E é um marcador do fenótipo methylator, um grupo de CRCs que mostram excelente prognóstico [12], [19].
Curiosamente, embora MYC sobre-expressão foi fortemente associada com o fenótipo /BRAFV66E MMRD, a falta de interação no modelo multivariável completa mostra que o efeito do MYC na sobrevivência não pode ser explicado inteiramente justo pela sua associação com o estado MMR /BRAF . Isto sugere que o efeito preditivo da MYC sobre-expressão na sobrevivência é mediada em parte, por mecanismos independentes do estado MMR /BRAF.
Uma das principais desvantagens do nosso estudo é o excesso de simplificação, que MYC mais -expression é determinada. A natureza semi-quantitativa de IHC é tal que as mudanças na intensidade IHC precisa ser significativa (em escala logarítmica, de outro modo conhecida como a lei de Weber-Fechner), de modo que o olho humano ser capaz de apreciar uma mudança. Este método de IHC de pontuação tem, no entanto prestar-se a análise de correlação mais simples tais como regressão logística binária, e é a metodologia predominante pelo qual mais IHC é marcado na definição clínica de diagnóstico. Significativamente, apesar desta desvantagem, fomos capazes de demonstrar as diferenças de sobrevida global significativos na análise univariável do estado IHC myc.
Outra desvantagem significativa é a falta de resultados específicos de doenças e mortalidade específica por câncer em nossa coorte estudo. Futuros estudos que empregam esses pontos de extremidade irá fornecer informações importantes que podem informar significativamente na prática clínica.
Em resumo, nosso estudo mostra que o status myc, conforme determinado pela IHC usando um simples metodologia de pontuação semi-quantitativa facilmente implantado na clínica configuração pode ser usada como um preditor de prognóstico em CRC. O refinamento deste utilitário preditivo aguarda elucidação em coortes com resultados específicos da doença.