Sumário

intravesical Bacilo Calmette-Guérin (BCG) tem sido mostrado induzir uma resposta imunológica específica (

ie

, a activação de células T e IL-2 efectoras), enquanto a pré-clínico estudos utilizando ALT-803 (mutante de IL-15 combinado com o análogo de fus de IL-15Ra-Fc) têm mostrado resultados promissores, prolongando meia-vida do agente e estimular as células T CD8 +. Com base nestes resultados, a hipótese de que a administração intravesical de ALT-803, juntamente com BCG irá gerar uma resposta imunológica que conduz à redução significativa da carga de tumor da bexiga. Usando um modelo bem estabelecido cancerígena rato induzido não-muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC), foram estudados os efeitos da ALT-803 intravesical com e sem BCG. tecidos de rato foram avaliados para documentar a resposta ao tratamento. Intravesical ALT-803 foi segura e bem tolerada por si só e em combinação com BCG. Como um único agente de tratamento, ALT-803 reduziu a carga tumoral em 35% em relação ao controle enquanto BCG sozinho só reduziu a carga tumoral em 15%. No entanto, a combinação de ALT-803 mais BCG reduziu a carga tumoral em 46% em comparação com o controlo. monitorização imunitária sugeriram que a resposta anti-tumoral foi ligado à produção e secreção de IL-1α, IL-1β e RANTES, o que, por sua vez, induziu a proliferação e activação de células NK. Por fim, as respostas tumorais do tratamento combinacional foram associados com redução de 76% na angiogénese, o que é significativamente maior do que quando avaliada com qualquer dos agentes isolados. O índice terapêutico melhorado visto com este Duplet fornece justificação para o desenvolvimento deste regime para futuros ensaios clínicos

Citation:. Gomes-Giacoia E, Miyake M, Goodison S, Sriharan A, Zhang G, Você L, et ai. (2014) intravesical ALT-803 e Tratamento BCG reduz a carga tumoral em uma Cancer Modelo de Rato As substâncias cancerígenas induzida bexiga; Um papel para a produção de citocinas e NK celular Expansão. PLoS ONE 9 (6): e96705. doi: 10.1371 /journal.pone.0096705

editor: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Janeiro, 2014; Aceito: 10 de abril de 2014; Publicação: 04 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gomes-Giacoia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo James e Esther king Biomedical Science Team Projeto 1KT-01 (CJ Rosser). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. A seguir autores EGG, MM, SG, AS, GZ, ASP, KXC e CJR declararam que não existem interesses conflitantes. LY, JOE, PRR e HCW são funcionários da Altor BioScience Corp. Isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de bexiga (BCA) é o quinto malignidade mais comum nos Estados Unidos, a ser diagnosticado em aproximadamente 74.690 pacientes, resultando em aproximadamente 15.580 mortes em 2014 [1]. Setenta a oitenta por cento dos doentes com BCa presente com não-muscular cancro da bexiga invasivo (NMIBC), que é o cancro confinado à mucosa da bexiga [2], [3]. NMIBC é tratado por ressecção transuretral dos tumores seguido pela administração de quimioterapia intravesical adjuvante ou Bacillus Calmette-Guérin intravesical (BCG), que podem diminuir as taxas de recorrência e prolongam o intervalo livre de progressão [2] – [4]. Apesar disso, aproximadamente 50-60% dos pacientes que se submetem a NMIBC ressecção e terapia intravesical vai experimentar uma recorrência do tumor [5]. Além disso, das pessoas que experimentam uma recorrência, aproximadamente 30% vai progredir e sucumbir à sua doença ao longo de um período de 15 anos, enquanto outro 50% serão submetidos a cistectomia radical em uma tentativa de controlar a sua doença [6]. Como tal, uma questão-chave no campo permanece a necessidade de melhores alternativas terapêuticas para reduzir as taxas de recorrência, melhorar as taxas de sobrevivência e evitar a necessidade de cirurgia radical.

O mecanismo de ação exato pelo qual intravesical BCG exerce o seu anti efeitos -tumorigenic não é conhecido. No entanto, é evidente que a actividade de BCG é dependente da indução de respostas inflamatórias que envolvem a activação de vários tipos de células imunitárias. Inicialmente, intravesical de BCG liga-se ao forro urotelial e é então internalizado e processado por células normais e malignas que provocam uma resposta pró-inflamatória complexa caracterizada por libertação de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α e GM-CSF [ ,,,0],7], [8]. Subsequentemente, uma variedade de células imunitárias, incluindo células T, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos, migram para a bexiga, onde se tornam activadas e produzir citoquinas pró-inflamatórias e quimiocinas adicionais [9], [10]. Este caracteriza-se pelo aparecimento de diferentes leucócitos e citocinas na urina de pacientes tratados com BCG. Enquanto o papel específico que vários tipos de células e citocinas desempenham no tratamento do carcinoma urotelial não é completamente, citocinas Th1 urinário claros (

por exemplo

, IFN-y, IL-2, e IL-12) têm sido associadas com a resposta BCG , ao passo que níveis elevados de citocinas Th2 (

por exemplo

, IL-10 e IL-6) correlacionam-se com insuficiência BCG [9] – [16]. Em geral, a capacidade de BCG intravesical para interagir com o urotélio e estimular largo, respostas imunes de tipo Th1 duráveis ​​é provavelmente crucial para a sua eficácia. Como resultado, tem sido sugerido que a adição de agentes imunoestimulantes, tais como as citoquinas, a terapia com BCG poderia aumentar estas respostas imunológicas e proporcionar maiores e /ou mais duráveis ​​efeitos antitumorais. No entanto, até à data, fase 3 investigações clínicas de BCG intravesical em combinação com IL-2 ou de IFN-a2B foram limitados com apenas um estudo relatou, que não demonstrou benefício sobre BCG monoterapia [17]. Assim, as estratégias ideais para maximizar a eficácia do tratamento imunoterápico intravesical de NMIBC provavelmente vai exigir novas abordagens.

IL-15 é um fator crítico no desenvolvimento, proliferação e ativação de células efetoras assassinas naturais e CD8

+ células T [18], [19] e foi listado como o agente mais promissor entre os doze drogas imunoterapia com um elevado potencial para uso no tratamento de cancros humanos [20]. Nós isolamos recentemente um novo mutante de IL-15 com um aumento de 4 vezes na actividade biológica [21]. A farmacocinética (PK), biodistribuição e a actividade biológica desta IL-15 superagonista (IL-15N72D) foram melhoradas através da interacção com o domínio solúvel do receptor de IL-15 α proteína (IL-15RαSu) para criar a IL-15N72D complexo /IL-15RαSu-Fc (referido como ALT-803). Este complexo tem pelo menos 25 vezes o

in vivo

actividade biológica da IL-15 nativa [22], [23]. Nós demonstramos recentemente que o tratamento ALT-803 sistêmica induz respostas anti-tumorais mediadas por células imunes duráveis ​​e de proteção em vários modelos de rato para neoplasias hematológicas [22], [23]. ALT-803 destaca-se como um imunoestimulante potente que é capaz de activar simultaneamente os braços inata e adaptativa do sistema imunitário para induzir ambas as respostas protectoras rápida e de longa duração contra os desafios infecciosas ou neoplásticas para o hospedeiro [24].

motivado por os dados pré-clínicos convincentes relacionadas com IL-15, testou-se a eficácia terapêutica de intravesical ALT-803 sozinho e em combinação com BCG em um carcinógeno roedor bem estabelecido modelo induzido NMIBC. Especificamente, observou-se que a) intravesical ALT-803 foi segura e bem tolerada por si só e em combinação com BCG, b), ALT-803, mais BCG reduziu a carga tumoral em 46% em comparação com o controlo, que foi maior do que com qualquer um dos agentes por si só, c ) monitorização imunitária sugeriram que a resposta anti-tumoral observada com a combinação de ALT-803 mais BCG foi ligado à produção e secreção de IL-1α, IL-1β e RANTES, o que, por sua vez, induziu a proliferação e activação de células NK e d ) respostas tumorais observados com a combinação de ALT-803 e BCG foram associados com uma diminuição significativa na angiogénese. Os resultados encorajadores apresentados neste relatório irá apoiar a nossa consideração para o desenvolvimento deste romance Duplet terapêutica no tratamento de pacientes com NMIBC.

Materiais e Métodos

Animals, reagentes e modelo de tumor

Noventa ratos fêmeas Sprague Dawley, de seis a oito semanas de idade, foram obtidos a partir de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). cuidados com os animais estava em conformidade com as recomendações do

O Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório

(Conselho Nacional de Pesquisa) e aprovado pelo nosso IACUC local no University of Central Florida. (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN) de N-butil-N- foi adquirido junto da TCI America (Portland, OR), dividido em alíquotas e dissolveu-se em 1% de Tween. ALT-803 (IL-15N72D:IL-15RaSu /Fc) foi gerado como descrito anteriormente [21] e diluiu-se com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). PBS serviram como controlo negativo. Liofilizado BCG foi comprado de Sanofi Pasteur Limited (Toronto, CA) e reconstituído de acordo com as instruções com PBS estéril e serviram como controlo positivo. Depois de permitir que os animais se adapte à nossas instalações durante uma semana, todos os animais, com excepção de cinco receberam 0,05% BBN na sua água de beber continuamente durante oito semanas induzindo a formação de NMIBC, que é uma substância carcinogénica bem estabelecida roedor induzida modelo BCa [25] – [ ,,,0],30] com modificações moleculares marcados semelhantes a BCa humana [31]. Após 8 semanas de exposição BBN, animais retomou água sem a adição de BBN. ​​

tratamento intravesical

Após a exposição BBN (semana 9), os ratos foram randomizados para um dos quatro grupos de tratamento (controle- PBS; ALT-803 a 1 ug /dose; BCG a 1,35 mg /dose [26], [27], ou ALT-803 a 1 ug /dose de BCG mais 1,35 mg /dose). Cada grupo continha 20 animais. Experiências preliminares com ALT-803 observou a) resposta terapêutica com uma dose de 1 ug intravesical e b) uma melhor resposta terapêutica, com a administração concomitante de ALT-803 mais BCG em comparação com a administração sequencial dos dois agentes (dados não mostrados). Todas as injeções foram feitas na bexiga em 200 ul de PBS estéril. Os ratos foram anestesiados com isoflurano, em seguida, um angiocateter de calibre 22 de Teflon (cateter transuretral) foi colocado dentro da bexiga via uretra e na urina foi completamente drenada da bexiga [32]. Em seguida, PBS, BCG, ALT-803, ou a combinação da terapia ALT-803, mais BCG foi entregue através da implantação transuretral através do cateter transuretral e permitiu a habitar na bexiga durante 1 hora por oclusão da uretra com uma sutura em bolsa. Após 1 hora, o fio de sutura de fio de bolsa foi removido e os ratos foram estimulados para expelir o conteúdo da bexiga [32]. A terapia intravesical foi administrado semanalmente durante um total de seis semanas para imitar a terapia intravesical de BCG em seres humanos [33]. Duas semanas após a conclusão da terapia intravesical, os animais foram sacrificados e os tecidos (

por exemplo.

, Sangue total, soro, urina, bexiga e baço) foram colhidos e processados ​​para análise subsequente. A Figura 1 ilustra o esquema de tratamento do estudo.

O tratamento com PBS, a BCG, ALT-803, ALT-803 ou mais BCG começou uma semana após a conclusão da exposição de oito semanas a 0,05% de N-butil-N- ( 4- hidroxibutil) nitrosamina na água potável. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos e tratados semanalmente durante seis semanas consecutivas de acordo com o horário. Os ratos foram sacrificados e necropsiados duas semanas mais tarde. CTRL, controle.

estudos de imagem de ultra-som

Ao longo do estudo, a carga tumoral intravesical foi monitorada

in situ

por ultra-sonografia transabdominal utilizando o sistema de imagem Vevo 2100 com um MS550D lado 22-55 MHz realizada MicroScan conjunto de transdutores (Visualsonics, Toronto, ON, Canadá). Resumidamente, os ratos foram anestesiados com isoflurano, em seguida, 200 ul de PBS estéril foi instilada na bexiga tal como descrito acima, para proporcionar uma imagem uniforme de todas as bexigas visualizadas. tumores intraluminais foram observados e imagens digitais capturadas. espessura da parede da bexiga (em milímetros), um substituto da carga tumoral, foi medida com o recurso de medição Vevo 2100.

A histopatologia de secções de tumor

bexigas ressecados foram inicialmente pesados, em seguida, 12 bexigas de cada grupo foram cheios com 200 ul de 10% de formalina tamponada neutra. O pescoço da bexiga foram ligados e as amostras inteiras colocadas em 10% de formalina tamponada neutra. Bexigas em formalina foram embebidas em parafina, seccionado (5 um) e colocados em Superfrost mais lâminas Micro (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). As restantes oito bexigas em cada grupo foram cheios com 200 ul de O.C.T. a incorporação de composto (Andwin Scientific, Schaumburg, IL) e o pescoço da bexiga foram ligados. As bexigas foram submersos em Tissue-Tek O.C.T. composto (Ted Pella, Inc., Redding, CA) em cryomolds e congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Bexigas congelados em O.C.T. foram seccionados (5 uM), aqueceu-se à temperatura ambiente durante 5 minutos, fixadas em metanol arrefecido com gelo durante 10 minutos, e lavadas com PBS antes da coloração imuno-histoquímica. Desparafinados e cortes congelados de cada rato foram submetidos a hematoxilina e eosina para avaliação histológica. Além disso, as lâminas desparafinizadas foram tratados com peróxido de hidrogénio a 1% em metanol a 100% para bloquear a actividade da peroxidase endógena seguido por recuperação de antigénios de ácido cítrico. As lâminas foram incubadas durante a noite com anticorpos contra CD3

+ (BD Biosciences; G4.18; anticorpo monoclonal, diluição de 1/250), CD8a

+ (BD Biosciences; OX-8; anticorpo monoclonal do rato, diluição 1 /10), CD161

+ (AbDSerotec; 10/78; anticorpo monoclonal do rato, diluição de 1/100) (detecção de células NK), CD163

+ (AbDSerotec; ED2 anticorpo monoclonal, a diluição 1/50) ( detectar macrófagos), Ki-67 (Dakota North America Inc .; MIB-5; anticorpo monoclonal de ratinho, a diluição 1/50), ou caspase 3 (tecnologia de sinalização celular; 5A1E; monoclonal anticorpo de coelho, a diluição 1/1 500). As secções congeladas foram incubadas durante a noite com anticorpos contra CD4

+ (BD Biosciences; OX-35, mouse anticorpo monoclonal, a diluição 1/250) ou CD31 (Santa Cruz Biotechnology; H3; anticorpo monoclonal de ratinho, diluição de 1/250). Em seguida, as secções desparafinadas e congeladas foram incubadas com anticorpos biotinilados anti-ratinho ou IgG anti-coelho (H + L) a 10 ug /ml (Vector Laboratories INC., Burlingame, CA). Subsequentemente, as secções foram coradas utilizando o kit de coloração ABC rato IgG ultra-sensível (Merck Millipore, Billerica, MA) ou o kit de imunocoloração de biotina /estreptavidina (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Todos os cortes corados foram fotografadas utilizando um microscópio óptico Nikon Eclipse E400 (Nikon Inc., Melville, NY) com a câmera digital CCD QIClick (QImaging, Surrey, BC, Canadá) e o software de imagem Nikon NIE-Elements Pesquisa Básica.

análise histopatológica detalhada da resposta neoplásica à terapia intravesical foi realizada em cada bexiga por dois observadores independentes, experientes (MM e aS). Resumidamente, CD3

+, CD4

+,

+ células-T, células e macrófagos CD8a NK foram contados em um mínimo de quatro campos selecionados aleatoriamente por campo de alta potência (hpf) em cada espécime. Os resultados foram marcados através do cálculo do número de células da infiltração imunocoloração.

Além disso, a angiogénese tumoral foi investigada em lâminas coradas com anti-31-CD anticorpo monoclonal e a densidade de microvasos (MVD, microvasos /mm

2) estava avaliada como anteriormente descrito por Weidner

et ai.

[34]. células ou grupos de células endoteliais positivas para CD-31 endoteliais individuais foram considerados como um navio. Quatro áreas com maior concentração de microvasos a partir de cada amostra foram identificados em 4 × ampliação e as imagens foram tiradas para quantificação de MVD em 200 ×. Os dois observadores independentes contou o número de microvasos em cada campo histológico. MVD da amostra foi estimada como uma média de navios em pelo menos quatro campos histológicos. Além disso, as lâminas de coloração com o anticorpo monoclonal dirigido contra Ki-67 avaliada proliferação. Ki-67 imunocoloração foi contada num mínimo de quatro campos seleccionados aleatoriamente a partir de cada grupo de tratamento a 200 × ampliação. As células com coloração nuclear questionável foram descontados. Os observadores teve os resultados calculando a percentagem de células de tumor que mostra a coloração nuclear característica (índice proliferativo). Por último, as lâminas de coloração com o anticorpo monoclonal dirigido contra a caspase-3 clivada apoptose avaliado. Caspase-3 clivada imunocoloração foi contada num mínimo de 3.000 células de cada grupo de tratamento a 200 × ampliação. Os dois observadores teve os resultados calculando a percentagem de células de tumor que mostra a coloração celular característico (índice apoptótico).

análise citométrica de fluxo de PMBC e baço para células-T, células NK e macrófagos

células mononucleares Rato sangue periférico recolhidos a partir de amostras de sangue total em tubos EDTA foram coradas directamente por incubação com anticorpos marcados fluorescentemente CD3

+ (eBioscience), CD4

+ (BD Biosciences), CD8a

+ (eBioscience) , NKG2D-positivo (eBioscience) (detecção de células NK), anticorpos F480-PE (eBioscience) (detecção de macrófagos), ou controlo de isotipo (eBiosciences, San Diego, CA) durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de lise de glóbulos vermelhos usando BD FACS Solução de Lise (BD Biosciences, San Jose, CA) à temperatura ambiente durante 3-5 minutos. As células foram subsequentemente lavadas duas vezes com PBS contendo soro fetal bovino a 1%. As células coradas foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences) e os dados foram coletados de 10.000 eventos /amostra. A análise dos dados recolhidos foi realizado utilizando o software Cyflogic (CyFlo LTD, Turku, Finlândia). Além disso, as suspensões de células individuais de baços dos ratos foram gentilmente gerado por homogeneização do tecido em uma placa de Petri e em seguida, passa através de uma peneira de tecido Cellector (Bellco Glass, Vineland, NJ). Os glóbulos vermelhos foram removidos a partir de esplenócitos de ratos com BD FACS solução de lise por incubação durante 3-5 minutos à temperatura ambiente, seguido por centrifugação a 1200 rpm durante 5 minutos. Os esplenócitos em pellet foram lavadas duas vezes com PBS contendo soro fetal bovino a 1%, seguido por coloração de imunofluorescência directa, tal como descrito acima.

urinária e de soro de citocina inflamatória ensaio ELISA

Anulado urina a partir de cada rato foi recolhido em um tubo em gelo contendo uma solução concentrada estabilizador de urina (Tris-HCl a 2 [pH 7,6], 5% de BSA, 0,1% de azida de sódio, e um comprimido de inibidor de protease de mini-COMPLETO (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)). A urina foi centrifugada e o sobrenadante foi armazenado a -80 ° C. Da mesma forma, o soro foi recolhido em tubos contendo EDTA, centrifugaram-se a 10000 × g durante 15 minutos, e armazenados a -20 ° C. As amostras de urina e de soro foram submetidas a perfis de 12 citoquinas inflamatórias usando um ensaio de ELISA (RATO citocinas multi-analito ELISArray, SABiosciences, San Diego, CA). Resumidamente, as amostras de urina e de soro foram incubadas em microplacas de 96 poços revestidas com anticorpos primários anti-rato contra 12 citocinas inflamatórias (IL-1 a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL -12, IL-13, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, RANTES e) e, em seguida, desenvolvida com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. Depois de adicionar o substrato e solução de paragem, a Optima Leitor Fluostar (BMG LABTECH, Ortenberg, Alemanha) foi utilizado para medir a absorvância a 450 nm.

Estatísticas

Os dados experimentais foram expressos como média ± SEM , exceto quando indicado. A análise estatística foi realizada utilizando teste não paramétrico de Kraskal-Wallis seguido pelo teste post-hoc de Dunnet para o peso da bexiga, a espessura da parede da bexiga, imunocoloração da bexiga, citocinas urinárias e citocinas séricas. análise de variância paramétrica seguida do teste post-hoc de Bonferroni foi realizada para os dados relacionados com os linfócitos dentro do baço e linfócitos no sangue periférico. A

p Art 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises estatísticas e figuras foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Resultados

A actividade antitumoral de BCG, ALT-803 e ALT- 803 além de BCG em NMIBC portadores de ratos

em um carcinógeno roedor modelo NMIBC induzido, monitorização de rotina de tumores foi realizada por ultra-sonografia de série com o sistema Vevo 1200. Os tumores foram detectados tão cedo quanto três semanas após exposição a N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina 0,05% na água de beber. Como demonstrado por imagens ultra-sónicas e confirmado em exame histológico, foram encontrados 100% de animais a desenvolver tumores. Nenhum animal tinha tumores palpáveis, avançados. Para determinar se as imagens de ultra-som pode ser utilizada para monitorizar e avaliar a carga tumoral, as bexigas foram analisados ​​e foi determinada a espessura da parede da bexiga (um substituto para a carga de tumor em milímetros). Posteriormente bexigas foram ressecados, pesados ​​e estudo histopatológico. Observamos uma correlação positiva (Spearman r = 0,55,

p Art 0,0001) entre a espessura da parede da bexiga e pesos da bexiga /tumor de bexiga, assim, relatamos pela primeira vez que a não-invasivo

in situ

monitorização de tumor da bexiga de roedor podem ser usados ​​para a) confirmar tumor ter e b) a redução do tumor reportar-terapêutico fardo.

ratos portadores de tumores de bexiga foram tratados intravesical durante 6 semanas consecutivas com PBS, o BCG, ALT -803 ou ALT-803, mais BCG. Outros que a hematúria escassa observou (talvez de cateterismo e /ou BCG), terapias intravesical foram bem tolerada, sem efeitos tóxicos apreciáveis ​​observou.

De acordo com o desenvolvimento de

in situ

tumores, pesos bexiga aumentada em 49% nos animais que receberam BBN quando comparado ao normal (não há BBN) animais de controlo (dados não apresentados). Contudo, após seis semanas de terapia intravesical com BCG, ALT-803 ou ALT-803 mais BCG diminuiu significativamente a carga do tumor em bexigas de ratos tratados com BBN (Fig. 2). peso da bexiga (média +/- SEM) foi relatado para ser: PBS 0,2 +/- 0,012 gramas, BCG 0,17 +/- 0,012 gramas, ALT-803- 0,15 +/- 0,0091 gramas e ALT-803, mais BCG 0.14+ /-0.0054 gramas. Além disso, antes de ser sacrifício na semana 16, 200 ul de PBS estéril, foi instilado em cada bexiga para assegurar a uniformidade no tamanho e uma série de imagens de ultra-som transversal e sagital foram obtidos. espessura da parede da bexiga (média +/- SEM) foi relatado para ser: PBS-1 +/- 0,11 mm, de BCG 0,7 +/- 0,05 mm, de ALT-803- 0,65 +/- 0,077 mm e ALT-803, mais BCG 0,54 +/- 0,083 mm. Assim, a partir dessas imagens, notamos com o tratamento BCG uma redução de 30% na espessura média da parede da bexiga, o que correspondeu a uma redução de 15% na variação de peso da bexiga em comparação com o tratamento PBS. tratamento ALT-803 só foi anotado para ter uma redução de 25% na espessura média da parede da bexiga e uma correspondente redução de 35% na variação de peso da bexiga quando comparado ao tratamento PBS. Curiosamente, a maior redução na parede da bexiga de espessura e bexiga de peso foi observado quando ALT-803 foi combinado com BCG conduz a uma redução de 30% na espessura da parede da bexiga e uma correspondente redução de 46% na variação de peso da bexiga em comparação com o tratamento de PBS (Fig. 2a 2C). Todos os resultados foram posteriormente confirmados por exame histológico detalhada (Figura 2d.) Em que H secções E-coradas foram microscopicamente examinada e classificada como (a) a mucosa urotelial normal, caracterizado por epitélio de menos do que três camadas, sem qualquer displasia ou (b) urotelial carcinoma [29].

NMIBC foram induzidos em ratos Sprague Dawley do sexo feminino pela exposição a N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina 0,05% na água de beber. Na semana 9, os ratos foram distribuídos aleatoriamente para um de quatro grupos de tratamento (PBS, BCG, ALT-803, ALT-803 ou mais BCG). Cada grupo recebeu terapia intravesical semanalmente durante seis semanas consecutivas. Na semana 16, os ratos foram sacrificados. A) Antes da ressecção da bexiga, 200 ul de PBS estéril, foi instilado em imagiologia bexiga e da bexiga foi realizada com o Vevo 2100 Sistema de ultra-som de VISUALSONICS (sonda 22-55 MHz). A espessura da parede da bexiga foi registada em milímetros. Foi realizado teste não paramétrico de Kraskal-Wallis seguido pelo teste post-hoc Dunnet de. Imagens representativas dos quatro grupos (

parte superior esquerda

), juntamente com espessura média da parede da bexiga (

canto superior direito

) são ilustrados. B) bexigas ressecados foram fixados em formalina a 10% tamponada e embebidos em parafina e em seguida coradas com hematoxilina e eosina. exame histopatológico detalhada de cada bexiga foi realizada para avaliar a carga tumoral. Imagens representativas dos quatro grupos são ilustrados. A maior redução na carga do tumor da bexiga foi visto em ALT-803 e ALT-803, mais BCG. C) espessura da parede da bexiga foi reduzida nos grupos tratados com ALT-803, BCG e ALT-803, mais BCG em relação ao controle. A grande redução na espessura da parede da bexiga foi observado no grupo tratado com ALT-803 e ALT-803 mais BCG (

P

= 0,0001). peso D) Bexiga foi reduzida nos grupos tratados apenas com BCG, ALT-803 sozinho e ALT-803, mais BCG em relação ao controle. A grande redução no peso da bexiga foi observado no grupo tratado com ALT-803 mais BCG. *,

p Art 0,05, **,

p Art 0,01, ***,

p

. 0,001

intravesical ALT-803, mais BCG promove um único linfocítica infiltração

As bexigas de ratos tratados também foram coradas para células imunes (CD3

+, CD4

+, CD8a

+ células-T , células e macrófagos infiltrados NK) (Fig. 3 e Tabela S1). O número de células CD3

+ células-T foi significativamente aumentada em ALT-803 isoladamente em comparação com PBS e BCG sozinho. Combinação de ALT-803 mais BCG não melhorou em função do número de infiltração + células-T

CD3 em comparação com sozinho ALT-803, mas, quando em comparação com BCG por si só, o número de infiltração + células-T

CD3 estava significativamente mais elevada no grupo de combinação. CD4

+ T células não foram afetados em qualquer grupo em comparação com PBS (

dados não mostrados

). CD8a

+ células-T foram significativamente aumentados em BCG sozinho, ALT-803 sozinho e ALT-803 mais BCG em comparação com PBS. A combinação de ALT-803 e BCG não ter um efeito maior do que BCG sozinho ou ALT-803 sozinho. Em seguida, o número de células NK não foi aumentada em BCG sozinho ou ALT-803 isoladamente em comparação com PBS, mas o número de células NK foi aumentada quando ALT-803 foi adicionado ao BCG. Além disso, a combinação de ALT-803 mais BCG resultou no aumento da infiltração de células NK em comparação com BCG sozinho ou ALT-803 sozinho. alterações Não é significativamente na infiltração de macrófagos foram observadas em qualquer grupo de tratamento.

infiltração tumoral de células positivas para CD3

+, CD8a

+, CD161 (células NK), ou CD163 (macrófagos) (200 ×) foram anotadas. Não ocorreram alterações foram observadas em células CD4

+ células-T (

dados não mostrados

). ALT-803 por si só aumentou tumorais CD8a

+ células que expressam, enquanto ALT-803, mais BCG aumento da expressão tumoral das células NK (Ver Tabela S1).

Inserir

, controlo positivo painel à esquerda do baço de rato e controle negativo painel direito a partir do baço de ratos sem anticorpo primário.

PBMC em sangue total de ratos tratados neste protocolo foi realizada imediatamente após a os animais foram sacrificados e submetidos a análise citométrica de fluxo para detectar a presença de células CD3

+, CD4

+, CD8a

+ células-T, células-NKG2D positivos e macrófagos. Não ocorreram alterações significativas foram observadas para CD3

+ e CD4

+ células-T, enquanto CD8a

+ T-células foram anotados para ser significativamente elevados apenas nos BCG só grupo. Todos os grupos (BCG sozinho, ALT-803 sozinho e ALT-803 mais BCG) demonstraram um aumento significativo em células NKG2D-positivos em comparação com o controlo. Por último, o número de macrófagos circulantes foi significativamente reduzida em ALT-803 sozinho e ALT-803 mais BCG, mas não em BCG sozinho (Fig. 4a). Resultados semelhantes foram obtidos a partir da análise dos tecidos esplénicas de rato. Especificamente, não há alterações significativas foram observadas com CD3

+, CD4

+ e CD8a

+ células-T entre os grupos de tratamento. No entanto, o número de células NKG2D-positivas foi significativamente aumentada nos baços de ratos em todos os grupos (BCG, ALT-803 e ALT-803 mais BCG), em comparação com o controlo. Combinação de ALT-803 mais de BCG não observe um aumento do número de células-positivos NKG2D comparação com BCG sozinho ou ALT-803 sozinho. Além disso, o número de macrófagos dentro do baço foi significativamente reduzida em ALT-803 sozinho, quando foi comparada com PBS e com BCG sozinho. O número de macrófagos retornou à linha de base quando ALT-803 foi adicionado ao BCG (Fig. 4b). Estes dados proporcionam evidências convincentes de que a combinação de ALT-803 mais BCG está associada com a estimulação de células NKG2D-positivos, que era provável que a célula efectora mediar a regressão do tumor durante a imunoterapia intravesical combinação.

A) mononucleares do sangue periférico células (PBMC) foram isoladas e analisadas por citometria de fluxo para a expressão de CD3

+, CD4

+, CD8a

+ células-T, células NK (NKG2D- positivos) e células de expressão F480 (macrófagos). ALT-803 sozinho, bem como, além ALT- 803 BCG resultou em um aumento de células NKG2D-positivas e uma diminuição em macrófagos em comparação com PBS. B) Os esplenócitos foram isolados e analisados ​​por citometria de fluxo para a expressão de CD3

+, CD4

+, CD8

células de expressão +, NKG2D-positivos e F480. Semelhante aos resultados PBMC, ALT-803 sozinho, bem como, ALT-803, mais BCG resultou em um aumento das células positivas NKG2D- e uma diminuição em macrófagos em comparação com PBS. *,

p Art 0,05, **,

p Art 0,01, ***,

p

. 0,001

administração intravesical de ALT-803, mais facilitada perfil de citocinas BCG original

Os soros de ratos tratados neste protocolo foram recolhidas e imediatamente armazenados a -80 ° C. Para a análise de citocinas, as amostras de soro foram descongeladas e, em seguida, submetidos a análise com o rato citocinas inflamatórias ELISArray ensaio de múltiplos analitos. Juntamente com a proliferação e activação de células NK mencionado acima, a administração intravesical de ALT-803 em combinação com BCG foi associado com o aumento dos níveis no soro das citoquinas de resposta imunes e inflamatórias, IL-1 e IL-1 em 52% e 52%, respectivamente, em comparação com o do grupo de controlo de PBS. Além disso, o aumento nos níveis de IL-1α e IL-1β foi mantida quando ALT-803 mais BCG foi comparado com BCG sozinho e ALT-803 sozinho (Fig. 5a). Em seguida, a urina de ratos tratados neste protocolo foram recolhidas e armazenadas a -80 ° C imediatamente após os animais foram sacrificados. Quando estiver pronto para a análise, as amostras de urina foram descongeladas e sujeitas ao ensaio de rato citocinas inflamatórias ELISArray multi-analito. Mais uma vez, as citocinas, IL-1α, IL-1β e RANTES foram aumentadas em 437%, 437% e 196%, respectivamente, na urina do ALT-803 mais BCG ratos tratados em comparação com o grupo de controlo de PBS.