Abstract

PIK3CA

(fosfoinositídeo -3-quinase, polipéptido, alfa) mutações catalíticas podem ajudar a prever a actividade anti-tumoral de fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /alvo de mamífero de inibidores da via da rapamicina (mTOR) em ambas as configurações pré-clínicos e clínicos. À luz da recente descoberta de células-tronco do câncer de iniciação tumorais (CSCs) em vários tipos de tumores, desenvolvemos um

in vitro

CSC modelo de tumores xenoenxerto estabelecidos em ratos de um tumor doente com cancro colo-rectal em que o CD133 + /EpCAM + população representada células de iniciação do tumor. CD133 + /EpCAM + CSCs foram enriquecidos em condições de cultura de células-tronco e formado em 3 dimensões esferóides tumorais. células tumorais esferóides exibiu propriedades CSC, incluindo a capacidade de diferenciação e auto-renovação, maior potencial tumorigénico e quimio-resistência. A análise genética usando um painel OncoCarta ™ revelou um

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mutação nestas células. Usando um PI3K inibidor duplo /mTOR, PF-04691502, que, em seguida, mostrou que o bloqueio da via PI3K /mTOR inibiu o

in vitro

proliferação de CSCs e

in vivo

crescimento do tumor xenoenxerto com gerenciável toxicidade. a inibição do crescimento do tumor em ratinhos foi acompanhada por uma redução significativa da Akt fosforilada (pAKT) (S473), um biomarcador substituto bem estabelecido de PI3K /mTOR inibição da via de sinalização. Coletivamente, nossos dados sugerem que a PF-04691502 exibe potente actividade anti-cancerígena no cancro colorectal, visando tanto

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CSCs mutantes e seus derivados. Estes resultados podem ajudar no desenvolvimento clínico da PF-04691502 para o tratamento de uma subpopulação de pacientes com câncer colorretal com resultados pobres

Citation:. Fang DD, Zhang CC, Gu Y, Jani JP, Cao J, Tsaparikos K, et al. (2013) antitumoral Eficácia da dupla PI3K /mTOR inibidor PF-04691502 em um modelo de tumor xenoenxerto humano derivados de câncer colorretal Stem Cells abrigando um

PIK3CA

Mutação. PLoS ONE 8 (6): e67258. doi: 10.1371 /journal.pone.0067258

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 23 de dezembro de 2012; Aceito: 13 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 fang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores têm as seguintes participações. Todos os autores são empregados tanto atuais ou antigos da Pfizer, o financiador do estudo. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O câncer colorretal é o terceiro mais comumente diagnosticado cancer para homens e mulheres nos Estados Unidos. Cerca de 103.170 novos casos de cancro colorectal são diagnosticados anualmente, com cerca de 51.690 mortes anuais [1]. No cancro colorectal, a via PI3K /mTOR é frequentemente desregulado por causa de mutações na subunidade p110α de

PI3K

. A via de sinalização da via PI3K /mTOR é um regulador chave de vários processos celulares, incluindo a proliferação, diferenciação, apoptose, motilidade, metabolismo, e autofagia. Assim, a activação da via oncogénica tornou-se um alvo terapêutico atractivo para o desenvolvimento de drogas [2]. Estudos pré-clínicos e clínicos indicam que o

PIK3CA

mutação, na ausência de um

KRAS

mutação é um marcador preditivo para a resposta aos inibidores de PI3K e mTOR [3] -. [6]

Além do everolimus inibidor de mTOR recentemente lançado, que é usado para o tratamento de uma ampla gama de tipos de cancro, uma série de inibidores de moléculas pequenas da via PI3K /mTOR sinalização estão actualmente em desenvolvimento clínico [7] – [10]. Estes agentes incluem inibidores de PI3K selectiva, inibidores de AKT, inibidores de mTOR sítio catalítico, e dupla via PI3K /inibidores de mTOR. PF-04691502, 2-amino-8-[trans-4-(2-hydroxyethoxy)cyclohexyl]-6-(6-methoxypyridin-3-yl)-4-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one, é um inibidor potente dupla de todas as isoformas de PI3K e mTOR (TORC1 e TORC2). Os atributos farmacológicos deste agente eficaz por via oral foram recentemente relatada [11]. PF-04691502 classe recombinante inibiu potencialmente I PI3K e mTOR em ensaios bioquímicos e suprimiu a transformação de fibroblastos aviária mediadas por tipo selvagem PI3K?, Δ ou mutante PI3Knull. PF-04691502 também inibiu a atividade mTORC1 nas células. Em

PIK3CA

linhas celulares de cancro -mutant, PF-04691502 suprimiu a fosforilação de AKT (S473) e proliferação celular inibida [11]. PF-04691502 demonstrado atividades antitumorais em modelos de xenotransplante de ovário e tumores glioblastoma derivados de linhas celulares de cancro que transportam tanto um

PTEN

exclusão ou

PIK3CA

mutação [11] e em um modelo de camundongo geneticamente modificada de ovário câncer impulsionado por um

Kras

mutação e

Pten

exclusão [12]. As atividades antitumorais de inibidores de PI3K /mTOR, incluindo PF-04691502, no cancro colorectal ainda precisam ser exploradas.

Estudos recentes têm demonstrado que os tumores colorretais hierarquicamente organizadas compor um pequeno subconjunto de CD133 + /EpCAM + CSCs expressando [13 ], [14]. CSCs são essenciais para o desenvolvimento e progressão do tumor, bem como a resistência à droga e metástase do tumor [15], [16]. A fuga de CSCs de quimioterapia e radioterapias atual pode explicar a resistência e reincidência do tumor [15], [16]. A importância da rede de sinalização /mTOR PI3K em biologia CSC tem sido notado recentemente [17]. A correlação de activação AKT e aumento da tumorigenicidade, stemness, e invasividade foi identificada num modelo de glioblastoma [18]. sinalização de PI3K activada foi encontrada a desempenhar um papel crucial na tumorigénese da próstata basal /células-tronco [19], [20]. Em combinação com outros agentes, o bloqueio da via PI3K /mTOR no cancro pancreático foi capaz de eliminar os CSCs pancreáticas e células estaminais leucemia, demonstrando a eficácia anti-CSC de inibir a via PI3K /mTOR [21], [22]. Considerando as importantes funções de CSCs, é interessante explorar se os agentes terapêuticos que visam a via de sinalização PI3K /mTOR são eficazes para o cancro colorectal impulsionado por CSCs abrigando uma célula somática

PIK3CA

mutação.

Nós relatamos aqui, a eficácia oral de um duplo inibidor de PI3K /mTOR, PF-04691502, num modelo de xenoenxerto de cancro do cólon humano dirigido por altamente tumorigénicas CD133 + /EpCAM + CSCs. No tumor do paciente, CD133 + /+ EpCAM células representadas as células tumorais sobre-iniciando xenotransplante. CD133 + /+ EpCAM células foram então propagadas e enriquecido como células de tumor, sob condições de esferóides de células estaminais. As células tumorais esferóides possuía as características adicionais de CSCs, incluindo a auto-renovação, quimio-resistência, maior tumorigênico potencial

in vivo

, ea capacidade de recapitular as características histopatológicas do tumor do paciente originais

In vivo

. A análise genética de 19 oncogenes comuns revelou que a população CSC sendo testado abrigava um

PIK3CA (H1047R)

mutação. Além disso, um inibidor de PI3K /mTOR dupla, PF-04691502, inibiu marcadamente a proliferação das CSCs

In vitro,

, bem como o crescimento de tumores de xenoenxerto de derivados pela população CSC em ratinhos. A análise Western blot mostrou que pAKT (S473) foi regulada negativamente em tumores de xenoenxerto que foram tratados com PF-04691502. No geral, nossos resultados sugerem que a PF-04691502 inibidor PI3K /mTOR tem actividade anti-proliferativa potente no

PIK3CA

CSCs mutantes, que justificam uma avaliação mais aprofundada dos inibidores em pacientes com câncer colorretal portadores de mutações PIK3CA.

Materiais e Métodos

Animais, animais de amostra do doente, eo estabelecimento de paciente-derivadas Xenoenxerto (PDX) Modelo de Tumor

consentimento informado escrito foi obtido a partir do participante do estudo, de 39 ano- homem velho com cancro colo-rectal, antes da cirurgia e da coleção da amostra de tecido. Os procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia em San Diego Human Research Proteções Programa Institucional Review Board (IRB). Todos os procedimentos experimentais em animais cumpriram com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute for Research Laboratory Animal, 1996) e foram aprovados pelo Comitê Global de Pesquisa e Desenvolvimento Institucional Animal Care e Use a Pfizer. Resumidamente, a ressecção revelou um estágio T3N2 pouco diferenciado carcinoma mucinoso colorectal com características de células em anel de sinete. Cirurgicamente tecido do tumor ressecado foi cortado em 2 a 4 mm

3 fragmentos e implantadas subcutaneamente no flanco de NOD /SCID (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine).

0 tumores palpáveis ​​P de xenotransplante (a primeira geração em ratos) formados em ratos com seis semanas pós-implantação. Quando o tamanho de tumores atingiram aproximadamente 500 milímetros

3, P

sub tumores foram então expandido em dez ratinhos NOD /SCID por re-implantação subcutânea de fragmentos tumorais para gerar P

1 tumores de xenoenxerto. A histopatologia dos tumores de xenoenxerto foi revisto em comparação com o tumor do paciente por um conselho patologista certificado (PBL).

Culturas

processamento de tecidos e Spheroid Tumor de CSCs

tecidos tumorais de xenotransplante removido cirurgicamente ratos foram dissociados enzimaticamente usando uma solução de Accumax (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) em células isoladas e cultivadas em meio de células-tronco isento de soro a 37 ° C em 5% de CO

2, atmosfera humidificada. Caule meio celular foi gerado por meio de cultura isento de soro condicionado, que foi rotineiramente usado para células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas), em culturas de fibroblastos de rato embrionários durante 24 horas e, em seguida, misturar o meio condicionado com células estaminais embrionárias humanas meio fresco (01:01 numa ratio) suplementado com 4 ng /ml de bFGF, 10 ng /mL de EGF, 10 mg /ml de insulina bovina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), 5,5 mg /ml de transferrina humana (Sigma-Aldrich), e 5 ng /ml de selenito de sódio (Sigma-Aldrich; 23). células de tumor primário foram cultivadas em frascos de ultra-baixa superfície de fixação (Corning, Lowell, MA) durante os primeiros 3 meses para formar esferóides tumorais não aderentes. Depois de culturas de células tornou-se estável esferóides, CSC culturas foram transferidas para frascos Nunc ™ poliestireno de cultura de células não-tratadas (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY).

e Citometria de Fluxo de células activadas por fluorescência (FACS)

rotulagem padrão antigénio da superfície celular e citometria de fluxo foram realizadas avaliações. células tumorais dissociadas foram analisados ​​utilizando CD133 conjugado com ficoeritrina (Miltenyi Biotech) e APC-EpCAM conjugado específico antigénio-anticorpos epitélio (CD326, antigénio de superfície de células epiteliais, BD Biosciences). separação de células foi realizada em um classificador de células FACSAria I (BD). As células não coradas e as células coradas com anticorpos de controlo do mesmo isotipo foram usadas como controlos negativos. Em células primárias isoladas a partir de tumores de xenoenxerto, células mortas e células de murídeo foram excluídos usando iodeto de propídio (PI) e um anticorpo monoclonal específico anti-ratinho conjugado com isotiocianato de fluoresceína (H-2k [d] -FITC; BD)., Respectivamente

Ensaio de viabilidade celular após o tratamento com o Composto

Dissociated viável, CSCs esferóides individuais e as células diferenciadas foram plaqueadas a 10.000 e 5.000 células /poço, respectivamente, em placas de 96 poços de fundo transparente (Corning) e tratada com os compostos indicados durante 5 dias. A viabilidade celular foi determinada utilizando um kit de ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter Glo® (Promega).

proliferação e diferenciação celular Indução

proliferação celular e expressão de citoqueratina foram medidas simultaneamente utilizando um isotiocianato de fluoresceína 5- bromodesoxiuridina (BrdU) kit de fluxo (BD Biosciences) e anticorpos anti-citoqueratina conjugados com ficoeritrina (7/8 citoqueratina CAM 5.2, BD Biosciences). CSC diferenciação foi induzida através da cultura de CSCs esferóides em meio DMEM suplementado com FBS a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) em frascos de cultura de células normais.

A análise mutacional de Oncogênicos Mutações

sequenciação mutacional foi fornecida por Sequenom (www.sequenom.com) usando um painel v1.0 OncoCarta ™, que contém 238 mutações de ponto de acesso em 19 oncogenes em 24 multiplexes. Os resultados foram analisados ​​utilizando a função Oncomutations Relatório em Tipos 4.0 (Sequenom Inc, San Diego, EUA), utilizando a função “OncoMutation Reports”. Este algoritmo reprocessa os dados espectrais crus e compensa automaticamente áreas de pico com base em formações de sal e aduto matriz previamente estabelecidos que podem obscurecer C para A e G para T mutações. Os dados corrigidos resultantes foram então pesquisados ​​para picos de mutação de mais de 7%, em comparação com o tipo de pico selvagem, e cada ensaio relatado foi analisada individualmente e avaliada por critérios de validade utilizando como taxa de extensão, a forma da área de pico e de localização de área de pico sobre a posição do pico esperado.

In vivo

Tumorigênese Ensaio

FACS-ordenadas CD133 + /EpCAM + e CD133- /EpCAM + células isoladas a partir de P

1 (ou seja, o 2

nd geração em ratos) tumores de xenoenxerto foram misturadas com Matrigel (BD, 01:01 proporção em volume) e implantado por via subcutânea em NOD /SCID (The Jackson Laboratory) para analisar a sua capacidade de iniciar tumores. Os volumes tumorais, que foram calculados com base em comprimento x largura x altura x 0,5, foram medidos no dia 84 pós-implantação e são apresentados como a média ± SEM (n = 5).

In vivo

diluição limitante Ensaio

O diferencial potenciais tumorigênicos dos CSCs cultivadas e seus descendentes diferenciados foram determinados em ratinhos SCID-bg (The Jackson Laboratory), injetando números tituladas de células misturadas com Matrigel na proporção 01:01. Os volumes dos tumores foram medidos em intervalos regulares durante um período de 63 dias e representados como a média ± SEM (n = 5).

In vivo

antitumoral Eficácia Avaliação

Tumor estudos de inibição foram realizados em ratinhos SCID-BG. Resumidamente, 2 × 10

6 viável dissociado CSCs foram inoculadas por via subcutânea, e de ratinhos com aproximadamente 200 mm

3 tumores foram aleatoriamente divididos em três grupos e foram tratados com 10 mg /kg de PF-04691502 (PO, QD × 14 ; n = 8) ou de veículo (0,5% de metilcelulose em água, PO, QD × 14; n = 8). Os volumes dos tumores são apresentados como a média ± SEM. mudança relativa de peso corporal (RCBW;%) foi calculado como o produto de (IBW-BW0) /BW0 × 100%. IBW era o peso do corpo no dia da dosagem, e BW0 era o peso corporal, no primeiro dia do tratamento.

tumores Análise Western Blot

veículo- ou PF-04691502-tratados eram flash congelado com nitrogênio líquido. Os tumores congelados foram homogeneizados e lisados ​​com um tampão de lise × celular (Cell Signaling Technologies). Os lisados ​​foram limpos de restos celulares por centrifugação a 14000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, os sobrenadantes foram recolhidos, e os níveis de proteína foram quantificadas pelo ensaio de proteína BCA (Pierce). Quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por géis de poliacrilamida. Após a transferência da proteína para membranas de nitrocelulose, as membranas foram transferidas com o anticorpo primário pAKT (Ser473; Cell Signaling Technologies) ou α-tubulina (Sigma). Anticorpos secundários foram adquiridos de Amersham Biosciences. Bandas foram detectados por quimioluminescência com o SuperSignal Oeste Dura Substrato (Pierce), e as imagens foram capturadas com um sistema AlphaImager.

Análise Estatística

Todas as análises foram realizadas utilizando GraphPad Prism (V.5.00 para Janelas). Os valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Estabelecimento de PDX modelos de tumor e confirmação de CD133 + /EpCAM + Oncogenia CSC População

Fragmentos de amostra de tumor fresco ressecado a partir. um paciente com cancro colorrectal foram implantadas subcutaneamente em dois NOD /SCID para estabelecer um modelo de PDX cancro colorrectal, que foi então usada para gerar CSCs esferóides em cultura (fluxo de trabalho para a produção de esferóides CSCs mostrado na Fig. 1A). Simultaneamente, as células primárias recentemente dissociados a partir de amostras de doentes foram avaliadas quanto à expressão de marcadores de cólon CSC CD133 /EpCAM por citometria de fluxo (Fig. 1B). Após a exclusão de células não viáveis ​​por coloração com iodeto de propidio (Fig. 1B-a), foram detectados cerca de 4-6% CD133 + /EpCAM + células no tecido do tumor (Fig. 1B-C), o que sugere a presença de CSCs putativos.

a

, esquema que ilustra o fluxo de trabalho de esferóide geração CSC e populações de células diferenciadas como um sistema experimental, incluindo o transplante de um tumor do paciente em NOD /SCID, propagação de CSCs de P

1 tumores de xenoenxerto (esferóide; 10 × ampliação da objetiva) e diferenciação das CSCs em células aderentes com morfologia epitelial (diferenciadas; 20 ×).

B

. Análise citométrica de fluxo das células primárias isoladas a partir do tumor original do doente. coloração de PI exclui as células mortas (a). APC- e controlos de isotipo conjugado com PE são mostrados em (b). Detectou-se uma população de células CD133 + /+ EpCAM células (C).

C

. FACS de CD133 + /EpCAM + CSCs do cólon a partir da população de células primárias derivadas de P

1 tumores de xenoenxerto. As células mortas e as células de murideo foram excluídos, por coloração com PI e com um anti-murganho anticorpo monoclonal H-2k específica [d], respectivamente (um b). CD133 + /EpCAM + e CD133- /EpCAM + populações foram fechado de acordo com as linhas de base dos controlos isotípicos e classificadas (c). Finalmente, o enriquecimento de ambas as populações das amostras ordenadas foi confirmada por citometria de fluxo (d E).

D

. A expressão dos marcadores de CSC numa fracção dos esferóides CSCs cultivadas (painel direito). painel esquerdo mostra controlos isotípicos.

Quando P

1 tumores de xenoenxerto atingiu 500-700 mm

3, os tecidos tumorais foram coletadas e processadas para análise de citometria de fluxo e separação de células. A análise de citometria de fluxo mostrou que a percentagem de CD133 + /+ EpCAM em células P

1 tumores de xenoenxerto permaneceu na mesma gama que o do tumor primário.

1 células tumorais dissociadas individuais P foram ainda classificadas por FACS. Após a exclusão de células não viáveis ​​(Fig. 1C-a) e células de murino (Fig. 1C-B) como descrito em Materiais e Métodos, populações CD133 + /EpCAM + e CD133- /EpCAM + de células foram isolados (Fig. 1C-C ). populações de células classificadas foram enriquecidas para CD133 + /+ EpCAM (~98%; A Fig. 1C-d) ou CD133- /EpCAM + (~96%; A Fig. 1C-E) células. Ambas as populações de células foram imediatamente misturados com Matrigel (a uma razão de 01:01 em volume) e implantado subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID para determinar o seu potencial tumorigénico. Com base nos números de células viáveis, CD133 + /+ e EpCAM CD133- /EpCAM + células foram implantadas em cinco ratinhos NOD /SCID a 2.400 e 25.000 células por animal, respectivamente. tumores palpáveis ​​foram detectados primeiro na CD133 + /+ EpCAM grupo em 6 semanas e em seguida detectado no CD133- /EpCAM + grupo com 7 semanas pós-implantação. Quando os animais foram sacrificados na semana 12, o volume dos tumores derivados de CD133 + /+ EpCAM células foi significativa maior do que o derivado de CD133- /EpCAM + células (Figura 2A;. P 0,01). Estes resultados confirmam que o câncer colorretal é composto por uma pequena população de CSCs de iniciação tumorais, que são positivos para CD133 e expressão EpCAM.

A

. Os volumes médios de tumor em ratinhos NOD /SCID inoculados com CD133 + /EpCAM + (3.400 células /animal; putativo CSCs) ou CD133- /EpCAM + (25.000 células /animal; putativos diferenciadas) células após 12 semanas de implantação (média ± SEM; n = 5 ).

B

. Percentagem de CD133 + /EpCAM + células que expressam na CSC e populações de células diferenciadas (média ± SEM, n = 3; não emparelhado, bicaudal teste t de Student, P 0,05).

C

. Os resultados representativos das taxas de proliferação celular e os níveis de expressão de citoqueratina em CSCs e células diferenciadas. o número de células em eixos Y são ajustados como uma porcentagem dos números de células máximas analisadas.

D

. Os dados representativos mostrando a

in vitro

sensibilidade droga de CSCs e sua progênie diferenciada em resposta a oxaliplatina, avaliada pelo ensaio CellTiter Glo®.

Geração de Culturas Spheroid estáveis ​​de CSCs

Após a cultura de células primárias isoladas a partir de P

1 tumores de xenoenxerto em meio para mastócitos isento de soro, esferóides não aderente 3-dimensionais foram observados dentro de 2-3 semanas (Fig. 1A), e uma maior expansão do cultura gerada uma grande quantidade de esferóides dentro de 2 meses. Por citometria de fluxo análises de células esferóides cultivadas mostram que CD133 + /EpCAM + células compostas de 33,2% do total de células (Fig 1D;. Painel da direita), sugerindo que a CD133 + /EpCAM + células foram enriquecidas a cerca de 5 vezes na cultura esferóide do tumor em comparação com 6/4 % de CD133 + /+ EpCAM células, tanto na amostra do paciente original e os tumores de xenoenxerto (Fig. 1B e dados não mostrados, respectivamente). As células tumorais esferóides foram continuamente cultivadas

in vitro

ao longo dos últimos 2,5 anos sem mostrar uma mudança significativa nos níveis de expressão /EpCAM CD133 ou sinais de senescência. As propriedades CSC de células tumorais esferóides foram demonstrados nas experiências descritas abaixo. As células tumorais esferóides são, assim, referido no texto como CSCs.

Relativamente Quiescent, indiferenciado Estado de CSCs

Para induzir a diferenciação de CSCs, as células tumorais esferóides foram dissociadas em células isoladas e cultivadas em soro contendo meios de comunicação, tal como descrito nos Materiais e Métodos. As células aderentes com morfologia epitelial apareceu dentro de 1-2 dias (Fig. 1A) e continuou a propagar-se rapidamente durante 2-3 meses, até proliferação interrompida. Consistente com a constatação anterior na população CSC directamente derivados a partir de uma amostra de pacientes [23], foi observada uma redução da fracção + /EpCAM + células CD133 no aderentes, as células diferenciadas (11,2%, a Fig. 2B).

Ele tem sido implicado que CSCs manter um estado de repouso. Foram avaliadas as taxas de proliferação de células, utilizando um fluxo de citometria de BrdU kit. Os resultados mostraram que a população CSC enriquecido continha ~38.5% de células positivas para BrdU em comparação com ~51.6% nas células diferenciadas. Reduziu a incorporação de BrdU na população CSC indica que estas células eram relativamente quiescente em comparação com células diferenciadas (Fig. 2C). Do mesmo modo, a fracção de células que expressam citoqueratinas em CSCs foi menor (~17.8%) comparada com a de a população de células diferenciadas (~44.7%; A Fig. 2C). Como citoqueratina é um marcador geral de diferenciação epitelial, níveis mais baixos de expressão citoqueratina em CSCs são indicativos de seu estado relativamente indiferenciado.

Resistência a Drogas dos CSCs

In vitro

celular ensaios de viabilidade revelou que, em comparação com células diferenciadas, CSCs exibiu uma resistência substancial a oxaliplatina (Figura 2D;. diferença no declive da regressão linear; P 0,01). A nossa descoberta está de acordo com relatórios anteriores que mostram a natureza resistente a medicamentos de CSCs [24] – [26]., Sugerindo que estas células podem ser responsáveis ​​pela recorrência clínica em pacientes com câncer após a quimioterapia

tumorigenicidade e Tumor Desenvolvimento de CSCs

in vivo

quantidades variáveis ​​(ou seja, 10

3, 10

4, 10

5 e 10

6 células /animal) de CSCs dissociadas e as células diferenciadas foram inoculados subcutaneamente em cinco ratinhos SCID-BG. O tumor ter taxas entre os dois grupos pareceu ser semelhante (Figura 3B.); No entanto, os volumes médios dos tumores eram dramaticamente maior nos ratos implantados com 1 × 10

5 ou 1 × 10

6 CSCs do que nos grupos injectados com o mesmo número de células diferenciadas (Figura 3a;. diferença no linear inclinação da regressão, P 0,01). Estes resultados sugerem que CSCs são mais tumorigénico em comparação aos seus descendentes célula diferenciada.

A

. Os volumes tumorais no

in vivo

limitando ensaio de diluição para CSCs e sua progênie diferenciada em ratinhos SCID-bg como descrito nos Materiais e Métodos (média ± SEM; n = 5). As diferenças nas taxas de crescimento foram encontrados entre a CSC e grupos de células diferenciadas inoculados com o número de células mais elevadas (1 × 10

6 e 1 × 10

5; diferença inclinação na regressão linhagem; P 0,01).

B

. Tumor tomar taxas aos 63 dias pós-implantação para CSCs e progênie diferenciada.

C

. H E seções do tumor primário paciente manchado (

a

) e tumores de xenoenxerto derivados de CSCs (

b

) e as células diferenciadas (

c

; painel superior, 40 ×; painel inferior, 4 ×). células em anel de sinete eram frequentemente identificados em ambos os pacientes e tumores CSC-driven e são indicados por setas (a e b em 40 ×). Um gráfico de pontos mostra a frequência de células em anel de sinete identificados no tumor do paciente, o xenotransplante CSC-derivado eo xenotransplante células derivadas diferenciado (d).

recapitulação de Histopatologia do paciente e Frequência de CD133 + /células EpCAM + em Xenoenxerto tumores

tumores de xenoenxerto derivados de CSCs e células diferenciadas foram processadas para exame histológico para comparar com a morfologia do tumor primário paciente. células em anel de sinete foram frequentemente identificado em ambos o tumor do paciente (Fig. 3C-a) e os xenoenxertos de CSC-derivados (Fig. 3C-b). células em anel de sinete conter um único vacúolo citoplasmática, que desloca excentricamente o núcleo (assinaladas com setas). Em contraste, as células em anel de sinete estavam praticamente ausentes nos xenoenxertos derivadas de células diferenciadas (Fig. 3C-C). Com base na avaliação de um patologista placa-certificado, as percentagens das células em anel de sinete foram de aproximadamente 45%, 38% e 1% para o tumor do paciente, xenotransplante CSC-derivado eo xenoenxerto derivado de células diferenciadas, respectivamente (Figura 3C -d). Estes resultados indicam que os tumores xenoenxerto proveniente da população CSC melhor recapitular as características histológicas do tumor original paciente.

Antes de implantação em ratos, as percentagens de células que expressam CD133 + /EpCAM + marcadores foram maiores na população CSC-enriquecido (33,2%) do que em células diferenciadas (11,2%; Fig. 2B). Apesar de as percentagens mais elevadas de CD133 + /EpCAM + células na população CSC cultivadas, a percentagem de CD133 + /EpCAM + nos tumores de xenoenxerto desceu para 4-6%, o que é consistente com a percentagem de CD133 + /EpCAM + observado no tumor original do doente (Fig. 1BC e Fig. 4A). Em contraste, CD133 ~ 2% + /+ EpCAM células foram observadas no tumor xenoenxerto celular diferenciado (Fig. 4A). Estes resultados sugerem que CSCs cultivadas diferenciar após a implantação.

A

. Citometria de fluxo e do CD133 + /EpCAM + fração em tumores de xenoenxerto gerados por CSCs e progênie diferenciada. Os dados são apresentados como a frequência CSC representando a percentagem de CD133 + /+ EpCAM células em tumores de duas origens distintas (média ± SEM, n = 3; não emparelhado, bicaudal, teste t de Student, P 0,05).

B

. Re-implante de fragmentos de tumor obtidos a partir de tumores de xenoenxerto CSCs ou derivadas de células diferenciadas em ratinhos SCID-BG secundárias. Os volumes dos tumores são apresentados como a média ± SEM (n = 5). A diferença nas curvas de crescimento entre os dois grupos é estatisticamente significativa (diferença na inclinação por regressão linear; P 0,05).

C

. A proliferação celular das células primárias isoladas a partir de qualquer CSCs ou tumores de xenoenxerto derivadas de células diferenciadas na condição de cultura de células-tronco. As células viáveis ​​foram plaqueadas a 20000 células por poço e cultivadas durante 17 dias. Os números de células foram contadas manualmente, e as contagens de células totais são apresentados como a média ± SEM (n = 6; não emparelhado, bicaudal teste t de Student, P 0,01).

D

. culturas esferóide CSC restabelecida nas condições de células-tronco a partir de tumores de xenoenxerto gerados pela implantação de série de tumores xenoenxerto CSC-derivados. P

2, CSCs cultivadas a partir de tumores de xenoenxerto derivadas das CSCs originais. P

3, CSCs cultivadas a partir de tumores de xenoenxerto derivados da P

2 CSCs.

E

. espectro de massa parcial MALDI-TOF mostrando a mutação H1047R em

PIK3CA

. As linhas pontilhadas vermelhas indicam, da esquerda para a direita, o pico primário unextended, os 3 picos potenciais para o mutante alelos G ou T e do tipo selvagem alelo. O pico de alta no meio da figura é um alelo T do

PDGFRA

no mesmo espectro de massa MALDI-TOF.

auto-renovação Capacidade de CSCs

a capacidade de auto-renovação, uma propriedade chave dos CSCs, foi avaliada por meio do transplante de série de tumores de xenoenxerto, como descrito nos Materiais e Métodos. Resumidamente, os tumores de xenoenxerto de derivados de CSCs ou células diferenciadas foram removidos a partir de ratos portadores de tumor. fragmentos de tumor (2-4 mm

3) foram implantados subcutaneamente em ratinhos SCID-BG secundárias. tumores de xenoenxerto (designados como P

2 tumores de xenoenxerto) originários a partir de fragmentos de tumor de células diferenciadas cresceu lentamente em comparação com os tumores derivados de fragmentos de tumor CSC (Fig. 4B). Os resultados da experiência de implantação de série acima sugerem que os tumores de origem CSC crescer mais agressivamente em conjunto com uma maior percentagem de CSCs dentro do implante de células /fragmento. Por conseguinte, o

In vitro

cultivo de células de tumor primárias derivadas do tumor de xenoenxerto proveniente CSCs exibiu uma capacidade proliferativa mais elevada sob condições de células estaminais em comparação com os isolados a partir dos tumores originários a partir de células diferenciadas (Fig. 4C). Estes resultados indicam que as células primárias de tumores CSC-derivadas podem ter uma vantagem de crescimento

in vitro

provavelmente devido ao seu elevado teor de CSCs.

Spheroid CSCs (designado como S

2 ) foram sequencialmente estabelecida a partir de P

2 de xenoenxerto de tumores (Fig. 4D). Quando implantadas em ratos, S

2 CSCs consistentemente formado rapidamente crescente P

3 tumores de xenoenxerto (dados não mostrados). S

3 CSCs também foram re-estabelecidas a partir de células primárias geradas a partir de P

3 tumores (Fig. 4D). Ambos s

2 S e células + /EpCAM +

3 CSCs continham CD133 em níveis comparáveis ​​aos das CSCs parentais (30-40%; dados não mostrados). Os resultados acima sugerem que o

in vitro

CSCs colorretais cultivadas são capazes de auto-renovação.

Análise do Common Oncogênicos Mutações em CSCs e Biomarcador Descoberta

Para identificar biomarcadores preditivos que potencialmente pode orientar a terapia direcionada, realizamos a análise genética com o DNA painel usando OncoCarta ™ isolado de CSCs cultivadas e células diferenciadas. A análise mutacional de 19 oncogenes comuns, incluindo

ABL1, AKT1, AKT2, BRAF, CDK, EGFR, ErbB2 FGFR1, FGFR3, FLT3, JAK2, KIT, MET, HRAS, KRAS, ARN, PDGFRα, PIK3CA,

e

RET

, foi conduzida. Curiosamente, apenas o

PIK3CA (H1047R)

mutação foi identificada em ambos os tipos de células (Fig. 4E).

atividade antiproliferativa em profundidade da PF-04691502 em CSCs Mutant

em seguida, determinou o

in vitro

atividade antiproliferativa da PF-04691502, um duplo inibidor potente de todas as isoformas de PI3K e mTOR (TORC1 e TORC2). Com efeito, PF-04691502 exibiu um efeito inibidor significativo sobre a proliferação de células de CSCs (Fig. 5A). Curiosamente, ao contrário de oxaliplatina (ver Fig. 2D), PF-04691502 mostraram um efeito inibitório semelhante em ambos os CSCs mutantes e a sua progenia diferenciada (IC

50 = 202 nM e 195 nM, respectivamente), sugerindo que a actividade antiproliferativa de PF

B

. Como mostrado na Fig.