Abstract

activação aberrante de PI3K sinalização /AKT representa uma das alterações moleculares mais comuns no cancro do pulmão, embora a contribuição relativa dos componentes individuais da cascata para o desenvolvimento NSCLC ainda não é bem definida. Nesse artigo, investigaram a relação entre a expressão e alterações genéticas de os componentes da via PI3K /AKT [KRAS, a subunidade catalítica de PI3K (p110α), PTEN, AKT1 e AKT2] e da activação de AKT em 107 CPNPC cirurgicamente ressecado e analisaram as relações existentes com características clínico-patológico. A análise da expressão foi realizada por imuno-histoquímica em tissue micro matrizes (TMA); análise de mutação foi realizada por sequenciação de ADN; variação do número de cópia foi determinado por FISH. Relatamos que a activação da via PI3K /AKT em doentes com NSCLC italianas está associada com alto grau (G3-G4 comparado com G1-G2; n = 83; p 0,05) e doença mais avançada (fase TNM III versus as fases I e II ; n = 26; p 0,05). Além disso, verificou-se que a perda de PTEN (41/104, 39%) e a superexpressão de p110α (27/92, 29%) representam a aberração mais freqüente no CPNPC. As lesões moleculares menos frequentes composto a sobre-expressão de AKT2 (18/83, 22%) ou AKT1 (17/96, 18%), e mutação KRAS (7/63, 11%). Nossos resultados indicam que, entre todos os genes, apenas a superexpressão p110α foi significativamente associada à activação AKT no CPNPC (p = 0,02). Manipulação de expressão p110α em células de câncer de pulmão transportando um alelo ativa PI3K (NCI-H460) proliferação eficiente reduzido de células NSCLC

in vitro o crescimento

e tumor

in vivo

. Finalmente, o ARN de perfis de células pulmonares epiteliais (BEAS-2B) que expressam um alelo mutante de PIK3 (E545K) identificou uma rede de factores de transcrição, tais como MYC, FOS e HMGA1, anteriormente não reconhecida para ser associado com a sinalização de PI3K aberrante em cancro do pulmão.

Citation: Scrima M, De Marco C, Fabiani F, Franco R, Pirozzi G, Rocco G, et al. (2012) Sinalização redes associadas com AKT Activation em Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC): New Insights sobre o Papel dos Phosphatydil-inositol-3-quinase. PLoS ONE 7 (2): e30427. doi: 10.1371 /journal.pone.0030427

editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |

Recebido: 25 de julho de 2011; Aceite: 16 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Scrima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) para GV e AW e por União Europeia (IP: CRESCENDO, contrato n.er LSHM-CT-2005-018652), Ministero dell’Università e della Ricerca (PRIN, Grant n.er 2008CJ4SYW_004) para AW Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1], [2]. câncer epitelial de pulmão é classificado em dois grupos principais: cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) (cerca de 15% de todos os cânceres de pulmão) e câncer de pequenas células não-pulmão (NSCLC) (cerca de 85% de todos os cânceres de pulmão) [3] . NSCLC compreende carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma (ADC), e cancro do pulmão de células grandes (LCC) [3]. Apesar dos avanços na detecção precoce e tratamento padrão, NSCLC é muitas vezes diagnosticada em um estágio avançado e os pacientes muitas vezes têm mau prognóstico, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos menos de 15% [4], [5]. Por esta razão, uma melhor compreensão das origens moleculares da doença pode contribuir para melhorar o tratamento terapêutico de doentes com cancro de pulmão.

Estudos recentes têm mostrado que o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) cascata de sinalização é frequentemente superativada em humana cancro [6] – [8] que joga um papel crucial tanto na iniciação e progressão do NSCLC [9], [10]. A via PI3K regula as funções celulares tais como a proliferação, a sobrevivência, a motilidade e a angiogénese que são críticas para o crescimento e /ou manutenção de tumores [11], [12]. O ponto final da via PI3K é AKT, uma cinase de proteína serina /treonina que medeia a maioria dos sinais canalizados através da via PI3K. AKT é activado por meio do recrutamento de membrana celular através de ligação do domínio PH à sua fosfatidilinositóis 3′-fosforilados gerados por PI3K e subsequente fosforilação no T308 e S473 [12], [13]. Por outro lado, a fosfatase PTEN lípido atenua a activação AKT por desfosforilação posição 3 ‘do fosfatidilinositóis [14].

activação AKT aberrante contribui para a carcinogénese do pulmão [9], [10]. Hiperactivação de AKT é detectado na maioria das linhas celulares de NSCLC [15] – [17], e em 30-75% CPNPC [18] – [22], e promove a resistência a quimioterapia e a terapia de radiação [16]. activação AKT no câncer está actualmente avaliada utilizando anticorpos específicos para fosfo contra S473 em análises de imuno-histoquímica de amostras tumorais. Embora a fosforilação de AKT em S473 tem sido correlacionada com os resultados clínicos pobres em muitos tipos de tumor, resulta em câncer de pulmão são aparentemente incompatíveis [7] – [10] tendo sido associada com qualquer um prognóstico pobre ou boa [20] – [22]. AKT pode ser activado através de vários mecanismos, que resultam de acontecimentos distintos e frequentemente mutuamente exclusivas, que incluem mutações de activação (KRAS, PIK3CA ou AKT1), o aumento da expressão (PIK3CA, AKT1, AKT2) ou perda de PTEN [10]. No entanto, a contribuição relativa dos componentes individuais dentro da via PI3K de activação AKT em CPNPC ainda não é clara. Neste artigo nós investigamos a relação entre as alterações genéticas presentes nestes genes e a ativação de AKT em NSCLC.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

competência paciente foi conduzido de acordo com interno Conselho de revisão do INT Fondazione Pascale (Nápoles, Itália) (CEI 556/10 de 12/3/2010). O estudo foi aprovado pelo Conselho interna do AOU Mater Domini /Universidade Magna Grécia (Catanzaro, Itália) Revisão na reunião de 16/3/2011. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as orientações italianas competentes e foi aprovado pela Comissão Interna de Estudo Animal (CESA) do Instituto de Investigação Genética “Gaetano Salvatore em 7 de abril

th 2008 (CESA 10-08).

Os pacientes

materiais

Arquivo de 107 pacientes com diagnóstico de NSCLC [3] foi obtido a partir INT Fondazione Pascale (Nápoles, Itália). A idade média foi de 64 anos (intervalo 28-82). Entre os pacientes com os dados clínicos disponíveis, as mulheres tinham 18 e os machos 83. Stage foi conhecido por 81 pacientes: 67 pacientes tinham doença em estágio I-II e 14 tinham doença em estágio III-IV. Grade era conhecido por 83 pacientes: 35 casos foram G1-G2 e 48 foram G3-G4. Ver Tabela S1, S2 e Tabela Tabela S3 para as características clínicas mais detalhados de todos os pacientes.

TMA lâminas foram desparafinadas, aquecida numa panela de pressão com EDTA 1 mM, pH 8,0, durante 10 min, e incubadas com pepsina a 37 ° C durante 30 min. As lâminas foram então desidratados em concentrações crescentes de etanol, e depois seco ao ar. As sondas foram desnaturadas a 96 ° C durante 5 minutos, e solução de hibridação foi aplicado em cada lâmina e incubaram-se a 75 ° C durante 1 min. Após incubação durante a noite a 37 ° C numa câmara húmida, as lâminas foram lavadas com SSC 0,4 × e 0,3% de NP40 durante 2 min a 75 ° C, secos ao ar na escuridão, contrastadas com DAPI, e uma lamela foi aplicado.

Tissue Microarray (TMA) e imuno-histoquímica

TMA foram construídos em colaboração com a Unidade de imunocoloração no Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas (Madrid, Espanha) de acordo com métodos estabelecidos [23] usando um tecido Arrayer ( Beecher Instruments, Gene Technologies Micro-array, Silver Spring, MD). A imunocoloração foi realizada usando o método de avidina-biotina-peroxidase (kit LSAB; DAKO, Glostrup, Dinamarca) como descrito anteriormente [24]. Os anticorpos usados ​​para a imunocoloração foram selecionados de acordo com trabalhos publicados anteriormente [25] – [29]. Anti-pS473 (# 9277), anti-AKT1 (# 2938), anti-AKT2 (# 4057), anti-PIK3CA (# 4249), anti-PTEN (# 9559) eram todos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA).

O anti-anti-Akt1 e Akt2 foram mostrados para ser anticorpos específicos da isoforma em trabalho anterior [25]. Além disso, utilizando células NCI-H460 interferiram para Akt1 ou Akt2, respectivamente, confirmou-se que o anticorpo anti-Akt1 reconhece apenas a isoforma Akt1 e o anticorpo anti-Akt2 reconhece apenas a isoforma Akt2 (Figura S1A).

a pontuação imuno-histoquímica de pAKT e PTEN utilizado neste trabalho foi seleccionada com base nos critérios amplamente estabelecidos existentes na literatura [28], [30], [31]: pAKT foi classificada como positiva quando 10% de As células tumorais foram positivas com forte imunopositividade ou difusa. expressão de PTEN foi classificado como (+) coloração quando foi detectado em 50% das células, (+/-) quando A coloração foi detectada em 25-50% das células e (-) quando a coloração foi detectado em 0-25% de células. Para a análise estatística expressão de PTEN foi considerada perdida quando amostras foram classificadas como (-).

Critérios

Também para os escores imunocoramento AKT1, AKT2 e PIK3CA, nós selecionados descritos em relatórios anteriores [27], [28], [32]. tumor espécimes foram divididos em quatro grupos de acordo com a percentagem de células positivas: (-) composta amostras completamente negativos; (+) Composta amostras com até 10% de células positivas; (++) Amostras compostas com 11-50% de células positivas; e (+++) composta amostras com 50% de células positivas, respectivamente. Por razões estatísticas, os tumores foram classificados em um grupo de baixa expressão compreendendo (-) e (+) e um grupo alta expressão que compreende (++) e (+++)

Para cada um imuno-histoquímica em torno de um. controlo negativo foi incluído, através da substituição do anticorpo primário com solvente com o mesmo volume de que, com o anticorpo primário ressuspensas na mesma. Todos os controles deu resultados satisfatórios. cortes corados TMA foram avaliados por dois patologistas de especialistas (RF, GB), utilizando critérios uniformes. Discrepâncias foram resolvidas por meio de inspeção e discussão dos resultados simultânea. Discrepâncias entre dois núcleos de um mesmo caso foram resolvidas através de uma análise conjunta dos dois núcleos.

Fluorescência Hibridização In Situ (FISH)

análise de FISH foi realizada em TMA. clones BAC foram projetados de acordo com o banco de dados Ensembl (www.ensembl.org). clones BAC abrangendo o gene AKT1 foram RP11-982M15, RP11-477I4 e RP11-556J09. sondas de controle BAC abrangendo a região cromossômica 14q11 foi RP11-324B11. clones BAC abrangendo o gene AKT2 foram RP11-36B02, RP11-688J23, RP11-725P04. sondas de controle BAC abrangendo 19p13.1 região cromossômica foram RP11-737I1, RP11-520G3. clones BAC abrangendo o gene PIK3CA foram RP11-360P21 e RP11-245C23. sondas de controle BAC abrangendo a região cromossomo 3p14.1 foram RP11-175F9 e RP11-15B21. Todos os clones BAC foram marcadas com dUTP-Sprectrum laranja (Vysis Inc., Downers Grove, IL; EUA). Todas as sondas de controlo foram marcadas com dUTP-Sprectrum Green (Vysis Inc., Downers Grove, IL; EUA).

Dois investigadores diferentes que não tinham conhecimento prévio dos resultados genéticos, clínicos e IHC avaliadas análise FISH. Todos os peixes foram marcados em uma média de 130 (60-210) núcleos.

Para a avaliação do número de cópias dos genes que codificam AKT1, AKT2 e PIK3CA, uma relação gene-to-Controle de 1,0 foi classificada como dissomia ; relações entre 1.0 e 2.0 foram considerados genes ganhos de baixo nível; rácios de 2,0 foram considerados como de alta polissomia e /ou amplificação do gene [33], [34]

Assim, os tumores foram divididos em diferentes classes: dissomia, trissomia (3 cópias de cromossomos em 40%. de células), baixo polissomia (≥ 3 cópias de cromossomos em 40% das células), alta polissomia (≥4 cópias de cromossomos em ≥40% das células), e amplificação do gene (presença de agrupamentos de genes com uma proporção de gene -para-cromossomo de ≥2 por célula em ≥40% de células ou presença de pequenas ou nonenumerable aglomerados de o sinal de genes). Isto permitiu que a classificação dos pacientes em dois grupos: FISH-negativo (dissomia e ganhos) e

PCR, RT-PCR e

análise de mutação FISH-positiva (alta polissomia e /ou amplificação do gene)

O ARN total e o ADN genómico foi preparado como descrito [35], [36]. Q-RT-PCR e Q-PCR foram realizadas utilizando a mistura de alimentação de SYBR Green PCR master num ABI Prism 7300 termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os cDNAs foram sintetizados a partir de 1 ug de ARN total utilizando QuantiTect reversa Trascription (Qiagen, The Netherlands, Venlo). A normalização foi realizada para o conteúdo de ARNm de GAPDH. As quantidades relativas de ARNm ou de ADN foram calculados pelo método comparativo limiar de ciclo (CT) por Livak e Schmittgen [37]. análise de mutação para PIK3CA usando LightCycler foi realizada com DNA Mestre /sondas de hibridação kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha). A sequenciação directa foi realizada utilizando o kit BigDye v3.03 ciclo de sequenciação (Applied Biosystems) em um capilar sequenciador automático (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer; Applied Biosystems). Protocolos e primers para Q-PCR, Q-RT-PCR e sequenciamento KRAS (exons 2 e 3) e PIK3CA (exons 9 e 20) são relatados no Apêndice S1.

Os anticorpos e Western Blot

análise Western blot foi efectuada através de métodos padrão [38]. Os extractos celulares totais foram preparados por homogeneização de células em NP-40 tampão de lise (Tris-HCl a 10 (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de NP-40) contendo inibidores de protease. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação e as proteínas foram separadas por SDS-PAGE. Os anticorpos usados ​​foram de Cell Signaling Technology: anti-AKT1 (# 2938); anti-S473 (# 9277), anti-PIK3CA (# 4249).

As linhas celulares

NCI-H460 foi adquirida da ATCC-LGC Promochem (South West London, UK) e mantidos em RPMI1640 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 100 U /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). células BEAS-2B foram adquiridos da Cambrex (Milão, Itália) e criadas, tal como sugerido pelo fabricante [39].

geração de vírus e a infecção no

Para gerar p110α codificação lentivírus, o ADNc que codifica humano p110α (Addgene, Cambridge, MA, EUA) foi clonado no vector de pENTR1A (Invitrogen) e recombinados em pLenti6.2 /C-Lumio ™ /V5-DEST Vector, fazendo uso da tecnologia de gateway (Invitrogen). plenti vector foi usado para gerar partículas de lentivírus em células HEK293T de embalagem, tal como descrito [40]. células transduzidas BEAS-2B foram submetidos a três ciclos de infecção, tendo sido seleccionados em meio contendo 5 ug /ml de blasticidina (Invitrogen). O PIK3CA Humano (NM_006218), AKT1 (NM_005163) e AKT2 (NM_001626) MISSÃO shRNA set (Sigma-Aldrich, St.Luis, MO) e os vírus de transdução de controle não-alvo Mission (SHC002V) foram usadas para gerar partículas lentivirais em HEK293T células de embalagens [40]. Após a transfecção, os sobrenadantes foram recolhidos a intervalos de 8 horas, filtrou-se e usado para três rondas de transdução de células NCI-H460 na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma).

In Vitro Ensaio de Proliferação

a proliferação das células foi testada por MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio; ] Redução Sigma. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano (suspensões de células a 200 ul, 2 x 10

3 /cavidade para NCI-H460) e incubaram-se com substrato de MTT (5 mg /ml) durante 4 h. A cada 24 horas, o meio de cultura foi removido e foi adicionado 2-propanol anidro. A densidade óptica foi medida a 570 nm.

ensaios tumorigénico

As células (1 x 10

6) foram suspensos em 100 ml de FBS a 10% e 100 ml de Matrigel (BD Biosciences, NJ , EUA) e injectado por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus atimicos de 6 semanas de idade (Charles River, Alemanha Ocidental) em triplicado. Cada tamanho do tumor 7 dias foi medida com um paquímetro.

análise de RNA profiling

A concentração de RNA foi determinada com um espectrofotômetro Nanodrop (NanoDrop, Wilmington, Delaware, EUA) e sua qualidade foi avaliada com um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Milano, Itália). Para cada amostra, 500 ng de ARN total foram sintetizados para cRNA biotinilado utilizando o kit de amplificação de ARN Ilumina (Ambion, Inc., Austin, TX). A síntese foi realizada de acordo com as instruções dos fabricantes. ARNc concentração e a qualidade foi avaliada tal como descrito acima. De cada amostra, foram produzidos repetições técnicos e 750 ng de ARNc foram hibridizados durante 18 horas a BeadChips expressão humana HT-12_V3_0_R1 (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. fichas hibridados foram lavadas e coradas com estreptavidina conjugada com Cy3 (GE Healthcare Milano, Itália). BeadChips foram secos e digitalizados com um BeadArray Leitor Illumina (Illumina Inc.)

Microarrays análise de dados:. RNA profiling, caracterização ‘genes, as vias enriquecidos e redes bibliográficas descoberta

arquivos de Expressão foram normalizados e analisados ​​usando GeneSpring 10,1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Diferencialmente expressos (degs) genes entre células BEAS-PI3K-CA BEAS-2B e foram seleccionados com base na mudança da dobra (a relação entre os níveis de expressão nas duas condições) e a significância estatística. Nós filtrado as listas usando dobra mudar 1.5 e T-teste (

p

-valor (0,01) como limiar. A lista degs (composta por 2126 de sondas) foi utilizado para avaliar o comportamento funcional em termos de processos biológicos e . Função molecular, Função Desenvolvimento e termos doença e Transtorno o grau de enriquecimento foi estatisticamente avaliada para determinar se um nível observado de anotação para um grupo de genes é significativo, em particular, para cada prazo, um

q

. – valor foi calculado pelo teste Hypergeometric (

p

≤0.05) e corrigidos usando False Taxa Discovery (FDR) [41]. os termos com um

q

-valor superior ao limiar de significância foram então selecionado como representativo. análise Caminho e rede foram realizadas utilizando Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems).

o conjunto de dados foi extraído de vias significativas com a biblioteca IPA das vias canônicas, e as redes foram gerados usando IPA como representação gráfica das relações moleculares entre os genes e produtos de genes. O significado da associação entre a lista de degs ea Canonical Pathway foi medida usando o teste exato de Fisher para calcular um

p

-valor (

p

≤0.05). resultados do teste exato de Fisher, também foram corrigidos para testes múltiplos usando FDR.

Em redes, genes ou produtos de genes são representadas como nós, e a relação biológica entre dois nós é representado como uma aresta (linha). Todos os bordos são suportadas por, pelo menos, uma referência a partir da literatura, a partir de um livro de texto, ou a partir da informação armazenada no canónica IPA Base de Conhecimento. Humana, de ratinho, de rato e ortólogos de um gene são armazenados como objectos separados, mas está representado como um único nó na rede. O algoritmo do edifício rede determina uma pontuação estatística para cada rede. Isto é feito através da comparação do número de genes de focagem que contribuem para uma rede de dados em relação ao número total de ocorrências de tais genes em todas as redes ou vias armazenados no IPA Base de Conhecimento. A intensidade de genes (nó) cor nas redes indica o grau de regulação negativa (verde) ou a regulação positiva (vermelho) da expressão do gene. Nodes são exibidos usando várias formas que representam a classe funcional de produtos de genes.

Resultados

activação AKT no CPNPC

Como uma leitura de PI3K sinalização /AKT em NSCLC determinou-se o estado de fosforilação do resíduo de AKT1 S473 (pAKT). pAKT foi avaliada em TMA contendo biópsias duplicados de 107 CPNPC. Como controlos foram usadas 45 amostras normais correspondentes. características clínico-patológico dos pacientes estão descritos em Materiais e Métodos e resumidas nas Tabelas S1, S2 e S3. Os resultados obtidos a partir da coloração pAKT em NSCLC encontram-se resumidos na Tabela 1. pAKT coloração foi quase não detectável nas células epiteliais a partir de epitélio alveolar normal e das vias aéreas superiores (39 em 45 amostras) (Ver Figura S1). Em contraste, a activação AKT foi observada em 60 dos 97 do NSCLC analisadas (Tabela 1). pAKT coloração positiva foi significativamente mais elevada nas amostras de carcinoma do que qualquer alveolar normal ou epitélio brônquico (P teste do Qui quadrado; 0,001). pAKT coloração foi observada em 23/37 e 30/44 CCEs ADCs (Figura 1A e B, respectivamente). Encontramos uma associação significativa entre a coloração pAKT eo grau ou o estágio da doença (Tabela 2): coloração pAKT foi significativamente mais representada em pacientes com graus G3-G4 em comparação com pacientes com graus G1-G2 (p 0,05) e em pacientes com estágio TNM III em comparação com pacientes com doença em estágio II (p 0,05). Ver tabelas S4 e S5 para a distribuição dos pacientes em CCEs e ADCs. Estes resultados demonstram que, de acordo com o trabalho em outras populações, em italiano NSCLC activação pacientes AKT ocorre no tecido tumoral e correlaciona-se com um estágio mais avançado da doença [20] – [22]. Ver também Quadro S9 e S10 para um paciente-a-paciente, lista detalhada, de positividade pAKT

A, à esquerda:. SCC negativo para pAKT fosforilação; direita: SCC positivo para pS473 fosforilação. B, para a esquerda: ADC negativo para pAKT fosforilação; direita: ADC positivo para pS473 fosforilação. Ampliação 10 × e 40 ×, respectivamente

mecanismos de ativação da AKT no CPNPC:. Imunohistoquímica

Para investigar os mecanismos moleculares que levam à ativação de AKT em pacientes italianos afectados por NSCLC foi realizada uma análise abrangente da expressão e /ou o status genético de AKT1 e AKT2 e seus reguladores mais próximos (KRAS, PIK3CA e PTEN). Dos 107 casos presentes no TMA 96 poderiam ser devidamente analisados ​​para AKT1, 83 para AKT2, 104 para PTEN e 92 para PIK3CA.

Veja Materiais e Métodos para os critérios de avaliação utilizados para AKT1. Resumidamente, as amostras definido (-) foram completamente negativos para AKT1; amostras definidas (+) continha até 10% de células positivas; amostras definida (++) composta 11-50% de células positivas; amostras definidas (+++) compreendida 50% de células positivas, respectivamente. Figura S2 mostra colorações representativos de (+), (++) ou (+++) expressão AKT1 em CCEs e ADCs. Os tumores foram classificados em um grupo baixa expressão que compreende (-) e (+) e um grupo de expressão elevada que compreende: (++) e (+++). Análise de TMA 258,1 e 258,2 mostrou que AKT1 foi sobre-expresso em 17/96 casos de NSCLC (~19%) (Figura 2), com CCEs e ADCs que mostra resultados similares: tumores positivos 7/37 AKT1 foram SCCs (19%) e 7/44 tumores positivos foram AKT1 ADCs (16%). Ver Figura 2A e B, respectivamente. . Nove em cada 15 (60%) CPNPC superexpressão AKT1 mostrou activação AKT (Tabela 3)

A, à esquerda: SCC negativo para a expressão AKT1; direita: SCC positivo para a expressão AKT1. B, para a esquerda: ADC negativo para a expressão AKT1; direita: ADC positivo para a expressão AKT1. Ampliação 10 × e 40 ×, respectivamente. C. fluorescência de duas cores hibridização in situ de número de cópias do gene AKT1. análise FISH de AKT1 (sinais vermelhos) e centrómero do cromossoma 14 (sinais verdes). Esquerda, NSCLC amostra com células diplóides; direito, amostra NSCLC com vários pontos agrupados de sinais vermelhos de AKT1 com 2 sinais centrômero (amplificação de genes). ampliação original de 100 ×.

Em seguida, analisamos a expressão de AKT2 no CPNPC. Ver Materiais e Métodos para a avaliação da coloração AKT2. Amostras definido (-) eram completamente negativo para AKT2; amostras definido (+) foram com até 10% de células positivas; amostras definida (++) composta 11-50% de células positivas; e amostras definido (+++) compreendida 50% de células positivas, respectivamente. Figura S3 mostra colorações representativos de (+), (++) ou (+++) AKT2 expressão em CCEs e ADCs. Os tumores foram classificados em um grupo baixa expressão que compreende (-) e (+) e um grupo de expressão elevada que compreende: (++) e (+++). AKT2 foi sobre-expresso em 18/83 CPNPC (± 22%) (Figura 3). Na diferença com AKT1, AKT2 superexpressão foi observada mais freqüentemente em CCEs (10/31 CCEs, 32%; 4/33 ADCs, 12%). Ver a Figura 3A e B, respectivamente. Além disso, os tumores positivos mais Akt2 (12/17, 71%) mostraram ativação de AKT (Tabela 3)

A, à esquerda:. SCC negativo para a expressão AKT2; direita: SCC positivo para a expressão AKT2. B, para a esquerda: ADC negativo para a expressão AKT2; direita: ADC positivo para a expressão AKT2. Ampliação 10 × e 40 ×, respectivamente. C. fluorescência de duas cores hibridização in situ de número de cópias do gene AKT2. análise FISH de AKT2 (sinais vermelhos) e 19p13.1 região cromossômica (sinais verdes). Esquerda, NSCLC amostra com células diplóides; direito, amostra NSCLC com vários pontos agrupados de sinais vermelhos de AKT2 com sinais região 19p13.1 2 cromossómicas (amplificação de genes). ampliação original 100 ×

Os pacientes acumulados para este estudo já havia sido caracterizada para a expressão de PTEN [38]:. perda completa ocorreu em 41 de 104 (39%) CPNPC e infra-regulação parcial foi observada em 41 casos adicionais. perda de PTEN foi mais frequentemente observada em CECs (22/40, 55%) do que no ADCs (14/51, 27%) (ver figura S5). No entanto, quando correlacionados com a activação AKT, a perda ou a redução dos níveis de proteína PTEN não foi associada com a activação AKT (n = 95; p = 0,832). (Tabela 3)

Finalmente, analisou-se a expressão da subunidade catalítica de PI3K, p110α. Os critérios de avaliação são relatados em Materiais e Métodos. Amostras definido (-) eram completamente negativo para p110α; amostras definido (+) continha até 10% de células positivas p110α; amostras definida (++) composta 11-50% de células positivas p110α; e amostras definidas (+++) compreendida 50% de células positivas p110α. A figura S4 mostra colorações representativos de (+), (++) ou (+++) expressão AKT1 em CCEs e ADCs. Os tumores foram classificados em um grupo baixa expressão que compreende (-) e (+) e um grupo de expressão elevada que compreende: (++) e (+++). Observamos superexpressão p110α em ~29% dos CPNPC (27/92): 12 dos 34 eram CCEs (35%) e 12 de 43 foram ADCs (28%) (Figura 4A e 4B). Na diferença com outros genes dentro do caminho que foram analisados, verificou-se que CPNPC com p110α apresentado AKT overexpressed significativamente activado (18 em 26; p = 0,02) (Tabela 3)

A, à esquerda:. SCC negativo para a expressão PIK3CA; direita: SCC positivo para a expressão PIK3CA. B, para a esquerda: ADC negativo para a expressão PIK3CA; direita: ADC positivo para a expressão PI3KCA. Ampliação 10 × e 40 ×, respectivamente. C. fluorescência de duas cores em análise de hibridação in situ do gene PIK3CA número de cópias. análise FISH de PIK3CA (sinais vermelhos) e 3p14.1 região cromossômica (sinais verdes). Esquerda, NSCLC amostra com células diplóides; direito, amostra NSCLC com vários pontos agrupados de sinais vermelhos de PIK3CA com 2 cromossomo região 3p14.1 sinais (amplificação de genes). ampliação original de 100 ×.

Notavelmente, a partir da análise integrada da TMAs descobrimos que a activação AKT foi mais frequentemente observada em tumores que mostram a expressão aberrante de mais do que um único gene no interior da via PI3K (perda de PTEN , ou a sobre-expressão de AKT1, AKT2, p110α respectivamente). De facto, a activação AKT foi detectada em 15-64% dos tumores que mostram aberrações em um único gene, 44-89% dos tumores com expressão aberrante de dois genes, 67-100% dos tumores com expressão aberrante de três genes e 100% de tumores com expressão aberrante de todos os quatro genes. Por outro lado, a expressão aberrante dos membros da via PI3K era menos comum em tumores que mostram nenhuma ativação da sinalização AKT (ver Tabela 4)

Mecanismos de superexpressão da proteína:. Análise FISH

FISH a análise foi realizada no CPNPC para AKT1, AKT2 e PIK3CA para determinar os mecanismos moleculares da sobre-expressão das proteínas correspondentes. Ver Materiais e Métodos para a classificação de tumores por FISH. Encontrámos NSCLC 20/82 (24%) com o ganho de número de cópia do gene no cromossoma 14 AKT1, dos quais 16 eram polissomia alta ( 4 cópias) e 4 amplificação focal (SCC-11, SCC-12, SCC-14 e SCC-21) (Figura 2C). Expectedly, vários CPNPC FISH-positiva AKT1 (12 dos 20 casos, 60%) mostraram expressão AKT1 moderada ou alta. Ver tabelas S9 e S10 para uma lista detalhada de alterações genéticas detectadas em pacientes SCC e ADC individuais. No caso de AKT2, observou-se 24/73 CPNPC (31%) com o ganho de número de cópia do gene no cromossoma 19, dos quais 23 pacientes tiveram alta polissomia e 1 paciente apresentou amplificação focal (SCC-11). Veja a Figura 3C para um exemplo representativo. No entanto, o significado da amplificação AKT2 no câncer de pulmão permanece incerta, uma vez 13/24 (54%) casos de tumores FISH-positiva Akt2 não mostram aumento da expressão da proteína correspondente.

análise FISH com cromossomo 3q26. 32 sondas revelou a presença de um aumento no número de cópias do gene PIK3CA em 19 casos (~26%), todos os quais apresentavam alta polissomia, com 7 casos que mostra também a amplificação focal (ADC-5, SCC-4, SCC-14, SCC-16, SCC-19, SCC-30, SCC-34) (Figura 4C). A maioria dos CPNPC com maior número de cópias de PIK3CA (13 dos 19 casos, 68%) mostraram expressão moderada ou alta de p110α.

No entanto, nem todos os CPNPC FISH-positiva resultou na ativação da sinalização AKT. Como mostrado nas Tabelas S6, S7 e S8, 11/18, 10/19 e 14/23 casos que foram FISH-positiva para PIK3CA, AKT1 e AKT2 resultou positivo para pAKT, respectivamente.

mecanismos de ativação da AKT : análise de mutações de PIK3CA e KRAS

Os pacientes acumulados para este estudo já havia sido analisada para mutações AKT1 [24]. Paciente SCC-29 apresentou uma mutação somática no gene que codifica AKT1 resultante num ácido glutâmico a substituição da lisina no aminoácido 17 (E17K) [24]. O tumor deste paciente mostraram aumento da expressão de AKT e atividade. Da mesma forma, as mutações missense em PIK3CA têm sido raramente relatada [42] – [45]. Encontrámos uma substituição GAG1633 → AAG que leva à E545K alteração de aminoácido em um SCC (SCC-6) (Figura 5A e B). Inversamente, 7 CPNPC mostrou mutações no KRAS: G12a (GGT GCT →) (n = 1); G12C (GGT TGT →) (n = 4); G12V (GGT GTT →) (n = 1); G13C (GGC TGC →) (n = 1) (Figura 5C). KRAS mutações foram detectadas principalmente na ADCs (6 de 32; 19%), como descrito [46], [47]. Cinco dos 7 dos casos com mutações no KRAS mostraram ativação AKT significativa (Figura 5D).

A. detecção de mutações nos exons 9 e 20 de PIK3CA de NSCLC.