Abstract

O câncer de pâncreas é uma neoplasia humana devastadora e ganho de mutações funcionais no

K-ras

oncogene é observada em 75% -90% dos pacientes. Estudos têm demonstrado que em>

não só é capaz de promover o crescimento celular ou a sobrevivência, mas também a apoptose, dependendo das circunstâncias. Utilizando linhas de células de cancro pancreático com ou sem expressar mutado

K-ras

, foi demonstrado que a inibição da actividade de PKC endógena sensibilizados células de cancro pancreático humano (MIA e PANC-1) que expressa mutado

K-ras

a apoptose, que não teve nenhum efeito na apoptose BxPC-3 de cancro pancreático células que contêm um Ras normal, bem como epiteliais do pulmão humano de células BAES-2B. Neste processo apoptótico, o nível de ROS foi aumentada e PUMA foi regulada de uma forma dependente de p73 em células MIA e PANC-1. Subsequentemente, a caspase-3 foi clivado. A indução de apoptose total necessária a activação de ambos ROS- e vias mediadas por p73. Os dados sugerem que PKC é um fator crucial que lida com aberrante

K-ras

para manter a homeostase das células de câncer de pâncreas abrigar mutantes

K-ras

. No entanto, a supressão ou a perda de PKC perturba o equilíbrio e inicia uma crise apoptose, no qual ROS e p73 aparecer o potencial, os principais alvos

Citation:. Shen L, Kim SH, Chen CY (2012) Sensibilização de As células do cancro do pâncreas humano Harboring Mutante

K-ras

à apoptose. PLoS ONE 7 (7): e40435. doi: 10.1371 /journal.pone.0040435

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Março, 2012; Aceito: 06 de junho de 2012; Publicação: 25 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi em parte apoiada por uma JCRT interna (Centro Conjunto de radioterapia, Harvard Medical School) e Instituto Nacional de Saúde 1RO1CA100498 atribuído a Chang Yan Chen. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análises, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas é uma doença com uma perspectiva sombria. Nos Estados Unidos, aproximadamente 33.000 pacientes são diagnosticados com câncer pancreático cada ano e um número quase igual morrerão desta doença maligna [1] – [3]. Mundialmente, o câncer de pâncreas faz com que um número significativo de mortes anualmente. Várias características desta doença devastadora são responsáveis ​​pela alta taxa de mortalidade, devido à dificuldade de detectar lesões precursoras ou perceber os sintomas até nas fases avançadas. O cancro muitas vezes sofre micro-metástases, que é responsável por um mau prognóstico da doença. Além disso, o câncer de pâncreas avançado é muitas vezes resistentes à quimioterapia convencional ou radioterapia. Todos estes indicam a urgência para o desenvolvimento de novas estratégias para tratar esta doença fatal.

Genética, fatores epigenéticos e ambientais estão envolvidos na gênese e desenvolvimento de câncer pancreático [1]. A patogénese da doença é devido à acumulação de alterações genéticas e moleculares, resultando em defeitos no crescimento, a adesão e a integração dos pâncreas. As alterações moleculares neste malignidade humana têm sido mostrados para incluir alterações nas moléculas relacionadas com o crescimento, supressores de tumores e reguladores do ciclo celular [4] – [7]. Distúrbios na intracelular, as vias de sinalização mitogénicas ou restrições de proliferação proporcionar uma vantagem para as células tumorais para o seu crescimento ou sobrevivência. factor de crescimento epidérmico (EGFR) família é a glicoproteína de membrana de plasma e foi demonstrado que desempenha um papel crucial na iniciação e desenvolvimento de cancro pancreático [8] – [10]. Os membros de EGFR foram relatados para ser frequentemente sobre-expressa em células de cancro do pâncreas, que accordantly activados suas vias de sinalização a jusante, tais como Ras e ERK, para promover o crescimento e sobrevivência celular [11].

Embora uma variedade de marcadores genéticos aberrantes foram identificados nas lesões de câncer de pâncreas humanos, as mutações mais frequentes foram identificados em

K-ras

, e os estreitamente seguintes eventos foram a desactivação dos supressores de tumor de p16, ARF, p53 e SMAD4 [ ,,,0],12] – [14]. K-Ras pertence à família de proteínas Ras que são pequenas proteínas de ligação ao GTP citoplasmáticos [15]. Os associados constitutivamente ativos Ras com GTP, e confere a sinalização incontrolável, Mitogênica estimulante para efectores a jusante, incluindo Raf /MAPK, PI3K /Akt, JNK /p38 e RalGDS. Um modelo de rato com câncer pancreático mostraram que a expressão condicional de um alelo oncogénico de

K-ras

foi capaz de formar lesões pré-ductal que evoluíram para o câncer invasivo e metastático em uma freqüência baixa. knockout concomitante de p14 e ARF promovido e transformado esses pré-lesões ao câncer altamente invasivo e metastático [12] – [14]. Estes resultados indicam que a activação de K-ras induz lesões pré-pancreáticas e os supressores de tumor (tais como p14 ou ARF) para restringir a conversão maligna destes precursores [12] – [14]. No entanto, ainda não foi completamente explorada se estas vias intracelulares em células de cancro do pâncreas podem ser re-direccionada para ligar programa de morte celular.

é bem conhecido que Ras pode promover não apenas a proliferação celular ou diferenciação, mas também a morte celular programada. Na apoptose mediada APO1, a ligadura com APO1 (antigénio de apoptose 1) do receptor causou a acumulação de lípidos da membrana e a activação de ceramida, os quais, por sua vez, estimulam a actividade do RAS para a indução de apoptose [16], [17]. Em linfócitos, Ras desempenhado um papel importante nos níveis de IL-2 mediada por apoptose, que assegurou volume eficaz de linfócitos [18], [19]. ativação abrupta de Ras células promovidas jusante efetoras MAP quinase via a apoptose [20], [21]. Em resposta à estimulação relacionada com o stress, de JNK pareceu funcionar a jusante de Ras e induzir a apoptose em células quando a tensão era persistente [22]. Nós relatado que oncogénica Ha-ras sensibilizados células de origem humana ou de murídeo para a apoptose quando a actividade de PKC endógena é suprimida [22]. Neste processo apoptótico, o nível de ROS foi aumentada e da cascata de caspases foi desencadeada [22]. Nosso estudo teve como objetivo testar ainda se

K-ras

mutação foi sinteticamente letal com perda de PKC em células de câncer de pâncreas.

PKC (proteína quinase C) família é composta por mais de 11 isoformas que são classificadas com base nas suas funções e estruturas bioquímicas nas clássicos (cPKCs: α, p e y, que são o éster de forbol e dependente de cálcio), novel (nPKCs: δ, ε, η e θ que são phobol dependente éster somente ) e PKC atípicos (aPKCs: Ç e X que são independentes de cálcio e éster de forbol). estímulos mitogénicos (tais como fatores de crescimento), através do aumento da membrana DAG (diacilglicerol), activar PKC. Enquanto os estudos têm demonstrado que a PKC foi envolvido em forbol respostas mitogénicas mediada por éster, é agora claro que a activação de PKC pode inibir o crescimento celular ou até mesmo desencadear a apoptose, dependendo do tipo de isoformas, acoplamento diferencial de efectores [23], [24] . Por exemplo, PKC α frequentemente medeia respostas prolif erativas ou tumorigénicas. Em células intestinais ou mamarias, as mesmas isoformas de PKC participar nas respostas anti-proliferativas. No entanto, diferentes isoformas de PKC no mesmo tipo de células pode funcionar opostamente. Em murino NIH3T3, rato R6 ou de células epiteliais do cólon humano normal, a sobre-expressão de PKC δ causou a paragem do crescimento, enquanto o aumento do nível de PKC £ iniciado processo de transformação [25] – [27]. Algumas evidências sugerem fortemente que a PKC δ frequentemente actua como um supressor de tumores [24], [28]. Estudos mostraram que a PKC não ô apenas foi um regulador negativo da progressão do ciclo celular ou mediador positivo de apoptose, mas tornou também uma elevada resistência para a promoção do tumor da pele induzida por éster de DMBA-forbol em modelos animais [29], [30].

A diafonia entre PKC e vias de sinalização de Ras foi observada [31]. Em diferentes tipos de células, PKC e Ras interagir quer numa relação paralela cooperativa linear ou hierárquica. Em resposta à estimulação mitogénica, PKC foi fosforilada em vários resíduos de serina e, subsequentemente, associados com o domínio SH2 de GRB-2. O complexo incluindo Grb-2 /SOS foi, por sua vez, formado para activar sinalização de Ras em linfócitos T [32]. A activação de PKC e de Ras em linfócitos foi, então, capaz de mobilizar PI3-cinase para gerar PIP3 e ainda causar várias cascatas de proteína-quinase, que conduz à activação de AKT e Rac para promover actividades relacionadas com o crescimento celular. Também foi relatado que, através de afetar a atividade Rel, PKC teve uma influência negativa sobre a sinalização Ras-mediada [31]. Em certas células malignas, PKC foi activado e capaz de Bcl-2 mediada por fosforilação para a promoção da sobrevivência [33], [34]. Ao bloquear as vias de sinalização pró-apoptóticos, a activação da proteína Bcl-2 de PKC induzida foi sugerido para desempenhar um papel significativo na tumorigénese pulmão. A inibição de PKC por inibidores farmacológicos em células cancerígenas do pulmão humano em cultura provocou uma resposta apoptótica [35]. Nosso estudo demonstrou que Ras preferencialmente induzida apoptose em células de câncer pancreático que abrigam um ativo

K-ras

após o bloqueio da PKC. Nossos dados sugerem que a cooperação de PKC apareceu crucial para células de câncer pancreático abrigar mutante K-Ras para sobreviver.

Resultados

Sensibilização de células do cancro do pâncreas abrigar Mutante K-ras à apoptose após o tratamento com GO6976

As funções duelo de Ras para promover o crescimento celular e a apoptose foi bem documentada [20], [22]. Anteriormente, foi demonstrado que a co-inibição de PKC e α β expressão ou actividade foi letal para as células de murino que sobre-expressam

v-ras

[22], [28]. Desde

K-ras

mutações são detectados em mais de lesões adenocarcinoma pancreático [1], isto levou-nos a examinar a susceptibilidade das células de cancro do pâncreas para apoptose em resposta ao tratamento com GO6976 (um inibidor de PKC específicos para PKC a e β). O status de expressão e activação de K-ras em diferentes linhas de células de cancro pancreático humano e células epiteliais do pulmão humano foram testados. O nível de expressão de Ras em Cancro do pâncreas humano MIA ou células PANC-1 era comparável com o que em células BEAS-2A epiteliais do pulmão e uma quantidade ligeiramente reduzida de Ras foi detectada em células de cancro pancreático BxPC-3 (Fig. 1A). Subsequentemente, os lisados ​​destas células foram precipitadas com um RBD (domínio de ligação a Ras de Raf) proteína de fusão GST para testar o estado de activação de Ras. Um Ras activado foi co-precipitada com a proteína de fusão em células MIA e PANC-1, mas não em BxPC-3 ou as células BEAS-2B (Fig. 1B). A magnitude de activação de Ras em MIA foi maior do que em células PANC-1.

. A expressão de Ras foi examinado por immunoblotting análise no câncer pancreático humano BxPC-3, MIA, PANC-1 ou epiteliais do pulmão de células BEAS-2B. As dobras dos níveis de expressão de Ras em células de cancro do pâncreas em relação ao que em células BEAS-2B foram medidos e indicados. O carregamento igual de proteínas totais por faixa foi determinada por β-actina. B. Ras GTP-obrigatório atividade foi medida nestas células por ensaio de Ras-GTP. A membrana foi re-sondado por anticorpo anti-Ras uniformemente para julgar o carregamento de proteínas totais.

Em seguida, examinámos a expressão de PKC nestas células, bem como as suas respostas a PKC activador de PMA (forbol miristato de etilo) ou GO6976 inibidor. Um nível de expressão comparável de PKC foi detectado em todas as linhas celulares (Fig. 2a). A actividade da PKC indução por PMA e efeito inibidor da actividade da PKC em GO6976 induzido por PMA também foram examinadas utilizando um kit de actividade de PKC quinase (Fig. 2B). Em MIA não tratada ou células PANC-1, actividade da PKC foi ligeiramente mais elevado do que em células BxPC-3 ou BEAS-2B não tratados. O tratamento com PMA aumentou drasticamente a actividade de cinase presente em todas as linhas de células, que foi inibida por GO6976, indicando que a PKC foi funcional em todas as células testadas.

. Os lisados ​​de células isoladas a partir de células não tratadas foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-pan-PKC.

β

-actina foi utilizada para determinar o carregamento igual de proteína total por pista. B. Os lisados ​​celulares a partir das células, com ou sem tratamento com PMA ou PMA mais GO6976, foram imunoprecipitadas com anticorpo anti-pan-PKC. Os imunocomplexos foram incubadas com [

32P] os substratos peptídicos γ-ATP e analisar a actividade de PKC. As barras de erro representadas SD de três experiências independentes (n = 3,

ρ

0,05).

PKC e Ras são os transdutores de sinal intracelular e cruciais participar na transmissão de sinais de regulam várias actividades biológicas ou pato-biológico. A indução de apoptose pela supressão da PKC foi relatado em células de murinos ou humanos expressando oncogénica

ras

[20], [22], [28]. Para testar se GO6976 foi capaz de induzir a apoptose em linhas celulares de cancro pancreático com ou sem expressar mutado

K-ras

, ensaio de anexina V foi realizada (Fig. 3A e B). tratamento GO6976 sensibilizados dramaticamente MIA e células PANC-1 a apoptose e não desempenhou qualquer papel na indução de apoptose em células BxPC-3 que contêm Ras normais de sinalização, bem como em células epiteliais de pulmão humano BEAS-2B. Notavelmente, células MIA em que a actividade de Ras foi mais elevada foram mais susceptíveis à apoptose induzida por GO6976 do que as células PANC-1. Para determinar se Ras era responsável pela indução de apoptose, foi utilizado inibidor de farnesil-transferase (FTI) para suprimir a actividade de Ras (Fig. 3C). Na presença de FTI, o tratamento GO6976 foi incapaz de induzir apoptose em células MIA ou PANC-1. Os dados sugerem que o mutante K-Ras, em conjunto com a perda da função de PKC, apareceu letal e letal esta reacção pode ser regulada por Ras mutada.

. As células foram tratadas com GO6976 (1 uM) durante 48 h e, em seguida, recolhidos para o ensaio de anexina V. As barras de erro são SD a partir de 5 experiências independentes (n = 5,

ρ

0,05). B. Os perfis das células depois de terem sido coradas com anexina V. C. As células foram tratadas com FTI durante 30 min antes do tratamento GO6976. Subsequentemente, foi realizado ensaio de anexina V. As barras de erro são SD a partir de 5 experiências independentes (n = 5,

ρ

0,05)

regulação positiva de ROS por GO6976 em células de cancro do pâncreas abrigar Mutantes K-ras para a. indução de apoptose

ROS (espécies reactivas de oxigénio) é conhecido por ser necessária para o crescimento celular e, pelo contrário, um aumento persistente na ROS foi mostrado ser capaz de causar danos no DNA ou desencadear apoptose [36]. Os estudos revelaram que as ROS nas células que expressam oncogenes (tais como o

ras

) foram muitas vezes aumentado, o que pode ser devido a elevadas necessidades metabólicas de crescimento neoplásico [36]. níveis de ROS em câncer de pâncreas e células BEAS-2B foram medidos em condições normais de crescimento ou após o tratamento com GO6976 (Fig. 4A). Uma quantidade moderada de ROS foi detectada em células MIA ou PANC, que foi dramaticamente aumentada após a adição de GO6976. ROS estava em níveis basais em células e o tratamento com o inibidor da PKC não afetou a produção ou a acumulação de ROS não tratada BxPC-3 ou BEAS-2B.

A. As células foram tratadas com GO6976 ou co-tratados com GO6976 mais NAC (2,5 mM). Depois de ter sido manchado com DCF, os níveis de ROS nas células foram analisadas por um citómetro de fluxo. B. As células foram tratadas com GO6976 (1 uM) ou GO6976 mais NAC. Subsequentemente, as amostras foram colhidas e sujeitas a ensaio de anexina V. As barras de erro são SD a partir de 5 experiências independentes (n = 5,

ρ Art 0,05).

Para determinar se ROS desempenhado um papel na indução de apoptose após a inibição PKC em células de câncer de pâncreas expressam mutante

K-ras

, ensaio de anexina V foi realizado (Fig. 4B). Mais uma vez, as células MIA e PANC-1 eram sensíveis ao tratamento GO6976, que foi parcialmente, mas significativamente bloqueada por NAC (N-acetil-L-cisteína, um inibidor de ROS). Desde NAC não suprimiu completamente a apoptose nestas células, que sugerem o envolvimento de outros caminhos na execução deste programa de morte celular. Consistentemente, as células cancerosas do pâncreas sem expressar mutado

K-ras

ou epiteliais do pulmão humano células BEAS-2B foram não-responsiva a GO6976, bem como para o tratamento de combinação de GO6976 mais NAC.

Ativação de Caspase 3 neste Reação Lethal Ocorreu em MIA ou PANC-1 células

família Caspase consiste de mais de 10 membros [37]. Em resposta a estímulos apoptóticos, foi mostrado caspase-3 funcionar como um verdugo em cascata de caspase para a realização do programa de morte celular [37]. Neste processo, a caspase-3 foi necessário para ser clivada em um pequeno fragmento, activa. Para testar o estado de activação de caspase 3, a presença da caspase 3 clivada em MIA ou células PANC-1 foi analisada por imunotransf erência (Fig. 5A). A seguir ao tratamento com GO6976, uma pequena clivada, caspase-3 foi de facto presentes nestas duas células de cancro do pâncreas. A forma activa da caspase esta não foi detectada em células BxPC-3 ou BEAS-2B-tratados GO6976 (dados não mostrados). Para examinar ainda mais a ativação de caspase 3 sob as mesmas condições experimentais, a atividade da caspase 3 foi analisada (Fig. 5B). A seguir ao tratamento com o inibidor, a actividade desta protease foi regulada positivamente em células MIA e PANC-1, que foi parcialmente suprimida por adição de NAC. Consistentemente, a actividade de caspase 3 estava ausente em células tratadas com GO6976 BxPC-3 mutado sem expressar

K-ras

ou células BEAS-2B. Os resultados sugerem que caspase 3 participado na execução da apoptose induzida por GO6976 em células de câncer de pâncreas abrigar oncogênicos

K-ras

.

A. Com ou sem tratamento GO6976, os lisados ​​celulares foram preparados e imunotransferidas com anticorpo anti-caspase 3. B. As células foram submetidas ao tratamento com GO6976 GO6976 ou mais NAC. Subsequentemente, foi realizada ensaio de anexina V. As barras de erro representam SD de 3 ensaios independentes (n = 3,

ρ Art 0,05).

A sobre-regulação da apoptose Fator PUMA em uma forma dependente da p73 Durante GO6976- a apoptose induzida

p73 pertence à família p53 e partilha homologia com p53 não apenas nas suas sequências, mas também a transactivação, as funções de ligação de ADN ou de oligomerização [38]. Na apoptose mediada por p73, o fator PUMA apoptose relacionada com foi muitas vezes regulada [38]. Nós relatado anteriormente que após a inibição PKC, p73 em fibroblastos de murino ectopicamente expressar

Ha-ras

foi ativado e responsáveis ​​para a iniciação da apoptose [28]. Durante este processo de morte celular, p73 foi fosforilado nas suas resíduos de serina [28]. Para testar se a p73 foi fosforilada in-tratada GO6976 MIA ou células PANC-1, análise de imunotransf erência foi realizada (Fig. 6A). A fosforilação de p73 foi ocorreu nos seus resíduos de serina nas células tratadas, mas não em células de controlo. A fosforilação de p73 mediada por GO6976 não alteradas pela adição de NAC. Subsequentemente, a expressão de p73-regulada

gene PUMA

em MIA ou células PANC-1 foi examinada por análise em tempo real de PCR (Fig. 6B). O nível da expressão do gene nas células foi significativamente aumentada após o tratamento com GO6976. A supra-regulação do gene foi novamente inalterado na presença de NAC, mas completamente suprimida pela infecção transiente de

shRNA-p73

. Consistentemente, a expressão da proteína foi aumentada após o tratamento com o inibidor de PKC (Fig. 6B). A introdução de

shRNA-p73

para dentro das células também bloqueada a indução de proteínas de PUMA, que não foi afectada pela adição de NAC (dados não mostrados). Verificou-se que PUMA estava envolvido no eixo de sinalização mediada por p73 neste processo apoptótico.

. Com ou sem o tratamento com GO6976 GO6976 ou mais NAC, os lisados ​​foram imunoprecipitados com anticorpo anti-p73. Os imunoprecipitados foram então sujeitas a imunotransf erência usando o anticorpo anti-serina fosforilada. O nível dos imunoprecipitados foi julgado por re-sondagem da mancha com anticorpo anti-p73. B. RNAs total das células com ou sem tratado com GO6976, GO6976 mais NAC ou GO6976 mais

shRNA-p73

infecção foram isolados. Igual quantidade de ARN foi transcrito reverso, e a expressão de

PUMA

foi testado por RT-PCR. C. Com ou sem tratamento GO6976, mia ou PNAC-1 foram submetidos a análise de imunotransferência para expressão PUMA. Carga igual de proteínas totais foram determinadas por-rep sondando a blot com o anticorpo anti-β actina.

Cooperação de ROS e p73 para a indução de GO6976 mediada por apoptose

é sabido que várias vias de sinalização, apoptóticos estão sendo integradas para uma plena execução do programa de morte celular. Desde ROS e p73 apareceu tomar parte na indução de apoptose em GO6976-trataram células de câncer pancreático que abrigam mutado

K-ras

, primeiro testamos se p73 desempenhou qualquer papel na regulação positiva de ROS nas células de câncer pancreático ( A Fig. 7A). Mais uma vez, um moderado entre de ROS foi detectada em células não tratadas ou MIA PANC-1, que foi ainda aumentada após a inibição da PKC. A infecção transitória da

shRNA-p73

não teve influência na indução de ROS, sugerindo que a p73 em nosso meio experimental não estava envolvido na sinalização ROS. Subsequentemente, a actividade da caspase-3 foi analisada após o knockdown de p73 ou co-inibição de p73 e de ROS (Fig. 7B). A introdução de

shRNA-p73

bloqueou parcialmente a actividade da caspase-3 em-GO-tratado 6,976 MIA ou PANC-1 e a actividade desta protease foi completamente abolida após a co-supressão do p73 e de ROS. A ocorrência de apoptose depois de os mesmos tratamentos foi, em seguida, analisados ​​pelo ensaio de anexina V (Fig. 7C). O knockdown de

p73

inibiu parcialmente o processo de apoptose induzida por GO6976 em MIA ou células PANC-1. Na ausência dos dois

p73

e ROS, GO6976 foi incapaz de iniciar a apoptose nestas células. Os dados sugerem que, pelo menos, duas vias apoptóticas:. P73 e ROS participou nesta reação letal

O nível de ROS nas células tratadas com GO6976 ou GO6976 mais

shRNA-p73

infecção foi analisados. As barras de erro representam o SD a partir de 3 expericias independentes (N = 3,

ρ

0,05). B. A atividade da caspase 3 nas células tratadas com GO6976, GO6976 mais

shRNA-p73

infecção ou GO6976 mais NAC mais

shRNA-p73

infecção foi ensaiada. As barras de erro representam o SD a partir de 3 expericias independentes (N = 3,

ρ

0,05). ensaio C. anexina V em MIA e PANC-1 células tratadas com GO6976, GO6976 mais

shRNA-p73

infecção ou GO6976 mais NAC mais foi realizada

infecção shRNA-p73

. As barras de erro representam SD de 3 ensaios independentes (n = 3,

ρ Art 0,05).

Discussão

O câncer de pâncreas é uma neoplasia humana devastadora e uma das principais causas de morte por câncer [1]. Prognóstico desta doença é sombrio, devido à falta de tratamentos eficazes. Sabe-se que o ganho de mutações funcionais no

K-ras

ocorrem em estágios iniciais em pacientes com câncer ou modelos de rato pancreático humano que foram gerados por nocaute de genes supressores de tumores de

p16, Arf

, ou

p53

, respectivamente, ou em combinações [12] – [14]. Estes resultados indicam a importância de K-Ras na gênese e desenvolvimento de câncer no pâncreas. O objetivo do nosso estudo foi explorar a nova estratégia de segmentação oncogénica Ras para a terapêutica pancreáticas. O presente estudo demonstrou que aberrantes, alterado de

K-ras

foi capaz de redireccionar as células de câncer de pâncreas em direção à apoptose após a supressão da PKC. Neste processo de apoptose, múltiplas vias de sinalização foram envolvidos. Após o tratamento com o inibidor de PKC, o nível de ROS nas células de cancro do pâncreas que expressam mutado

K-ras

foi aumentada, acompanhada com a indução de apoptose. No entanto, a adição de NAC bloqueou parcialmente o processo de morte celular. p73 foi fosforilada e, do gene e proteína de PUMA foram regulados positivamente. Além disso, a caspase 3 foi clivada para a execução do programa de morte celular. O co-inibição da ROS e p73 conseguido um efeito de bloqueio final sobre a apoptose em células de câncer de pâncreas tratados com GO6976 abrigar mutantes

K-ras

. Assim, nosso estudo indica que aberrante Ras, juntamente com perda de PKC é sinteticamente letal nas células de câncer pancreático. Os dados também sugeriram um equilíbrio potencial entre Ras e PKC que determina o limiar de apoptose nas células.

ativações mutacional dos

ras

genes são um dos principais eventos durante a iniciação e desenvolvimento de vários tipos de tumores malignos humanos [15]. No processo de transformação, aumentos persistentes no interruptor a actividade do RAS em várias vias efectoras a jusante, conduzindo a reacções de fosforilação da cadeia para a activação de factores de transcrição que estimulam o crescimento [39]. Apesar do envolvimento essencial no crescimento e diferenciação celular, Ras hiperactivas, em certas circunstâncias, pode ser re-direccionada para apoptose. Numerosos estudos têm destacado o papel de Ras na regulação da apoptose [20]. Em particular, observou-se que os tratamentos com os inibidores de PKC pode induzir apoptose em fibroblastos de murino ou células epiteliais do pulmão de rato que sobre-expressam oncogénica

ras

[22], [28]. Aqui, nós demonstramos que a atividade PKC nas células de câncer pancreático abrigar mutado

K-ras

foi ligeiramente aumentada, que possam ser necessárias para lidar com a actividade aberrante alta Ras para sobreviver. Depois de PKC foi suprimida, mutante K-Ras não pode manter as necessidades metabólicas elevadas das células cancerosas e a reacção foi iniciada letal. Desde percentagens elevadas de cancros humanos abrigar oncogênico

ras

, PKC aparece um alvo intracelular ideal para a indução de apoptose, com um efeito de baixa ou nenhuma tóxico em torno das células ou tecidos normais.

Mais de proteínas cinases /treonina serina 11 pertencem à família de PKC, alguns dos quais são estruturalmente distintos ou funcionalmente diversos. No entanto, existe uma redundância funcional entre estas isozimas PKC para restaurar o estado fisiológico normal quando um ou mais isoenzimas de PKC são nocauteado ou não funcional. Os papéis das isoformas da PKC na regulação do crescimento celular ou a morte são bastante controverso, dependendo de diferentes tipos de células ou contextos celulares. Por exemplo, tem sido sugerido que os papéis duelo PKC α, β, ô possuíam na regulação do desenvolvimento do cancro ou morte celular programada, indicando a complexidade destas isozimas PKC [24]. Cruzados conversações entre as isoformas de PKC e com outros transdutores de sinais intracelulares eram muitas vezes presente em uma ordem de hierarquia ou diferentes compartimentos para orientar células para alcançar resultados diferentes. Mostrou-se também que a PKC e vias de sinalização de Ras eram interligadas, especialmente nos linfócitos [24], [40]. Após estimulação mitogénica, os locais de ligação SH2 de PKC foram fosforilados, o que por sua vez, recruta o complexo de Grb2 /SOS e Ras adicional sinalização activados linfócitos T em [24]. PKC foi relatado para regular negativamente Ras caminho, através de afectar a sua efetoras Rel [24]. Em células de NIH3T3 que expressam ectopicamente

v-Ha-ras

, p73 funcionava a jusante de PKCα e β e como um sensor para determinar o limiar de apoptose [22]. Usando o GO6976 inibidor PKC que inibe as forbol isoformas PKC dependentes ésteres, que neste estudo mostraram que as células de câncer de pâncreas com hiperativo K-Ras pode ser eficientemente sensibilizados a apoptose. A investigação para identificar chave isoforma PKC (s) na regulação deste processo de apoptose está em curso.

ROS muitas vezes age como um transdutor de sinal intracelular de fatores de crescimento [36]. Alguns estímulos mitogénicos são capazes de aumentar o nível intracelular de ROS, resultando na alteração da estrutura do citoesqueleto e induzindo a transformação adicional [36]. Em células PC12, Ras foi mostrado para regular positivamente a produção de ERO após estimulação EGF [41]. Os estudos também demonstraram que oncogenes (tais como

myc

ou

ras

), por meio persistentemente perturbando o estado de redox intracelular, foram capazes de causar aberrações cromossómicas e, posteriormente, interromper integridade genética para promover tumorigênese [36 ]. Apesar regulação da proliferação e transformação das células, um aumento na ROS foi sugerido para desempenhar um papel aplicabilidade na indução de apoptose [22]. Em morte celular programada induzida por TNFa, NF-kB e de JNK cooperaram para estimular a produção de ROS, levando a cascata de caspase e a despolarização mitocondrial [42]. A expressão ectópica de

Ha-ras

em fibroblastos de murino induzida morte celular através provocando ER estresse (retículo endoplasmático) e ativando UPR (resposta proteína desdobrado) [22]. O presente estudo demonstrou que, apesar de ROS foi moderadamente elevados em células de cancro do pâncreas que expressam mutado

K-ras

sob condições de crescimento normais, a inibição da PKC severamente perturbado o equilíbrio do estado redox e induziu uma acumulação significativa de ROS no células. Assim, PKC aparece um fator importante para manter a homeostase de células de câncer pancreático que abrigam uma aberrante

K-ras

.

p73 pertence à família de proteínas p53 e, compartilha o homólogo estrutural e funcional com p53 [38]. Estudos mostraram que p73 desempenhou um papel significativo na damage- ADN ou a apoptose induzida por stress. Nuclear c-Abl foi activada por stress genotóxico e ainda p73 fosforilada para a indução de apoptose [43]. Neste processo de morte celular, nuclear c-Abl interagiu com p73 e estimulou ainda mais as actividades reguladas-P73. Mostrou-se também que, em resposta à radiação ionizante ou tratamento com cisplatina, p73 desempenhou um papel fundamental na transmissão da sinalização apoptótica [44]. Em fibroblastos de murino superexpressão

v-Ha-ras

, PKC δ interagiu com e mais ativada p73 para desencadear uma crise de apoptose [28]. Neste estudo, foi demonstrado que a p73 foi fosforilada nas células de cancro do pâncreas abrigando mutadas

K-ras

, e, subsequentemente, regulada positivamente o nível da expressão do factor de PUMA apoptótica. O mecanismo subjacente pelo qual PUMA participa neste processo de apoptose continua a ser investigado.

Em resumo, as mutações genéticas em

K-ras

aparecem exclusivamente presente em 90% das lesões cancerosas pancreáticas humanas e esta doença é uma das principais causas de morte por câncer. Assim, existe uma necessidade urgente de descobertas de tratamentos clinicamente eficazes.