Abstract
induzida por activação citidina desaminase (AID) é uma enzima necessária para a diversificação de anticorpos e que provoca mutações no DNA e rupturas dos filamentos. expressão AID constitutiva em camundongos invariavelmente causado lesões pulmonares morfologicamente semelhantes a hiperplasia adenomatosa atípica humana (AAH), que pode ser um precursor do carcinoma bronquioloalveolar. Semelhante a AAH, rato lesão AAH-like (MALL) apresentaram sinais de diferenciação alveolar, a julgar pela expressão do tipo alveolar II (AT2) marcador de células surfactante proteína C (SP-C). No entanto, microscopia eletrônica indicou que MALL, que possuía certas características de uma célula mucosa, é distinto de um AAH ou célula AT2. Embora SHOPPING desenvolvida em todos os indivíduos dentro de 30 semanas após o nascimento, os tumores pulmonares ocorreu em apenas 10%; isso sugere que a grande maioria dos shoppings não conseguem crescer em tumores visíveis. MALL expressa vários marcadores recentemente descritos de pulmão alveolar regeneração, tais como p63, queratina 5, queratina 14, repetição rica em leucina contendo receptor acoplado à proteína G 5 (Lgr5) e Lgr6. O aumento da morte celular foi observada em pulmões de ratinhos transgénicos AUXÍLIO em comparação com ratinhos de tipo selvagem. Com base nestas observações, especula-se que MALL é um tecido de regeneração compensar perda celular causada por citotoxicidade AID. expressão AID em tais tecidos regenerar deve predispor as células a transformação maligna através da sua atividade mutagênica
Citation:. Kitamura J, Uemura M, Kurozumi M, Sonobe M, Manabe T, Hiai H, et al. (2015) crônica lesão pulmonar por expressão constitutiva da ativação induzida por citidinadesaminase Leva a Focal mucosa celular metaplasia e Câncer. PLoS ONE 10 (2): e0117986. doi: 10.1371 /journal.pone.0117986
Editor do Academic: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, França |
Recebido: 18 de junho de 2014; Aceito: 04 de janeiro de 2015; Publicação: 06 de fevereiro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Kitamura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Grant-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (KAKENHI 23.390.097) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1,2], e contas de fumar por cerca de 80% dos casos de câncer de pulmão [3]. Por outro lado, as doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crónica, pneumonia infecciosa, pneumonia intersticial idiopática, e a tuberculose, os quais causam a inflamação no pulmão tecido aumento do risco de cancro do pulmão independente do uso do tabaco [4]. Com o declínio do tabagismo, a prevenção do cancro do pulmão independente de tabaco tornou-se relativamente importante [2,3]. A grande questão a ser respondida é como oncogênico mutações ocorrem no câncer de pulmão independente de tabaco.
Estudos recentes sugerem o envolvimento de desaminases citidina no desenvolvimento de cânceres do trato gastrointestinal, glândula mamária e próstata [5- 9]. desaminase de citidina induzida por activação (AID), um membro da família da citidina-desaminase, é um enzima essencial para a hipermutação somática e classe-interruptor recombinação de genes de anticorpos. Nós relatado anteriormente que AID foi expressa em vários tipos de cancros gastrointestinais e hepatobiliares que ocorrem no contexto de inflamação crônica [5-7]. a expressão transgénica de ajuda, a ratinhos provoca vários tipos de tumores, incluindo os de pulmão, fígado e estômago e leucemia [10,11]. expressão AID também foi relatada em adenocarcinoma de pulmão humano [12]. Estas observações sugerem o papel mutagênico da AID no câncer associada à inflamação.
Aproximadamente 10% dos ratinhos transgénicos SOCORROS desenvolver tumor de pulmão macroscópico no prazo de 90 semanas após o nascimento [11]. No entanto, todos os indivíduos (incluindo aqueles sem tumores pulmonares) possuem lesões pulmonares microscópicas morfologicamente semelhantes ao ser humano atípica hiperplasia adenomatosa (AAH), um precursor do carcinoma bronquioloalveolar [10,13]. Inicialmente, especulado que este rato lesão AAH-like (MALL) é uma lesão neoplásica que, eventualmente, se desenvolve em adenocarcinoma em ratinhos transgénicos AID. Começamos a analisar MALL esperando obter uma visão sobre o mecanismo de tumor pulmonar induzida pela AID em ratos e câncer de pulmão associada à inflamação em seres humanos. No entanto, nossos dados sugerem que o shopping não é uma lesão neoplásica, mas uma estrutura transitória expressar recentemente descrita marcadores de regeneração alveolar pulmonar. Neste estudo, nós exploramos as causas e características da MALL, descrever a forma como a ajuda faz com MALL e pulmão tumor em ratos, e abordar suas implicações sobre a carcinogênese de pulmão humano.
Materiais e Métodos
Mice
O uso de condicionais transgénicos ratinhos C57BL /6 possuindo uma única cópia do transgene contendo CAG promotor-driven floxed verde proteína fluorescente (GFP) sequência de codificação seguido pela AID rato sequência codificante (AID CTG) foi previamente descrito [14] . Ao atravessar este rato uma vez com um rato transgénico Cre impulsionado por tecido não-específico de fosfatase alcalina (TNAP) promotor (ratos TNAP-Cre com fundo misto de C57BL /6 e 129 /Sv após três retrocruzamentos com C57BL /6 [15]), camundongos com a supressão da linha germinativa de segmento e GFP, assim, -foram obtidos expressão AID constitutiva (Aidon). Aidon ratos C57BL /6 fundo com contribuição menor de 129 /Sv, diluída pela retrocruzar mais de seis vezes, foram utilizados. C57BL /6J foram adquiridos da Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japão). Todos os ratos foram alimentados ad libitum e foram sacrificados por deslocamento cervical para censurar, ou observado imediatamente após a morte espontânea. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal e realizada de acordo com as Diretrizes para a Experimentação Animal da Shiga Medical Center.
mutação genética análise
O tecido pulmonar foi dissecado, embebidos em composto OCT (Sakura Fineteck Japan Co., Ltd., Tóquio, Japão), e imediatamente congelados em azoto líquido. Em seguida, as secções de 10 mm de espessura foram corados com hematoxilina e eosina (HE). MALL indivíduo foi isolado por microdissecção a laser utilizando LMD 6000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha). O ADN genómico foi isolado a partir de cada centro utilizando o kit DNA QIAamp Micro (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). O
Trp53
exão 5-8,
Kras
exão 2, e
Egfr
exão 19-21 foram amplificados utilizando uma reacção em cadeia da polimerase aninhada (PCR) com os seguintes iniciadores :
Trp53
; forward 5 ‘GCG CCA TGG CCA TCT ACA A 3’, inverta 5 ‘TCT TCT GTA CGG CGG TCT CT 3’, aninhado a frente 5 ‘TGG CCA TCT ACA AGA AGT CAC 3’, e inversa aninhada 5 ‘CAG GGC AGG CAC AAA CA 3 ‘.
Kras
; forward 5 ‘CGG GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG T 3’, inverta 5 ‘AGT TGA GTT CTA GGC CGG TCA 3’, aninhado a frente 5 ‘GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG TAC T 3’, e inversa aninhada 5 ‘GTT GAG TTC TAG GCC GGT CAG G, 3 ‘.
Egfr
exon 19; forward 5 ‘CCC TTT CTG CCT TAG CAT GTC 3’, inverta 5 ‘GGC ACA TCC CTC AGT CAC TTA ACA C 3’, aninhado a frente 5 ‘CTC TTG GAT TTG TAA TGT AGA GCC 3’, e inversa aninhada 5 ‘ATT GGG TGT AAT TTA TTA GTG CAT C 3 ‘.
Egfr
exon 20; forward 5 ‘GAA GAT AGT GGC ATT TCC TAA ACT C 3’, inverta 5 ‘GCA TGA ACA CCA GGC TCG ATG 3’, aninhado a frente 5 ‘ACA TCC CAC AGT GTA TTA GCA TTT A 3’, e inversa aninhada 5 ‘CTG CTT TTC TTA GTG CTC TTA CCA 3 ‘.
Egfr
exon 21; forward 5 ‘GCC CAA GGA ACG TGA CGA AAG 3’, 5 ‘TCA AGG GTG CTA CTG AAT CCG TGG T 3’, aninhado a frente 5 ‘TTG TCA TTC ATG CCA GAT AAT TCC A 3’, e inversa aninhada 5 ‘TTA CTA CTC CCA CCG AAA TCC A 3 ‘. Os produtos de PCR foram purificados com uma mistura de exonuclease /fosfatase (ExoSap-IT, corporação USB /Affymetrix, Inc., Cleveland, OH, EUA) e sequenciados utilizando os iniciadores de PCR aninhados e o Kit de Sequenciação do Ciclo de Big Dye Terminator v1.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA). produtos de sequenciação foram tratados com o Big Dye xTerminator Kit de Purificação (Applied Biosystems) e analisados utilizando o ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
As amostras de tecido Histologia e imunohistoquímica
de ratos foram fixados em 10% (w /v) de formaldeído, embebida em parafina e coradas com HE para exame histológico. Para imuno-histoquímica, amostras de tecido foram fixadas através de HOPE fixadora (Polysciences, Inc., Warrington, PA, EUA). As amostras foram embebidas em parafina. A imuno-histoquímica foi efectuada utilizando complexo de avidina-biotina-peroxidase (ABC). anticorpo anti-AID monoclonal (MAID-2), foi descrito [16]. Outros anticorpos foram adquiridos: queratina 5 (SC-17090; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA), p63 ΔN (SC-8609; Santa Cruz Biotechnology), proteína de 10 kD de células Clara (CC-10, SC- 9772; Santa Cruz Biotechnology), caderina epitelial (E-caderina, 24E10; Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), de repetição rica em leucina contendo o receptor acoplado à proteína G 5 (Lgr5, ab75732; Abcam, Cambridge, MA, EUA) , proteína surfactante C (SP-C, SC-13976; Santa Cruz Biotechnology), Lgr6 (SC-99123; Santa Cruz Biotechnology), queratina 14 (PRB-155P; Covance, Berkeley, CA, EUA), e podoplanina (53- 5381; eBioscience, San Diego, CA, EUA). Cada seção foi contrastado com hematoxilina
Estimativa do número de shoppings no
todo pulmão
Número total de centros comerciais foi estimada da seguinte forma:. Densidade do shopping na seção (N, por cm
2) foi calculada como um valor médio de 11 secções de espessura de 4 | iM (t = 0,0004 cm) recolhidos em intervalos de 100? m. O número ea área de shopping e área da região alveolar em cada seção foram medidos nas imagens seção inteira usando scanner de ScanScope e software ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, EUA). diâmetro de MALL (D, cm) significa foi estimado em 0,005 cm. Uma massa de tecido hipotética cúbico com um lado de 1 cm pode ser cortada em secções de 1 /T. Portanto, o número total de MALL conta em todas as seções 1 /T será N /T. Um único MALL é cortada em pedaços D /T e contadas vezes D /T. Dividindo contagem total de Mall (N /T) com este factor de redundância (D /T), a densidade tridimensional de Mall pode ser expressa como N /D por cm
3. Usando os seguintes valores (N = 4,3, D = 0,005, volume pulmonar bilateral de 1,0 cm
3) para um rato 37 semanas de idade, o número total de MALL nos pulmões é calculada como N /D × volume pulmonar = 4,3 /0.005 × 1.0 = 860.
a microscopia eletrônica
para microscopia eletrônica de análises, os ratos foram perfundidos Aidon do ventrículo direito com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o sangue. Os pulmões foram em seguida perfusão fixa com uma mistura de 1,4% de paraformaldeído e 1% de glutaraldeído em PBS, e em seguida cortado em cubos com 2 mm de microscopia electrónica de transmissão e do mesmo agente de fixa-imersão usado para fixação da perfusão, a 4 ° C durante a noite . As secções foram depois pós-fixados em 1% de tetróxido de ósmio em tampão fosfato 0,1 M, durante 1,5 h. As amostras foram, então, desidratados numa série graduada de etanol, foi afastada com óxido de propileno, e encerrados em EPON. Blocos estavam no primeiro corte como cortes semifinos (1 mm) e corado com azul de toluidina para identificar Mall. Ultrafinas (60-90 nm) secções foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e examinadas usando um microscópio electrónico de transmissão, H7650 (Hitachi, Ltd., Tóquio, Japão).
A apoptose ensaio
Terminal desoxinucleotidiltransferase (TdT) mediado por dUTP nick endlabeling (TUNEL) foi realizado para detectar quebras de DNA apoptóticos nos tecidos do pulmão e do fígado usando o TACS 2 TdT-DAB In Situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, EUA ). As lâminas foram contrastadas com verde de metilo 1%. Para medir a morte de células no pulmão e no fígado, as células da parede alveolar TUNEL positivos e negativos e hepatócitos foram contadas até atingir um número total de 1000 células em 9-24 não sobrepostos, escolhidos aleatoriamente × 400 campos. As células foram contadas utilizando software de análise de imagem a partir de VH Analyzer (Keyence, Osaka, Japão). Os dados foram coletados a partir de três ratos individuais.
Proliferação ensaio
Aidon ratinhos receberam uma injecção intraperitoneal diária de 1 mg 5-etinil-2′-desoxiuridina (UDE) em 0,4 ml PBS para 7 dias. Os ratinhos foram em seguida estudados em 1 e 20 dias após a última injecção. A proliferação celular nos cortes congelados de 10 mícrons de espessura de pulmões foi detectada utilizando o kit de imagem Click-iT EdU Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR, EUA). As secções foram fixadas em 3,7% (v /v) de formaldeído, durante 10 min. Em seguida, os tecidos foram permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 20 min. O coquetel de reacção clique sobre ele EdU incluindo Alexa Fluor 488 azida foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e adicionou-se a cobrir a lâmina e incubaram-se à temperatura ambiente no escuro durante 30 min. Os núcleos foram visualizados com o corante 33342 da Hoechst. As lâminas foram examinadas sob um microscópio DM 5000B fluorescência (Leica Microsystems). células positivas Edu no pulmão foram detectados. Os dados foram coletados a partir de dois ratos em cada ponto de tempo.
cultura celular e pró-inflamatória estimulação de citocinas
As células humanas epiteliais alveolares (linha celular A549) foram adquiridos de RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japão ) e mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v) de soro v /fetal de bovino (FBS) a 37 ° C em 5% de CO
2. Uma suspensão de células de 2 ml (1 × 10
5 células /ml) foi semeada em placas de cultura de 6 poços e incubadas durante 24 h para permitir a ligação de células. As células foram tratadas com α do factor de necrose tumoral humano (TNF Peprotech, Rocky Hill, NJ, EUA), interleucina-1β (IL1β PeproTech) e a linfotoxina-α2 /β1 (LTα2 /β1, R D Systems, Inc., Minneapolis , MN, EUA), cada um a uma concentração de 50 ug /ml, ou de PBS para o controlo negativo. O ARN total foi extraído a partir destas células 24 horas após a estimulação de citoquinas.
quantitativo em tempo real transcrição reversa PCR
O ARN total foi extraído utilizando Sepasol-I de ARN Super (Nacalai Tesque, Quioto, Japão) . Em seguida, o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Nazaré, Bélgica). Então, quantitativo em tempo real transcrição reversa PCR (RT-PCR) para amplificação ajuda humana foi realizada como descrito [5].
A análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando Stata 8.2 (StataCorp , College Station, TX, EUA), exceto valor P de Student
t
teste para análise do tamanho de shopping, que foi calculado utilizando Prism software 4.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, EUA).
Resultados
características histológicas dos pulmões em ratinhos Aidon
neste estudo, foram utilizados ratos com uma única cópia expressando AID transgene (ratos Aidon). ratinhos Aidon, em contraste com os ratinhos transgénicos de auxílio anteriormente relatados conduzidos pelo mesmo promotor, mas com a integração de várias cópias [10], que não sofrem de morte precoce de linfoma de células T letal antes da idade de 1 ano, e sobreviveram por mais de 90 semanas após o nascimento. Esta característica, possivelmente devido à menor expressão do transgene AID, facilitou muito a observação do desenvolvimento do tumor fora do compartimento linfóide.
Todos os ratos Aidon idade superior a 6 meses desenvolvidos vários shoppings no pulmão região alveolar, como descrito anteriormente [ ,,,0],10] (Fig. 1). Cada Mall, que consistiu de 4-20 células cúbicas ou cilíndricas em seções, era um pedaço de epitélio simples mostrando continuidade direta com o epitélio alveolar. MALL altura era de 6-60 mm e largura foi 12-160 mm. núcleos alongados sem atipia foram localizados perto da membrana basal (Fig. 1B). Quando MALL foi seccionada por um plano paralelo à membrana basal, que apareceu como células cúbicas com núcleos rodada (Fig. 1C).
A, Uma visão geral do pulmão de um rato Tg AID. Setas e círculos abertos indicam os locais de shoppings. B, C, pontos de vista de energia mais altos de um shopping representante no pulmão de um rato Tg AID. MALL é indicado por uma seta. HE, hematoxilina e eosina; AID, induzida por ativação citidina desaminase; Tg, transgênicos; MALL, rato lesão AAH-like.
contagem MALL foi examinado pela média da densidade em 11 seções do pulmão direito em intervalos de 100 mm para ratos entre 12 e 75 semanas de idade (Fig. 2A ). MALL era mal detectável em 12 e 17 semanas de idade camundongos, mas foi detectado em 26 semanas. O número de centros comerciais aumentou com a idade. Em 37 semanas, MALL densidade de corte foi de 4,3 ± 0,8 /cm
2 (média ± erro padrão, n = 3), o que corresponde a uma estimativa de 860 shoppings nos pulmões bilaterais (ver métodos de cálculo). Entre os 64 ratos Aidon examinados, apenas 7 (11%) desenvolveram tumores pulmonares visíveis macroscopicamente (3 adenomas e adenocarcinomas 4), o que é comparável com a incidência de tumores de pulmão na linha original de ratinhos transgénicos AUXÍLIO [11]. Considerando o grande número de shoppings no pulmão idade rato, especula-se que a maioria dos shoppings não conseguem crescer como tumores macroscópicos.
A, No painel à esquerda, a densidade média dos shoppings em secções por 1 cm
2 é plotados contra os ratos idade em semanas. A linha sólida com o símbolo fechado e uma linha cinza com o símbolo aberto representam ratos Aidon e do tipo selvagem, respectivamente. As barras de erro representam os erros padrão para os dados a partir de três ratinhos, excepto para um ratinho de tipo selvagem e um 75 semanas de idade Aidon rato cada um dos quais foi analisado individualmente. Área de um retângulo pontilhado foi ampliado no painel da direita. B, a área transversal com shoppings individuais plotados. Os valores médios são indicados por linhas vermelhas. Os valores de P calculados pelo t-teste entre os grupos são indicados por colchetes.
tamanhos variados (com base na área transversal) de shoppings individuais de camundongos de diferentes idades são plotados na Fig. 2B. O tamanho médio de um centro comercial pareceu ser relativamente constante ao longo do tempo. Embora foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre 26 semanas e 37 semanas (p = 0,002), e entre 37 semanas e 75 semanas (p 0,0001), a diferença média foi pequeno e não parecem ter significado biológico. O aparecimento ocasional de grandes centros comerciais em camundongos 75 semanas de idade pode indicar que um número limitado de centros comerciais continuam a crescer, tornando-se os tumores visíveis na inspeção bruta.
Lung gene análise de mutação relacionada ao câncer em shoppings
AAH Humano supostamente abriga frequências significativamente elevados de mutações em genes relacionados com o cancro do pulmão de três:
Trp53
,
Kras
, e
Egfr
[17-23] . Para examinar se shopping tem mutações comparáveis aos AAH, mutações foram analisadas nas regiões do hotspot dos três genes:
Trp53
exons 5-8,
Kras
exão 2 e
Egfr
exões 19-21. Nós microdissectados 110 shoppings, a partir do qual DNA foi purificado individualmente e submetidos a PCR específica do gene e sequenciação directa. Enquanto quatro (10,5%) em 38 shoppings mostrou cinco mutações missense no
Trp53
gene, nenhuma mutação missense do
Kras
ou
gene Egfr
foi encontrado. A frequência de mutação do
Trp53
gene foi comparável com os dados previamente publicados sobre AAH humana no pulmão [17,18], mas
Kras
e
Egfr
mutações eram muito menos do que em AAH humano [19-23] (Tabela 1). Quatro dos cinco missense
Trp53
mutações estão previstas para comprometer a função da proteína, embora não esteja claro se estas mutações deletérias desempenhou alguns papéis no desenvolvimento de centros comerciais (S1A e B Fig.).
os números entre parênteses indicam o número de shoppings com a mutação do gene versus o número de shoppings examinados.
Incluindo mutações intrônicas, 14, 3 e 0 substituições de base única foram encontrados em
Trp53
,
Kras
e
gene Egfr
, respectivamente. Os padrões de substituição de citosina (C) -para-timina (T) e guanina (G) -para-adenina (A) muda típica de citidina deamination não foram predominantes em
Trp53
gene (14% [2 /14], S1C Fig.). Em ambos os casos, mutado Cs foram 5′-precedidos por L, o que foi consistente com o assinatura auxílio [24]. Como mostrado na Fig S1D., 2 de 3 substituições visto em
gene KRAS
foram mudança C-para-T num contexto de dinucleótido 5′-C precedido por T, que é um alvo preferencial de APOBEC3 desaminação [25]. No entanto, pequeno número de mutações observadas em shoppings se opõe a inferência de processo mutacional.
Imuno-histoquímica para marcadores de células epiteliais das vias aéreas
Para caracterizar o estado de diferenciação de MALL, foi realizada imuno-histoquímica por três marcadores específicos a três tipos de células epiteliais das vias aéreas distais: podoplanina em células alveolares tipo 1 (AT1), SP-C em células alveolares tipo 2 (AT2), e CC-10 em células de Clara. MALLS foram parcialmente positiva para SP-C, mas negativa para CC-10 e podoplanina (Fig. 3A-C). Esta descoberta sugere que as células AT2 pode estar presente no Mall.
A, CC-10, marcador de células Clara e B, podoplanina, tipo alveolar marcador de células I foram negativos. C, SP-C, alveolar marcador de células do tipo II foi parcialmente positiva em células Mall. D, p63 ΔN; E, queratina 5; F, keratin14; G, E-caderina; H, Lgr5; e eu, Lgr6 foram todos positivos em shoppings. sinal de Brown indica coloração positiva por diaminobenzidina e sinal azul indica contador de coloração nuclear pela hematoxilina. MALL é indicado por uma seta. CC-10, proteína de 10 kD de células Clara; SP-C, surfactante de proteína C; E-caderina, caderina epitelial; LGR, repita rica em leucina contendo receptores acoplados à proteína G.
A natureza dormente de shopping e a escassez de mutações em genes relacionados com o cancro do pulmão nos levou a especular que MALL pode ser uma lesão regenerativa vez do que um neoplasma no início. Recentemente, foram relatados marcadores de regeneração de células das vias aéreas distais. Num modelo de rato de regeneração do pulmão são visualizadas após infecção pelo vírus da gripe H1N1, p63, queratina 5, queratina 14 e são expressos em células alveolares de regeneração [26]. Em outro estudo utilizando células derivadas de pulmão humano, células que expressam caderina-E, Lgr5 e Lgr6 possuía uma capacidade de células-tronco como de auto-renovação e diferenciação broncoalveolar [27]. A imuno-histoquímica revelou também que expressa SHOPPING ΔNp63, queratina 5, queratina 14, E-caderina, Lgr5, e Lgr6 (Fig. 3D-I), indicando, assim, que SHOPPING retém uma assinatura do tecido alveolar regenerativa.
Electron microscópica achados
Para examinar ainda mais as características Mall, foram avaliados os pulmões de camundongos Aidon via microscopia eletrônica de transmissão. SHOPPING consistiu de uma monocamada de células de uma membrana basal. As células foram colunar com núcleos alongada (Fig. 4A). Curiosamente, todas as células continham vesículas secretoras imaturas na porção apical do citoplasma sem corpos lamelares (Fig. 4B). Estas vesículas foram positivas para a coloração de PAS, indicando a presença de mucina (fig. 4C). Estes resultados indicam que as células Mall estão, de fato, células mucosas imaturos. Como AAH humano contém corpos lamelares [28], a estrutura MALL é distinta da AAH, nomenclatura inicial, não obstante
Electron achados microscópicos de MALL:. A, Visão de células Mall. B, visualização ampliada da parte apical das células Mall. As setas indicam vesículas secretoras imaturas no citoplasma das células Mall. Um asterisco indica uma célula basal adjacente às células Mall. C, coloração PAS demonstra que os materiais são marcadas positivamente no ápice das células Mall (setas). D, micrografia eletrônica mostrando uma célula epitelial fagocitária dentro MALL (asterisco). Inset, maior vista de energia da célula epitelial fagocítica. As setas indicam a membrana basal. As setas indicam os organismos residuais dentro da célula. AS, espaço alveolar; PAS, ácido periódico de Schiff.
Além disso, foram detectadas células semelhantes a células basais, que normalmente não são vistos no pulmão distal do mouse [29], no lado basal de células MALL (Fig. 4A). forte expressão da queratina 5 e 14 sugere que MALL originado a partir desta célula a célula-como basal. Além disso, ocasionalmente encontrada células fagocíticas dentro de shoppings (Fig. 4D). Estas células tiveram contacto directo com a membrana basal e organismos residuais no citoplasma. Com esta observação, concluiu-se que estas células eram células epiteliais realmente fagocíticas. Estas células representam uma resposta fisiológica à apoptose dos seus vizinhos epiteliais [30,31]. Portanto, este achado sugere que a depuração do tecido morto por células epiteliais ocorre no epitélio das vias aéreas distal nos ratos Aidon.
morte celular reforçada no tecido de Aidon ratos
A presença de células epiteliais fagocíticas em shoppings nos levou a especular que a morte celular pulmonar ocorre mais frequentemente em ratos Aidon do que os camundongos WT. No ensaio de TUNEL, ocasionalmente encontrada células mortas dentro de shoppings (Fig. 5a). No entanto, as células mortas foram reconhecidos mesmo na área externa do shopping. A ocorrência de células mortas fora Mall, em pulmões ratos Aidon (0,43%) foi significativamente mais elevada do que nos ratinhos WT (0,09%, P = 0,013; A Fig. 5B, Tabela 2). Para examinar se o auxílio citotoxicidade é específica do pulmão, foi realizada a coloração TUNEL de tecido do fígado. O número de TUNEL positivos hepatócitos aumentados em ratinhos Aidon em comparação com ratinhos WT (6,0% versus 4,8%; P = 0,036; Fig. 5C, Tabela 2). Este achado indica claramente que a morte celular induzida por AID não é específico para o pulmão
TUNEL de A, Mall.; B, Pulmão da AID rato Tg; e C, Fígado de AID do mouse Tg. As setas indicam células positivas TUNEL. ensaio de proliferação celular por meio de rotulagem EdU no pulmão da ajuda ratinhos Tg e camundongos WT: D, figura representativa da MALL EDU-positivo no dia 1. Uma ponta da flecha indica MALL EDU-positivo (a região é cercada por uma linha tracejada). E, figura representativa do pulmão de ratos AID Tg no dia 20. Uma ponta da flecha indica MALL EDU-positivo e uma seta indica MALL EDU-negativo. A região de cada centro está rodeado por uma linha tracejada. TUNEL, terminal de desoxinucleotidiltransferase (TdT) mediado por dUTP nick endlabeling; Edu, 5-etinil-2′-desoxiuridina.
Os números entre parênteses indicam a proporção de células positivas TUNEL para TUNEL células negativas.
A proliferação celular em shoppings
SHOPPING consiste em múltiplas células imaturas mucosas e um número limitado de células basais morfologicamente semelhantes aos dos brônquios, que servem como células estaminais de epitélio brônquico. Se as células mucosas imaturos são derivadas a partir destas células basais, pode-se supor que a geração do centro comercial deve acompanhar a divisão celular. Para verificar esta hipótese, foi realizado um ensaio de proliferação por 5-etinil-2′-desoxiuridina (UDE) incorporados em replicar DNA. Em primeiro lugar, administrou-se injecções intraperitoneais uma vez por dia de EdU a ratinhos Aidon durante 7 dias consecutivos. Metade dos murganhos foram sacrificados para a inspecção do pulmão um dia após a última injecção EdU (dia 1). Encontramos algumas células EDU-positivos dentro de shoppings, indicando que estas lesões têm o potencial para transportar células em proliferação. Após análise quantitativa de imagens adquiridas, 91,1% (41/45) dos shoppings foram encontrados para conter células positivas Edu (Fig. 5D).
Em seguida, examinamos os pulmões da metade restante de ratos Aidon no dia 20. Curiosamente, apenas 44,2% (19/43) dos shoppings tinham células positivas Edu (P 0,01 pelo teste do qui-quadrado, figura 5E.). Esta diminuição no EdU positividade durante os primeiros 19 dias pode ser interpretado por um cenário em que shopping centers estabelecidos transformar em tecido alveolar normal como novos, shoppings não marcados são gerados. Esta transformação é acreditado para diminuir EdU positividade. Outro cenário é que as células EQUENAS sofrem morte celular e são eliminados. Estas duas possibilidades não são mutuamente exclusivas. Que resultado é dominante é desconhecido até o momento.
A julgar pelo aumento gradual do número de shoppings (Fig. 2A), parece provável que a taxa de geração MALL excede ligeiramente a taxa de desaparecimento.
Mall e tumor de pulmão
Nossos dados sugerem que MALL não é um tumor, mas uma metaplasia de células mucosas proliferando com a longevidade restrito. Para investigar a relação entre Mall e tumor de pulmão, que se desenvolve em cerca de 10% dos ratos Aidon, primeiro confirmou expressão AID na alameda por imuno-histoquímica (Fig. 6A). Este resultado foi consistente com um resultado quantitativo de RT-PCR, revelando três vezes maior expressão AUXÍLIO Na Alameda do que o tecido circundante alveolar (S2 Fig.). Em seguida, examinamos seções de adenoma de Aidon ratos pulmão. Curiosamente, descobrimos que os shoppings são ocasionalmente incorporado no tecido tumoral (Fig. 6B e C). Além disso, a maior parte das células tumorais expressa a p63 marcadores de regeneração do pulmão, queratina 5/14, e Lgr 06/05 (Fig. 6, D-H). A expressão destes marcadores de regeneração foi muitas vezes limitados a uma subpopulação de células tumorais, provavelmente reflectindo uma instância de heterogeneidade intratumoral. A presença de MALL dentro de um tumor cancerígeno e seu potencial proliferativo sugerem que tumor de pulmão pode ter se originado a partir MALL em ratinhos transgénicos AID.
A, Imuno-histoquímica para AID em shoppings. MALL é indicado por uma seta. B, coloração HE do pulmão da ajuda ratinhos Tg com adenoma de pulmão. Um adenoma é demarcado por uma linha pontilhada. Região indicado por um retângulo é ampliado em C. C, setas indicam shoppings dentro de adenoma de pulmão. Imuno-histoquímica para D, ΔNp63: E, queratina 5; F, queratina 14; G, Lgr 5; e H, Lgr 6 em adenoma de pulmão.
Indução de expressão AID em células epiteliais alveolares humanos
Se a expressão AID é induzida em células epiteliais alveolares por citocinas pró-inflamatórias, como foi mostrado para cancros humanos do trato gastrointestinal [5-7], a possibilidade de envolvimento AID no cancro do pulmão humano surgiria. Para examinar se a estímulos inflamatórios aumentar a expressão AID em células epiteliais alveolares, o processo foi analisado por RT-PCR quantitativa em células A549 derivadas de adenocarcinoma do pulmão humano. As células A549 foram estimuladas com TNFa, IL1β ou LT α2 /β1 durante 12 e 24 h. O ARN foi então analisadas quanto à expressão de ARNm AUXÍLIO por RT-PCR quantitativo. expressão AID foi induzida com sucesso 12 h após a adição de TNF ou IL1β, enquanto indução por LTα2 /β1 foi marginal (Fig. 7).
O enredo mostra o resultado de quantitativo em tempo real reverter PCR transcrição para mRNA de ajuda dos células derivadas de adenocarcinoma do pulmão humano A549 estimuladas com factor de necrose tumoral (TNF) α, interleucina (IL) 1β ou linfotoxina (LT) α2 /β1 durante 12 e 24 h. Os dados são média ± SE; n = 3. SE, erro padrão.
Discussão
No presente estudo, propusemos que MALL é uma metaplasia de células mucosas que se desenvolve após lesão pulmonar alveolar induzida pela AID e poderia ser uma lesão pré-cancerosa de câncer de pulmão. Além disso, foi demonstrado que a expressão AID é induzida em células alveolares humanos por citocinas pró-inflamatórias, o que sugere o envolvimento de ajuda, a carcinogénese do pulmão humano. Começamos este estudo a partir de um pressuposto de que MALL pode ser um tumor fase muito precoce bem como AAH humano.