parafina-encaixado

Abstract

Fundo

Os pacientes com

KRAS

mutações não respondem ao receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores e deixar de beneficiar de quimioterapia adjuvante. A análise da mutação de

KRAS

é necessária antes de iniciar o tratamento com anticorpos anti-EGFR monoclonais em pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC). O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio multiplex PCR alelo-específica (MAS-PCR) para detectar

KRAS

mutações.

Métodos

Foi desenvolvido um single-tubo ensaio MAS-PCR para a detecção de sete

KRAS

mutações (G12D, G12a, G12R, G12C, G12S, G12V e G13D). Foram realizadas análises de ensaio MAS-PCR para

KRAS

no DNA isolado a partir de 270 (FFPE) tecidos de câncer colorretal embebidos em parafina fixadas em formalina. As sequências de todas as 270 amostras foram determinados por pirossequenciao. Sete amostras de ADN de ponto de mutação conhecidos diluído com ADN de tipo selvagem foram testadas para determinar a limitação de detecção e a reprodutibilidade do ensaio MAS-PCR.

Resultados

No geral, os resultados de masters ensaio de PCR estavam em boa concordância com pyrosequencing, e apenas sete amostras discordantes foram encontrados. O ensaio de PCR-MAS reprodutivelmente detectada 1 a 2% alelos mutantes. As mutações mais comuns foram G13D no códon 13 (49,17%), G12D (25,83%) e G12V (12,50%) no códon 12.

Conclusão

O ensaio MAS-PCR proporciona uma rápida e de baixo custo, e ferramenta de diagnóstico confiável para detecção precisa de

KRAS

mutações em FFPE tecidos de rotina de câncer colo-retal

Citation:. Seekhuntod S, Thavarungkul P, Chaichanawongsaroj N (2016) Validação de um multiplex alelo específico Polymerase Chain Reaction Ensaio para a detecção de

KRAS

Gene Mutações no fixadas em formalina, tecidos embebidos em parafina de colorretais pacientes com câncer. PLoS ONE 11 (1): e0147672. doi: 10.1371 /journal.pone.0147672

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 31 de outubro de 2015; Aceito: 06 de janeiro de 2016; Publicação: 26 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Seekhuntod et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. SS foi apoiado pelo 90º aniversário do fundo Universidade Chulalongkorn (Fundo de Doações Ratchadaphiseksomphot, GCUGR1125572134) e NC foi apoiado pela Faculdade de Ciências da Saúde Fundo Allied 2014 (AHS-CU 58004). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o câncer mais comum ea terceira principal causa de morte por câncer no mundo [1]. Na Tailândia, CRC é o terceiro câncer mais comum entre os homens eo quinto mais comum entre as mulheres [2, 3]. Uma das principais vias moleculares em desenvolvimento CRC é a indução de uma mutação activadora no

KRAS

(Kirsten oncogene viral de sarcoma de rato) proto-oncogene [4, 5]. O

gene KRAS

é um membro da

RAS

família do gene e codifica para uma proteína ras 21-kDa, que é um sinal a jusante proteína no receptor do factor de crescimento epidérmico de ligação de GTP (EGFR) via de transdução. As formas oncogénicas de

KRAS

mutações constitutivamente expressam a proteína ras activa levando a aumento da divisão celular, proliferação celular, a prevenção do processo de apoptose, a indução da angiogénese e metástases aumentado [6]. Recentemente, terapias de cancro têm sido desenvolvidos utilizando anticorpos monoclonais, incluindo cetuximab e panitumumab, para direccionar o EGFR [7, 8]. Estes agentes são concebidos para bloquear o EGFR de tirosina-quinase de activação induzida pelo ligando e, deste modo, inibir a sinalização a jusante [9]. No entanto, apenas o CRC com o tipo selvagem

KRAS

responde proto-oncogene ao tratamento anticorpos anti-EGFR, enquanto que nenhuma resposta terapêutica ocorre no CRC com

mutações KRAS

[9-11]. A Sociedade Europeia de Oncologia Médica e da Sociedade Americana de Oncologia Clínica estabeleceram grandes orientações de oncologia que estes anticorpos ser restrito a pacientes com

KRAS

do tipo selvagem cancros colo [12, 13]. Portanto, a detecção de

KRAS

mutações genéticas tem relevância clínica crítica para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas individualizadas de pacientes [7].

Vários métodos moleculares têm sido desenvolvidos para a detecção de

KRAS

mutações. Estes métodos incluem a sequenciação directa [10], PCR em tempo real [11], que funde alta resolução (GRH) [14], a amplificação refractária reacção sistema mutação em cadeia da polimerase [15, 16], pirossequenciao [17, 18], de co-amplificação em menor temperatura de desnaturação PCR [19], mutantes enriquecido por PCR [20], e PCR digital [21]. Além disso, vários kits moleculares comerciais são comumente disponíveis para

KRAS

detecção de mutações, incluindo as cobas

® KRAS Ensaio de mutação [22], 3D-Gene

® KRAS kit ensaio de mutação, TheraScreen

® KRAS RGQ PCR Kit [23], KRAS mutação Análise Kit de EntroGen para o real-Time PCR [23], e V2.0 Kit KRAS PyroMark Q96 [24]. No entanto, todos estes métodos requerem conhecimentos técnicos e equipamento especializado e instrumentos, e são muito caros como ferramentas de prognóstico e de diagnóstico para pacientes com câncer nos países em desenvolvimento. Em contraste, Multiplex específica de alelo de Reacção em Cadeia da Polimerase (MAS-PCR) é um método simples, confiável e barato para a detecção de mutações conhecidas e polimorfismo de um único nucleótido-[25, 26]. MAS-PCR é caracterizado por um terminal com iniciadores específicos para o alelo 3 ‘que hibrida especificamente ao molde de ADN de tipo selvagem ou mutada de apenas [26, 27]. Do tipo selvagem e específica de alelo primers gerar diferentes produtos de PCR de tamanho, permitindo fácil detecção de uma mutação genética conhecida.

Neste estudo, desenvolvemos um ensaio MAS-PCR para análise do estado mutacional de

KRAS

códons 12 e 13. único mutações pontuais de nucleótidos no

gene KRAS

ocorrem com mais frequência em códons 12 e 13 representando 80 a 82% e 15 a 17% das mutações, respectivamente [28-31 ]. As mutações em outras posições, como códons 61, 117, 146 e 154, são muito menos frequentes no valor de cerca de 1% de todos os

mutações no gene KRAS

[17, 32]. Neste estudo, a presença das mutações pontuais mais comuns nos códons 12 e 13, que são G12D, G12a, G12R, G12C, G12S, G12V e G13D [18, 30, 32, 33], foi avaliada em fixado em formol, amostras de tecido embebidos em parafina de 270 pacientes com CCR. Pyrosequencing, um método robusto e sensível, foi usado como um método de referência para comparar a sensibilidade do ensaio MAS-PCR para a detecção de

KRAS

alelos mutantes.

Materiais e Métodos

Preparação de amostras clínicas

formalina-fixo, adenocarcinomas colorretais embebidos em parafina de 270 pacientes com CCR foram coletadas a partir do Instituto de Patologia, Ministério da Saúde Pública, Bangkok, Tailândia. O estudo foi aprovado pelo Comitê do Instituto de Patologia (IOP-KM-R57-007) Ética. O comitê de ética dispensou a necessidade de consentimento, porque os dados de amostras de tecidos foram analisados ​​anonimamente e relatados. Um patologista experiente revistos e marcou as áreas de adenocarcinoma dos slides hematoxilina e eosina manchadas. Os tumores foram manualmente micro-dissecados a partir de blocos embebidos em parafina, e 10 mm de espessura foram coletadas em um tubo de 1,5 ml. A parafina foi removida a partir dos blocos de tecido com xileno, e as amostras foram secas ao ar. O DNA foi extraído das amostras e purificados utilizando um kit de tecidos FFPE DNA QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. quantidade de DNA foi determinado por espectrofotometria NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

Amplificação por PCR e pirossequencia�o

pyrosequencing para análise de um

KRAS

fragmento do gene abrangendo códons 12 e 13 foi realizado como anteriormente descrito, com algumas modificações [18]. As sequências dos iniciadores foram previamente descrito [18]. As condições de reacção com 1 uM iniciador directo (5′-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ‘), biotinilado iniciador reverso (5′-biotina-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’), e de 50 a 100 ng /ul de molde de ADN originou um produto de 82 pb. As reacções foram realizadas em tampão de PCR 1x contendo MgCl 2,5 mM

2, dNTP 0,2 mM (BioLabs, Inglaterra), e 0,625 U de polimerase de ADN Amplitag ouro (Applied Biosystems, EUA) num volume total de 30 ul. As condições de PCR foram um passo de desnaturação a 95 ° C durante 10 min, em seguida, 1 min a 95 ° C, 1 min a 55 ° C, 1 min a 72 ° C durante 35 ciclos, e seguido por 7 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram confirmados por electroforese em gel de poliacrilamida a 8% a 140 V durante 40 min, e os géis foram corados com SYBR Green I Gel de Ácido Nucleico Mancha (1: 400, Lonza, EUA) durante 30 min. Os produtos de PCR foram sequenciados por pyrosequencing utilizando o reagente PyroMark ouro Q96 (Qiagen, Alemanha). Os produtos de PCR de 30 ul foram misturados com esferas de 3 ul de estreptavidina-Sepharose conjugada com estreptavidina (Sepharose HP, Amersham Biosciences AB, Suécia), tampão de ligação de 40 ul e 17 ul de água destilada, seguido por agitação a 1400 rpm durante 10 min. Os produtos de PCR biotinilados imobilizadas: complexos de contas de Sepharose conjugada com estreptavidina foram capturadas usando uma ferramenta de preparação de vácuo. purificação de ADN de cadeia simples foi obtido por 1x lavagem a vácuo prep ferramenta sequencialmente com etanol a 70% durante 5 segundos, a solução de desnaturação durante 5 s, e de tampão de lavagem durante 10 s. Biotinilado de cadeia simples de ADN foi adicionado a um placa de microtitulação de 96 poços que continha 40 ul de 0,4 uM sequenciação PF1-iniciador (5′-TGTGGTAGTTGG AGCTG-3 ‘) para análise nos nucleótidos 35 e 38 posições, e PF2-iniciador (5 ‘-TGTGGTAGTTGGAGCT-3’) para análise no nucleótido 34 posição [18]. A placa foi incubada a 80 ° C durante 2 min, seguido de arrefecimento até à temperatura ambiente durante 5 min, e carregou-se o sistema PyroMark ID Q96 (Qiagen, Alemanha).

DNA Cloning

DNA genômico de oito amostras clínicas abrigando

KRAS

do tipo selvagem DNA e sete mutações pontuais no

KRAS

códons 12 e 13 (G12D, G12a, G12R, G12C, G12S, G12V e G13D) foram sujeitos a amplificação por PCR utilizando universais

KRAS

iniciadores (K-

ras

-codon 13/12-F 5′-CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG TAT T-3 ‘e K-

ras

-codon 12/13-R 5′-ATC TGT ATC AAA GAA TGG TCC TG-3 ‘). Todos os produtos de 259 pb por PCR foram clonados em PSC-A-amp /kan vector competente e transformada em

Escherichia coli

células utilizando um kit de clonagem de PCR Strataclone (Agilent Technologies; Estados Unidos). As bactérias transformadas foram espalhadas em placas de LB-agar selectivo (Oxoid, EUA) com ampicilina e X-Gal (Promega, EUA). Após uma incubação durante a noite a 37 ° C, as colónias brancas foram seleccionadas aleatoriamente e cultivadas em meio LB, durante a noite. Os plasmídeos foram extraídos utilizando Assistente

® kit de purificação de DNA genômico (Geneaid, Taipei, Taiwan) e, posteriormente, selecionados para o fragmento de inserção por PCR. Os produtos de PCR positivo foram sequenciados pela Bioneer Corporation, Daejeon, República da Coreia.

Primer Design by

alelo específico-(as) iniciadores foram desenhados para cada uma das sete mutações, e uma mutação-inespecífica região foi utilizada como um fragmento amplificado de referência. base do terminal 3 ‘de cada um como primário foi adotada de acordo com a sua mutação correspondente. reações de amplificação foram realizadas com o principal

KRAS

iniciador directo e cinco como iniciadores (G12R-F, G12C-F, G12D-F, G12a-F, e G13D-F) compartilhando com um antisense comum

KRAS

iniciador inverso e reações com dois AS-iniciadores (G12S-R e G12V-R) partilha com um senso comum

KRAS

iniciador directo (Fig 1). As sequências dos iniciadores utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1. Todos os iniciadores foram sintetizados e fornecidos pela BioDesign Co., Ltd. (BioDesign, Pathumthani, Tailândia).

As posições dos iniciadores são ilustrados. Como iniciadores partilhar o mesmo iniciador directo ou iniciador inverso. setas a cheio indicam a iniciadores directos e inversos. base do terminal 3 ‘de cada um como iniciadores foi adaptado de acordo com a sua mutação correspondente, e está em negrito e sublinhado. Códons e bases mutadas estão sublinhadas.

Multiplex específica de alelo PCR (MAS-PCR)

A única reação tiveram duas principais

KRAS

primers e sete como iniciadores de segmentação em sete nucleótidos mutados no gene

KRAS

. A reacção MAS-PCR em 50 ul volume total continha 1x tampão de PCR, MgCl 2,5 mM

2, 0,2 de dNTP mM (BioLabs, Inglaterra), 0,625 L Amplitag ouro DNA polimerase (Applied Biosystems, EUA), de 50 a 100 ng /molde de ADN. As concentrações optimizadas de cada iniciador estão apresentados na Tabela 1. A reacção foi amplificado sob as seguintes condições: um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 10 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 60 s, um segundo passo de 20 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 64 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 60 s, e um terceiro passo de 20 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 60 s, e, finalmente, 10 min a 72 ° C. Após a amplificação, os produtos de amplificação com um volume de carga de 20 ul foram analisados ​​por electroforese em gel de poliacrilamida a 8% a 140 V durante 60 min, e os géis foram corados com SYBR Green I Ácido Nucleico Gel Stain (1: 400, Lonza, EUA) durante 30 min. Devido a extremidade 3 ‘de cada um dos pares de iniciadores com o AS respectiva base de nucleótido na sequência mutante de

gene KRAS

, o fragmento específico de alelo foi amplificada originando uma de 97 pb, 91 pb, 89- pb, 85 pb, 83 pb, 68 pb e 64 pb produtos (representados os G12C, G12D, G13D, G12R, G12a, G12V, e mutantes G12S, respectivamente), juntamente com a banda de 113 pb positivo como um interno ao controle. Enquanto o tipo selvagem de DNA em qualquer um dos sete posições impede a amplificação específica do alelo resultante de uma banda correspondente ausente (Fig 2).

Ensaio distinguido do tipo selvagem

KRAS

codões do gene 12 e 13 a partir de diferentes mutantes utilizando como iniciadores. Pista M: Baixa escada de DNA de peso molecular; Pista 1: controle negativo; Pista 2: de tipo selvagem; Pista 3: mutante G12S; Pista 4: mutante G12R; Pista 5: mutante G12C; Pista 6: mutante G12D; Pista 7: mutante G12a; Pista 8: mutante G12V; Pista 9:. G13D mutante

Sensibilidade do MAS-PCR Ensaio

Oito clones de plasmídeos de

KRAS

de tipo selvagem e sete

KRAS

mutantes (G12D, G12a, G12R, G12C, G12S, G12V, ou G13D) foram extraídos. Cada DNA de plasmídeo mutagenizado foi misturado com um ADN de plasmídeo de tipo selvagem, no total de 100 ng. A proporção de ADN plasmídeo mutante foi gradualmente reduzida para se obter proporções decrescentes de mutante de ADN de tipo selvagem a 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% e 0,1%. A precisão e reprodutibilidade foram determinados em quatro repetido executado através da análise das misturas na gama de menor limite de detecção que foram demonstrados por MAS-PCR.

Análise de dados

Os resultados obtidos a partir MAS-PCR e pyrosequencing foram comparados para os 270, espécimes embebidos em parafina e fixado em formalina e foram avaliadas para a significância utilizando as estatísticas de Kappa. Um valor de k 0,81 foi considerado significativo e para indicar que ambos os métodos proporcionam resultados quase perfeitos. intervalos de confiança acordo positivos e negativos foram determinados para os resultados MAS-PCR. Diferenças nas variáveis ​​categóricas, tais como idade, sexo, grau histológico e local do tumor entre os pacientes e com

KRAS

mutações foram avaliadas para significância com o teste do qui-quadrado. Os testes estatísticos foram em frente e verso, e p 0,05 foi considerado significativo. As estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS (versão 11.5).

Resultados

pyrosequencing análise do

KRAS

mutações genéticas em amostras de CRC

Duzentos e setenta e amostras clínicas foram analisadas pela primeira vez por pyrosequencing para 6 mutações pontuais diferentes no códon 12 (G12S, G12R, G12C, G12D, G12a e G12V) e um ponto de mutação no códon 13 (G13D) do

gene KRAS

. As mutações seleccionadas para este estudo estão entre os mais frequentemente encontrados em pacientes com câncer colorretal. Das amostras de tecido 270, os resultados de sequenciamento revelou que 120 casos (44,44%) tinham uma mutação em qualquer um códon 12 ou 13 no

gene KRAS

, enquanto 150 casos (55,55%) foram definidos como

KRAS

tipo selvagem (Tabela 2). Dos 120 casos com um

KRAS

mutação, 61 (50,83%) dos pacientes tinha um códon 12 mutação. O mais frequente códon 12 mutação foi G12D em 25,83%, seguido pelo G12V em 12,50%. A incidência de G12a, mutações G12S e G12C variou de 6 a 3%, enquanto que de G12R foi a mais baixa em 1%. O G13D mutação códon 13 encontradas em 49,17% foi mais prevalente do que qualquer do códon 12 mutações. Os doentes tinham uma ou nenhuma mutação detectável.

análise MAS-PCR de

KRAS

mutações genéticas em amostras clínicas CRC

O ensaio MAS-PCR, realizada em as 270 amostras de tecido CRC para detectar a

KRAS

códon 12 e códon 13 mutações, revelou resultados que intimamente acordados com os de pyrosequencing. Como mostrado na Tabela 2, 113 (41,85%) casos de

KRAS

mutação em códons 12 e 13 e 157 casos (58,15%) de

KRAS tipo selvagem

foram identificados pelo ensaio MAS-PCR . Entre os 113 casos mutados, 47,79% tinham uma mutação no codão 12. Além disso, em referência aos resultados pirossequenciao, sete casos mutados (G12D três, um G12R, e três G12a) não foram detectados por ensaio de PCR-MAS. No entanto, todos códon 13 mutações foram identificadas corretamente, como com resultados pyrosequencing.

Correlação das características dos pacientes com

KRAS

códon 12 e 13 mutações

A idade média dos pacientes foi 62 anos, variando de 27 a 90 anos de idade. A maioria dos pacientes tinham entre 60 e 79 anos de idade (55,19%). Rácio entre homens e mulheres foi de 1,55: 1. O tipo histológico dominante em 64,81% (175/270) foi moderadamente diferenciado e 88,52% dos casos (239/270) eram tumores primários colorretal (Tabela 3). A possível correlação entre as características demográficas dos pacientes e detectou

KRAS

mutações foi examinado como mostra a Tabela 3. Dos pacientes estudados apresentam

KRAS

carcinoma mutado, não foram encontradas diferenças significativas em relação à idade , sexo, grau histológico e local do tumor. As mutações nos códons 12 e 13 foram de forma justa e bem distribuída dentro dos grupos de estar próximo de 1:. Proporção de 1 independentemente da característica

Comparação de MAS-PCR e pyrosequencing

Resultados para as amostras FFPE 270 foram submetidas a análises de acordo, e os resultados MAS-PCR foram comparados com os do método pyrosequencing (Tabela 4). resultados concordantes de 263 de 270 amostras mostraram que ambos os métodos forneceram resultados perfeitos (p 0,05), sem diferença estatisticamente significativa entre os ensaios (CI k = 0,947, 95% = 0,909 para 0,986). Para 7 casos, foram obtidos resultados discordantes, principalmente em relação códon 12 mutações que eram detectáveis ​​por pyrosequencing e seqüenciamento Sanger direta, mas não com ensaio MAS-PCR. O acordo positivo e negativo acordo foram de 94% e 100%, respectivamente.

A sensibilidade, precisão e reprodutibilidade do MAS-PCR para

KRAS

mutação

Para avaliar a sensibilidade do ensaio MAS-PCR, DNA de plasmídeo de cada sete

KRAS

clones mutantes diluiu-se em reacções de amplificação separadas com DNA de plasmídeo de um tipo selvagem

KRAS

clone. A proporção de ADN mutante foi gradualmente reduzida para se obter proporções decrescentes de mutante de ADN de tipo selvagem. O ensaio MAS-PCR detectou alelos mutantes para baixo a 1% para o mutante G12S, e 2% para os mutantes G12R, G12C, G12D, G12a, G12V, e G13D. O exemplo representativo de ensaio MAS-PCR para menor limite de detecção é mostrado na FIG 3. Para testar a precisão e a reprodutibilidade do nosso ensaio MAS-PCR, foi quantificado o

KRAS

mutações nas misturas de DNA contendo cada um dos sete mutante

KRAS

ADN e ADN de tipo selvagem em razões variáveis ​​(10%, 5%, 2%, 1%, 0,1% e 0,01%) em quatro corridas repetidas. Os resultados foram precisa e reprodutível, do que a mesma quantidade menor de

KRAS

alelos mutantes foram detectados em todas as corridas repetidas.

Um gel representativo é mostrado. As diluições do mutante G12R plasmídeo e o DNA de plasmídeo de tipo selvagem (de 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% e 0,1% alelos mutados) Pista M: escada de ADN de baixo peso molecular; Pista 1: controle negativo; Pista 2-9: correspondiam a produtos de PCR de 100% a 0,1%

Discussão

Muitos estudos examinaram a associação de

KRAS

mutações com CRC [. ,,,0],8, 33-37].

KRAS

mutações nos pacientes de CRC correlacionam-se com a resistência ao tratamento com anti-EGFR, tal como cetuximab ou panitumumab [7]. Assim, a previsão precisa de respostas terapêuticas irá poupar o paciente de tratamento desnecessário enquanto se concentra em terapia eficaz mais individualizada. Uma grande variedade de métodos foram desenvolvidos e vários kits comerciais moleculares estão vulgarmente disponíveis para a detecção de

KRAS

mutações [10, 11, 14, 17, 20, 23]. Cada técnica tem seu próprio conjunto de problemas e questões. Por exemplo, sequenciação directa é a abordagem mais comumente utilizado para pesquisar

KRAS

mutações, no entanto sensibilidade para a detecção de DNA mutante é baixo e exige pelo menos 10% -30% dos alelos mutados em um fundo do tipo selvagem [ ,,,0],14, 18, 38]. HRM é uma metodologia que permite a rápida pesquisa de alto rendimento de

KRAS

mutações com uma sensibilidade analítica moderada de 5% a 6% [14], no entanto, a sua principal limitação é a incapacidade de identificar qual é codão mutante. resultados GRH deve ser confirmado, e identificação de mutações específicas exige uma outra técnica, como a sequenciação directa [39]. Pirossequenciao é preciso, viável e tem sensibilidade analítica superior de cerca de 5% alelo mutante [14, 18]. No entanto, este ensaio requer um instrumento caro, e reagentes e consumíveis caros, tornando-se um custo proibitivo para uso em países em desenvolvimento. Kits comerciais moleculares têm várias vantagens, incluindo uma sensibilidade elevada (isto é, limite de detecção de cerca de 1% a 5%), a velocidade, a interpretação de dados fácil, e numerosas posições detectáveis ​​de

KRAS

mutações, no entanto, este ensaio também exige um instrumento caro, reagentes caros, e tem um custo relativamente elevado por exemplo [40]. Por conseguinte, existe uma necessidade de desenvolver um método preciso, simples e de baixo custo para detectar

KRAS

mutações que se sabe estarem associados com o CRC que pode ser utilizada nos países em desenvolvimento.

Neste estudo, desenvolvido com sucesso ensaio altamente sensível e específico MAS-PCR, tendo como alvo os sete (ou seja, G12S, G12R, G12C, G12D, G12a, G12V e G13D) mutações mais comuns nos códons 12 e 13 da

KRAS

gene. Nós concebidos primers específicos para cada mutação, e uma região de mutação-inespecífica foi utilizado como um fragmento amplificado de referência. A base 3′-terminal de cada AS cartilha foi adotada de acordo com a sua mutação correspondente. O ensaio MAS-PCR foi optimizado para cada iniciador em termos dos parâmetros de concentração e de iniciadores de amplificação. O ensaio MAS-PCR relatamos aqui é o primeiro desenvolvimento de PCR alelo-específico multiplex empregando o método de PCR padrão que pode detectar os sete

KRAS

mutações genéticas mais comuns. O método pode simplesmente ser realizado em laboratórios com poucos recursos. Outras investigações está a caminho de desenvolver um imunoensaio simples, rápido e fácil de usar de Ácido Nucleico Lateral Flow (NALF) [41], utilizando iniciadores biotinilados com base em iniciadores desenvolvidos neste estudo. Além disso em tempo real baseado em sonda PCR poderia ser estabelecida usando o nosso primário MAS-PCR definido para detectar

KRAS

mutações. Ambos os métodos poderiam ser vantajoso em termos de prevenção crosstalk entre as amostras e /ou contaminações ambientais durante experimentações condutores.

No presente estudo, observou-se que a frequência de

KRAS

mutações oncogênicas nos códons 12 e 13 em 270 amostras de pacientes tailandeses câncer colorretal foi 44,44%. frequências semelhantes, variando de 20 a 50%, foram previamente descrito [28, 30, 33]. Encontramos as taxas de mutações no códon 12 e códons 13 estavam em 50,83% e 49,17%, respectivamente, que foram maiores do que os relatados em outros estudos (códon 12: 70-90%, codão 13: 10-30%) [28 , 30, 31, 33]. No entanto, nossos resultados deram freqüências semelhantes (códon 12: 52,62% (10/19), codão 13: 42.12% (8/19)) conforme relatado por Poehlmann et al [17]. O frequentemente encontrada G13D, G12D, e mutações G12V identificados neste estudo estavam entre as mais comuns

KRAS

mutações, de acordo com outros estudos [17, 28, 33]. Nossos dados mostraram que não houve associação significativa entre a

KRAS

mutações e idade, sexo, grau histológico ou local do tumor. No entanto, alguns relatórios anteriores descobriram que a taxa de

KRAS

mutações foram maiores nas fêmeas do que machos [10, 42] que foi em frente ao estudo da Poehlmann et al [17].

A nossa dados mostraram uma consistência superior, entre ensaio MAS-PCR e pyrosequencing (k = 0,947). Sete discordâncias foram encontrados de acordo com resultados pyrosequencing. A sequenciação directa e pyrosequencing revelou os mesmos alelos mutantes, que constou de 3 casos de G12D, 3 casos de G12a, e 1 caso de G12R. Um resultado possível é a formação de dímeros entre transversais principais iniciadores para amplificação polarizado, que pode reduzir a sensibilidade do ensaio MAS-PCR [43]. Além disso, as amostras de tecido FFPE pode ter ácidos nucleicos degradadas devido ao processo de fixação, e o efeito de fixadores reticulantes sobre os ácidos nucleicos é prejudicial causando a inibição de PCR [44, 45]. Curiosamente, o nosso ensaio MAS-PCR mostrou elevada sensibilidade analítica de detecção, com cerca de 1-2% alelo mutante detectada com base na mistura de ADN experiências utilizando ADN genómico isolado a partir de ADN plasmídeo clonado. No entanto, tal sensibilidade pode ser afectada considerando a utilização de amostras clínicas que são geralmente complicados com a presença de PCR componentes interferentes nas amostras. No entanto, a maioria dos componentes interferentes pode ser eliminado por purificação de ADN, utilizando kits de tecidos FFPE como empregue neste estudo e como previamente descrito [46, 47]. Além disso, o ensaio de MAS-PCR que desenvolvemos tem uma sensibilidade mais elevada do que a relatada para a sequenciação directa e HRM (ou seja, 5% a 20%), e é equivalente à descrita para pirossequenciao e comerciais kits moleculares (isto é, de 1% a 5%) [14, 18, 38]. Além disso, encontramos uma boa precisão e reprodutibilidade do ensaio desenvolvido, como quatro run repetida produziu os mesmos resultados. Além disso, MAS-PCR é um ensaio rápido, requerendo apenas 4 h para completar o ensaio (excluindo o isolamento de ADN); é barato, custando cerca de US $ 8 por teste. Além disso, o ensaio emprega apenas um instrumento de PCR, e não requer um alto nível de conhecimento técnico e de equipamento especializado.

Conclusões

Em conclusão, nós desenvolvemos um ensaio MAS-PCR para a detecção de as sete mutações mais comuns nos códons 12 e 13 do gene

KRAS

. ensaio MAS-PCR é um protocolo baseado em DNA que foi de fácil execução, sendo rápida e de baixo custo, altamente sensível e altamente específico. Um ensaio com estas características são importantes para a análise de amostras clínicas, tais como tecidos FFPE, em particular, para auxiliar os médicos na predição do curso clínico de tratamento com anticorpo monoclonal anti-EGFR de pacientes com CCRm.

Reconhecimento

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Chupong Ittiwut e Dr. Rungnapa Ittiwut (Centro de excelência em genética médica, Universidade Chulalongkorn) para os seus conselhos sobre pyrosequencing técnicas. Nós gostaríamos de agradecer Departamento de Serviços Médicos, Instituto de Patologia, Ministério da Saúde Pública para fornecer amostras de tecido CRC e o instrumento pyrosequencing. Nós gostaríamos de expressar nossa gratidão ao Prof. Dr. Kathleen L. McCoy (Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina, Virginia Commonwealth University), que foi apoiado financeiramente pela subvenção para acadêmicos e pesquisadores estrangeiros para aumentar a artigos publicados em internacional revistas através do Fundo Ratchadaphiseksomphot Endowment Universidade Chulalongkorn 2015 para sua leitura crítica do manuscrito. Nós também gostaríamos de agradecer Assoc. Prof. Dr. Pornpimol Rongnoparut de assistência revisão.