Abstract

O potencial de auto-renovação de uma célula de câncer pode ser estimada utilizando ensaios específicos, que incluem o xenotransplante em imunocomprometidos animais ou cultivo em meios células-tronco sem soro não aderentes (SCM). No entanto, se as células com potencial de auto-renovação, na verdade, contribuir para a doença é desconhecido. Aqui investigámos o potencial tumorigénico e o destino das células cancerosas num modelo de melanoma in vivo em. Examinámos as linhas celulares que foram derivados a partir da mesma linha progenitora: uma linha celular não metastática (K1735 /16), uma linha de células metastática (K1735 /M4) e uma linha celular que foi seleccionado em condições não-aderentes (K1735 /16S ). Todas as linhas celulares apresentaram cinética de proliferação semelhantes quando cultivadas em placas de cultura. K1735 /16 células cultivadas em agar mole ou em suspensão condições não aderentes não conseguiu formar colónias ou esferóides, ao passo que as outras linhas de células mostraram colonogenicity proeminente e capacidade de formação de esferóides. Usando esfera limitando a análise de diluição (SLDA) em meio isento de soro, K1735 K1735 /16S e /M4 células cultivadas em suspensão foram capazes de formar esferóides, mesmo em baixas concentrações de frequências, em oposição às células K1735 /16. O potencial tumorigénico das linhas de células foi determinada em ratinhos SCID com injecções intra almofada da pata. Tumores palpáveis ​​eram evidentes em todos os ratinhos. De acordo com o

estudos in vitro

, a linha de células K1735 /M4 apresentou o mais alto cinética de crescimento, seguindo-se a linha de células K1735 /16S, ao passo que a linha de células K1735 /16 tiveram o menor potencial de crescimento do tumor (

P Art 0,001). Em contraste, quando se repetiu as experiências em ratinhos C3H /HeN singeneicos, a linha de células K1735 /16 produziu tumores macroscópicos 30-100 dias após a injecção, enquanto que K1735 /M4 e K1735 /16S tumores regrediram derivados espontaneamente em 90-100% dos murganhos . análise de TUNEL revelou número significativamente maior de células apoptóticas em K1735 K1735 /16S e /M4 tumores derivados da linha de células em comparação com K1735 /16 tumores (p 0,001). Os modelos que examinamos aqui levantou a possibilidade, de que as células com alta atividade tumorigénica pode ser mais imunogênico e, portanto, são mais suscetíveis a imuno-regulação

Citation:. Krelin Y, Berkovich L, Amit M, Gil Z (2013) Associação entre Oncogenia Potencial e o destino das células cancerosas de melanoma Modelo Singênico. PLoS ONE 8 (4): e62124. doi: 10.1371 /journal.pone.0062124

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de abril de 2012; Aceito: 19 de março de 2013; Publicação: 23 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Krelin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Israel Science Foundation (número 1680-1608 e 482/11), a Associação Cancer Israel (concessão doado por Ellen e Emanuel Kronitz na memória do Dr. Leon Kronitz número 20090068), o Ministério da Saúde israelense (número 3-7355 ), o Instituto Weizmann – Grant Joint Sourasky Medical Center, de Tel Aviv Sourasky Intramural Grant, o ICRF Barbara S. Goodman dotado prêmio de pesquisa de desenvolvimento de carreira (2011-601-BGPC) e uma subvenção de os EUA-Israel Binacional Science Foundation (número 2007312) para ZG Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro é uma doença complexa, envolvendo diferenças entre tumores ou células dentro de um determinado tumor, bem como a variação entre os pacientes. Dentro do espectro de células de um dado tumor, sub-populações de células podem ser fenotipicamente diferente e exibem potencial proliferativo distinta. Por exemplo, o modelo de cancro de células estaminais (CSC) sugere que apenas uma pequena subpopulação de células tem um potencial de auto-renovação e a formação do tumor, enquanto que a maioria do tumor consiste em células não tumorigénicas [1]. Provas que sustentam o modelo de CSC é encontrado no câncer de células germinativas, leucemia, câncer de mama, câncer de cólon e em alguns cancros cerebrais. [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Por outro lado, se os melanomas são consistentes com um tal modelo é um assunto de debate permanente [12], [13].

Actualmente, o único ensaio que determina o potencial tumorigénico de tumores humanos envolve xenotransplante de diferente subpopulações de células cancerosas nos flancos de animais altamente imunossupressores (por exemplo NOD /SCID). Além disso, stemness (ou seja, a capacidade de se auto-renovar e diferenciar) é frequentemente avaliado

in-vitro

por ensaios de substitutos que examinam a capacidade de formação de esfera e clonogenicidade em condições independentes de ancoragem, tais como semi-sólida macia agar [ ,,,0],14]. Experimentos anteriores mostraram que esferóides multicelulares tumorais são morfologicamente e caracteristicamente semelhante a tumores sólidos

in-vivo

[15], [16]. Também tem sido demonstrado que o potencial de formação de esfera em suspensão condições não-aderentes consistentemente se correlaciona com o potencial de crescimento neoplásico em ratinhos imunodeprimidos [17], [18], [19], [20].

Ambos

in-vitro

e

in-vivo

ensaios stemness abordar o potencial tumorigénico do subpopulação distinta de células, enquanto que a formação real de tumores em pacientes pode depender de outros fatores. O microambiente do tumor que pode ser local específico eo sistema imune do hospedeiro que é prejudicada em NOD /SCID pode potencialmente alterar o destino das células cancerosas e sua contribuição para a doença. Assim, a questão de saber se as células com um elevado potencial tumorigénico realmente contribuir para o crescimento do tumor em pacientes com um sistema imunológico intacto continua por resolver

Neste artigo procurou comparar dois fenómenos relacionados com o desenvolvimento do câncer:. Potencial tumorigénico e o destino das células cancerosas. Para superar duas das principais limitações que são inerentes ao xeno subcutânea de células cancerosas humanas em ratinhos imunocomprometidos, ou seja, a barreira das espécies e a definição de transplante, foi utilizado um modelo de melanoma singênica e injeções intra coxins plantares ortotópicos em animais imunocompetentes.

Materiais e Métodos

linhas celulares

linhas de células de melanoma de ratinho (K1735 /16 e K1735 /M4) foram um presente do laboratório do Dr. Lea Eisenbach (Instituto Weizmann, em Rehovot ). A linha de células K1735 /16S foi obtido a partir da linha celular K1735 /16, por cultura de células em condições não-aderentes (ver abaixo) durante 16 dias. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com MSCM, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, a 37 ° C, 5% de CO2, numa incubadora humidi ficada. Todos os ingredientes do meio foram adquiridos de Biological Industries, Israel. Para os ensaios de auto-renovação e crescimento de esferóides que usamos meios melanoma isento de soro de células estaminais (MSCM) que consistia de meio /F12, SR KnockOut ™ de Eagle modificado por Dulbecco, 100 mM de L-glutamina (Invitrogen), MEM não essenciais Aminoácidos Solução 10 mM, 2 ug /ml de FGF (Sigma) e antibióticos. Para ensaios de crescimento esfera foi utilizado MSCM condicionado com fibroblastos de rato embrionários (MEF) CF-1 durante 24 h. [21] Os reagentes foram também utilizados, tais como: azida de sódio, paraformaldeído, xileno e citrato de sódio foram adquiridos da Sigma Aldrich, Israel

Mice and a

in vivo

Pé Pad Modelo

.

C3H ratos fêmeas /ave e camundongos Imunodeficiência Combinada grave (SCID) foram adquiridos de Harlan (Jerusalém, Israel). Todos os ratos foram mantidos no Biotério do Tel Aviv Medical Center (Tel-Aviv, Israel), sob condições assépticas.

Os estudos em animais foram realizados em conformidade com todas as políticas aplicáveis, procedimentos e requisitos regulamentares da Institutional animal Care e Use Committee (IACUC), o Centro de Pesquisa animal Resource (rARC) de Tel Aviv University e do National Institutes of Health (NIH) “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório”. Todos os procedimentos animais foram realizados por inalação de isoflurano a 2%. Após os estudos, todos os animais foram sacrificados por CO

2 inalação.

Um modelo de melanoma singênica pé pad foi criado, como descrito anteriormente por Harrell et al. [22]. Resumidamente, foram anestesiados trinta ratos, seis semanas de idade com isoflurano por inalao para todos os procedimentos. A almofada do pé do membro posterior esquerdo foi esterilizado com álcool e, em seguida, lentamente injectados com 50 ul de suspensão celular a uma concentração de 2 x 10

5 células /50 ul ao longo de um período de 2 minutos. Os ratos foram então despertada e sua almofada do pé monitorados para o tamanho e sinais de dor ou ulceração do tumor duas vezes por semana.

Experiência com ratos C3H /ave sing�icos, foram repetidos 3 vezes, e em cada experimento foi injetado 10- 15 ratinhos por grupo. Nas experiências com ratinhos SCID que utilizado 6-7 ratinhos por grupo. Na experiência de separação de células, cada um dos grupos (5-6 ratos por grupo) foi injectado com CD133 ordenada (+), o controlo K1735 /M4 ou controlo K1735 /16 células singeneicas de ratinhos C3H /HeN.

Amostras do local de injecção de linhas de células de melanoma foram obtidos nos dias 16 e 40, fixadas em paraformaldeído a 4%, desidratadas em álcool, limpas em xileno e embebidos em parafina. seções de quatro micron foram coradas com hematoxilina e eosina (H E), usando protocolos estabelecidos. Para imuno-histoquímica, secções de tecido foram desparafinados em xileno e re-hidratadas com a diminuição da concentração de álcool. peróxido endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio e a recuperação de antigénio foi alcançada através da utilização de citrato /L de sódio 0,01 mol (pH 6,0) durante 1 min numa panela de pressão. Após o bloqueio, no soro normal apropriado, secções de tecido foram coradas com os anticorpos primários ou com o kit de apoptose Mebstain (TUNEL) (código de MBL 8445 Woburn, EUA). Os anticorpos utilizados foram como se segue: anticorpo policlonal de coelho anti-ratinho /humano de Ki67 (1:100; clone ab66155 Abcam Cambridge, Reino Unido), de ratinho anti-rato /MelanA humano (1:20; clone ab731 Abcam Cambridge, Reino Unido). O kit Vectastain Elite ABC peroxidase (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) foi utilizado para a detecção de anticorpo secundário. A visualização foi realizada utilizando DAB como um (ab64238 clone, Abcam Cambridge, Reino Unido) substrato. Um patologista examinou os slides de uma maneira cega

Immunoblotting

Para a expressão de ABCB5 (1:1000; PAB9925 clone, Abnova cidade de Taipei, Taiwan)., Nestin (1:200; mab353 clone , Chemicon, Billerica, EUA) e CD271 /NGFR (1:200; clone sc-8317, Santa Cruz, EUA), as células foram cultivadas em placas de 6 cavidades. Em seguida, as células foram libertadas sem digestão enzimática a 4 ° C. Os sedimentos celulares foram sonicados durante 10 segundos e clarificada por centrifugação. A proteína total (50 ug) foi submetido a electroforese em géis de 7,5% de Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA) e foi transferido para membranas de difluoreto de polivinilideno, bloqueados e expostas ao anticorpo primário, seguido de um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. Bandas foram desenvolvidos utilizando um sistema de detecção de ECL Plus (Amersham, Piscataway, NJ). Densidade foi quantificada usando uma câmera CCD controlada por computador (AlphaImager Imaging Systems, Alpha Innotech, San Legndra, CA).

citometria de fluxo e separação de células

Para detectar marcadores de superfície de células de tumor, melanoma as linhas celulares foram tratadas com tripsina ou não enzimaticamente isolada com EDTA e centrifugadas a 1500 rpm /min durante 5 min. [23] Resumidamente, as células foram lavadas com Ca

2 + Mg -livre

2 + livre de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), e 4 ml de EDTA 1 mM (Sigma Aldrich) foi adicionado a cada frasco . Os frascos foram incubados a 37 ° C durante 5 minutos e agitou-se lentamente até que as células foram separadas. Dez mililitros de tampão de PBS foi então adicionado a cada frasco e células levantado para tubos, centrifugou-se e lavou-se com Ca

2 + /Mg

2 + livre de PBS. O número de células isoladas foram contadas com um hemacitómetro (Marienfeld, Alemanha). As células foram então recolhidas, lavadas com gelo frio de 0,5% de FBS e 0,02% de azida de sódio em PBS e bloqueou-se com uma solução de 0,5% de FBS e 5 ug /ml de anticorpo anti-CD16 /CD32 (BioLegend, San Diego, EUA) em PBS durante 15 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, as células foram coradas para a APC conjugado anti-rato-CD133 mAb (clone 13A4, eBioscience, San Diego, EUA), a APC-anticorpo anti-CD117 de rato (clone 2B8, eBioscience, San Diego, EUA), marcado com FITC anti- rato Sca-1α (clone D7, eBioscience, San Diego, EUA), CD271 (ab8874 clone, Abcam Cambridge, UK) e anticorpo policlonal de cabra secundário para IgG de coelho (clone ab6108, Abcam Cambridge, Reino Unido) durante 30 min em gelo. As amostras foram então lavadas e analisadas com BD FACSCanto ™ II (BD Bioscience, EUA).

Para que o sistema de separação MACS ® triagem foi utilizado (# 130-090-312, Miltenyl Biotec Inc., EUA) de acordo com a o protocolo do fabricante. Resumidamente: K1735 /células M4 foram coradas com APC conjugado anti-rato CD133-mAb e separação de células prosseguiu com microesferas anti-APC (# 130-090-855, Miltenyl Biotec Inc., EUA). A partição celular foi feito duas vezes com as mesmas células, a fim de enriquecer a população de células positiva CD133. Após a população de células positivas para separação de células CD133 foi lavada com PBS e preparado para injecção (7,5 × 10

4 células /200 uL /​​rato) ou para a verificação por FACS.

Ensaio de Proliferação Celular

As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1000 células por poço com DMEM-MSCM. Após 24, 48 e 72 horas, o crescimento celular foi determinada usando o ensaio de proliferação celular colorimétrico XTT (Beit Haemek, Israel). As amostras foram analisadas com os espectros MR Dynex (Chantilly, EUA).

agar mole Ensaio

-se alíquotas de 10

4 células de melanoma foram ressuspensas em 1 mL, 0,35% de agar em MSCM. As aliquotas foram vertidas em placas de seis poços no topo de uma camada de 1,5 ml de 0,5% de agar em MSCM, deixou-se solidificar e incubados durante 21 dias a 37 ° C na presença de 5% de CO2. Os pratos foram fotografados com um sistema estereoscópico de imagens (estéreo Lumar.V12. Zeiss, Alemanha) e as colónias número por 1 /cm

2 foi estimado após a aquisição usando ImagJ (NIH, Bethesda, MD) software de análise de imagem.

a avaliação da formação de tumor esferoidal e Análise de auto-renovação

a camada de agar inferior 2 ml foi preparado por re-suspensão de 0,5% de agar com MSCM, o qual foi, em seguida, deixada a solidificar em placas de 6 cavidades. Alíquotas de 3 × 10

4 células de melanoma em MSCM foram plaqueadas em condições de suspensão em camada de agar macio e incubados durante 2-16 dias a 37 ° C, na presença de 5% de CO

2 antes da análise.

Esfera análise de diluição limitante (SLDA) foi realizada como previamente descrito. [24] Em resumo, as esferas foram colhidas após 14 dias de armazenamento em condições de suspensão em 6 poços de placas, separadas com tripsina e plaquearam-se novamente em condições não-aderentes em MSCM utilizando alíquotas de diluição de: 1000, 300, 100, 50, 10 células /96 -wells placa. Quatorze dias depois, o número de poços sem formação de esfera foi quantificado e os dados foram log transformados e plotados contra a densidade de revestimento. Uma regressão linear foi utilizada para calcular a frequência de células capazes de proliferar para formar uma esfera de melanoma.

quantitativa de transcrição reversa-PCR

O ARN total foi extraído a partir de linhas de células de melanoma de ratinho, utilizando um Mini RNeasy kit (Qiagen, Holanda), de acordo com as instruções do fabricante. RNA purificado foi quantificado utilizando um espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., EUA). O ADNc foi sintetizado a partir de 200 ng de ARN total, utilizando o kit de ADNc VersoTM (Thermo Scientific, Epsom, Reino Unido) e hexâmeros aleatórios. amplificação de PCR de cDNA foi realizada utilizando o Platinum® SYBR® verde qPCR SuperMix UDG-com ROX (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY EUA) em um sistema Passo Um Mais PCR em tempo real (Applied Biosystems) com os pares de oligonucleótidos específico para o gene (Sigma Aldrich, Israel). Cada gene foi verificada por três pares de iniciadores diferentes, listados na Tabela S1. Para assegurar a especificidade das condições de reacção, no final das corridas individuais, a temperatura de fusão (Tm) dos produtos amplificados foi medido para confirmar a sua homogeneidade. As condições de amplificação foram como se segue: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 30 segundos para um total de 40 ciclos. Cada amostra foi analisada em triplicado. Para quantificação, as curvas padrão foram obtidas usando o ADNc amplificado diluído em série no mesmo PCR em tempo real de execução. Os resultados foram normalizados para níveis ACTB e de mRNA 18S. O método 2-ΔΔCT foi aplicado para analisar as mudanças relativas na expressão do gene. Após o procedimento de quantificação, os produtos foram resolvidos por electroforese em gel de agarose a 2,5% para confirmar que a reacção estava amplificado os fragmentos de ADN do tamanho esperado.

Análise estatística

Student

t

análises ou testes entre os grupos (ANOVA) foram utilizados para análise estatística conforme o caso. Foram consideradas significativas as diferenças

P Art 0,05. Todos os dados são representados como média ± DP, a menos que indicado de outra forma. Todas as experiências foram repetidas em triplicado. Os dados de experiências representativas são mostrados.

In vivo

experimentos consistia em 10-15 ratos em cada grupo experimental.

Resultados

A fim de avaliar a correlação entre a célula cancerosa potencial de auto-renovação e destino celular, selecionamos células de melanoma murino, que foram derivadas da mesma linha de células parental, mas que possuem diferentes fenótipos

in-vivo

e

in-vitro

. A linha celular de melanoma de murídeo K1735 tem sido amplamente utilizado para estudar o melanoma [25]. Esta linha celular, que tem uma baixa propensão para formar metástases, foi induzida em ratinhos C3H /HeN pela exposição crónica à radiação ultravioleta B. Para nosso estudo, nós escolhemos três linhas celulares, que foram derivadas desta linha celular parental, mas que diferiam significativamente no seu potencial tumorigénico, capacidade de formação de esfera e clonogenicidade [26], [27], [28]. A K1735 /16 é uma linha celular não metastática e a linha de células K1735 /M4 foi derivada a partir de uma metástase do pulmão e tem um elevado potencial metastático. Uma linha celular terceiro, K1735 /16S, foi derivada da linha celular K1735 /16, mantendo as células em suspensão condições não-aderentes durante 16 dias. Todas as três linhas celulares exibiu cinética de proliferação semelhantes quando cultivadas em placas de cultura (Fig. 1a).

(A) taxa de proliferação celular em placas tratadas de cultura foi determinada após 96 horas, utilizando o ensaio de XTT. Os dados são a média ± DP de pelo menos três experiências independentes realizadas em triplicado. (B) O número médio de colónias cultivadas em agar mole após 21 dias em cultura. Os dados são do ± SD média de cinco campos de alta potência (P 0,001). (C) imagens microscópicas representativos de esferóides de tumor 21 dias após o plaqueamento. (D) imagens microscópicas representativos de esferóides tumorais, 6 dias após o plaqueamento em condições não-aderentes.

potencial formação

As células tumorais macio Agar Colony e Spheroid cultivadas em tridimensional multicelular esferóides são considerados por muitos um confiável

in-vitro

modelo que reproduz algumas das características complexas de tumores sólidos [29]. Em primeiro lugar, procurou caracterizar a clonogenicidade e capacidade de formação de esfera de três linhas de células K1735 /16, K1735 /16S e K1735 /M4 no agar mole. A linha de células K1735 /16 cultivados em agar macio, não formaram colónias após 21 dias em cultura (Fig. 1B e C). Por outro lado, tanto o /linha de células metastática M4 K1735 e K1735 a linha celular /16S proeminente tinha uma capacidade de formação de colónias (Fig. 1B e 1C). A seguir, examinou se a mesma heterogeneidade fenotípica é sustentada em suspensão condições não aderentes, o que é visto por muitos como a melhor aproximação da

in-vivo tumorigenicidade

entre os vitro em ensaios [30], [31 ],, 33, 34 [32] [] []. A capacidade de formação de esfera foi avaliada 6 dias após o plaqueamento com MSCM. Como se mostra na figura 1D, o K1735 /M4 e K1735 /16S linhas de células mostraram uma capacidade de formação de esfera proeminente, enquanto que a linha de células K1735 /16 não conseguiu crescer nestas condições de stress. No entanto, quando as células K1735 /16 foram mantidos nestas condições durante 16-20 dias, alguns esferóides poderia ser detectado em algumas das placas.

stemness Potencial

Para avaliar a auto-renovação potencial de as três linhas de células, foi realizada uma série de ensaios de diluição através da utilização de SLDA em meios isentos de soro, dirigidos para examinar a capacidade de uma análise de diluição limitante das células de melanoma para formar esferóides em condições não-aderentes e estabelecida uma frequência análise de formação de esfera melanoma. [24], [35], [36] Todas as três linhas de células tinha um potencial de proliferação semelhantes quando plaqueadas em placas de 96 poços de placas de cultura em condições normais (Fig. 2a). Em contraste, o potencial de auto-renovação, em meio isento de soro da linha celular não metastática, K1735 /16, diferiam significativamente das outras duas linhas celulares. SLDA realizada após a segunda repropagação revelou que a frequência de células capazes de auto-renovação foi 1/216 para a linha de células K1735 /M4, 1/296 para a linha de células K1735 /16S e 1/36733 para a linha de células com K1735-16 MSCM (Fig. 2). Além disso, K1735-16 células não foram capazes de formar esferas em condições adeherent, ao passo que as células K1735 /M4 sphares em meio isento de soro formados espontaneamente.

SLDA realizada após a segunda repropagação com MSCM revelou que a frequência de células capazes de auto-renovação foi A. 1/216 para a linha de células K1735 /M4, B. 1/296 para a linha de células K1735 /16S e C. 1/74720 para a linha de células K1735-16. A intercepção de log (37% poços negativos) foi usado para calcular a frequência de formação de esfera (ver materiais e métodos).

Em conjunto, estes dados sugerem uma heterogeneidade fenotípica de células de melanoma murino individuais, que foram derivados a partir da mesma linha celular parental. O potencial de auto-renovação no ensaio de suspensão não-aderente é comparável com a capacidade de formação de esfera e o ensaio de clonogenicidade em agar mole.

potencial tumorigénico em ratinhos SCID

Em seguida, procurou-se avaliar o potencial tumorigénico das três linhas de células em ratinhos imunocomprometidos utilizando injecções intra almofada da pata ortotópicos. Esta foi avaliada através da injeção de 2 × 10

5 recentemente dissociados K1735 /16, K1735 /M4 e K1735 /16S células cancerosas na planta da pata de camundongos SCID. Tumores palpáveis ​​eram evidentes em todos os ratinhos no prazo de 20 dias. Como mostrado na Figura 3A, a linha de células metastática, K1735 /M4, apresentou o mais alto cinética de crescimento, seguindo-se a linha de células K1735 /16S, ao passo que a linha celular não metastática 1735-1716 /não-colonogenic tinha o potencial de crescimento de tumor mais baixo (N = 6-7 ratinhos por grupo,

P

0,001). Estes dados sugerem que o potencial de auto-renovação

in-vitro

pode prever o

in-vivo

potencial tumorigénico em ratinhos SCID.

linhas de células de melanoma (a) (2 × 10

5) injectados com a almofada da pata de ratinhos SCID. A linha de células K1735 /M4 mostrou a cinética maior crescimento do tumor, seguindo-se a linha de células K1735 /16S. A linha de células K1735 /16 tiveram o crescimento mais lento de tumores (n = 5-6 por grupo, P 0,001). (B) A mesma concentração de células injectadas na almofada da pata de ratinhos C3H /HeN singeneicos. Desta vez, o K1735 /M4 e K1735 /16S mostrou mínima potencial tumorigénico, enquanto que a linha de células K1735 /16S teve a maior kinetc o crescimento do tumor (experiências realizadas 3 vezes consecutivas com n = 10-15 animais por grupo; P 0,001 entre o K1735 /16 e o ​​K1735 /M4 ou o K1735 /16S linhas celulares). (C) características histológicas representativas de tumores cultivados em animais imunocompetentes, 16 dias após o implante. (D) A análise imuno-histoquímica com anti-Ki-67 Ab (um marcador de proliferação) que mostra a expressão semelhante nas três linhas celulares. (E) coloração imuno-histoquímica com anti-Melan A Ab (um marcador melanoma) mostraram expressão positiva em todos os tumores, mas não no tecido normal adjacente.

potencial tumorigénico em ratinhos imunocompetentes

em seguida, queríamos avaliar se o potencial tumorigénico das três linhas celulares, como revelado pelos dois

in-vivo

e

in-vitro

ensaios descritos acima, pode prever o destino real de células cancerosas em animais imunocompetentes. Esta questão só pode ser tratada em modelos do rato sing�icos que podem refletir a reação imune anti-tumor ea resposta microambiente. Portanto, nós repetimos as injeções intra coxins plantares anteriormente realizadas em ratinhos SCID, mas desta vez usando camundongos C3H /ave sing�icos.

Para nossa surpresa, o destino das células cancerosas no modelo singênica era completamente o oposto do que isso previamente descrito em ratinhos SCID. Tal como mostrado na Figura 3B, K1735 células /16 injectada na almofada da pata intra de ratinhos C3H /HeN mostrou a cinética do crescimento do cancro mais elevadas, ao passo que apenas um pequeno número de animais desenvolveram tumores após a injecção do K1735 /M4 ou linha de células K1735 /16S (experiências realizada 3 vezes com n = 10-15 ratinhos por grupo,

P

0,001). A análise histológica de tumores com H E, e coloração imuno-histoquímica com anti-Ki67 Ab (um marcador de proliferação) ou anti-Melan-A AB (um marcador de melanoma) revelou expressão semelhantes destas proteínas pelas três tumores derivados de linhas celulares de cancro ( Fig. 3D-E). Outras análises de tumores individuais revelou que todos os ratinhos injectados com a almofada da pata de ratinhos C3H singeneicos /HeN com a linha de células K1735 /16 apresentaram tumores macroscópicos 30-100 dias após a injecção (Fig. 4A). Em contraste, alguns ratinhos injectados com o K1735 /M4 ou K1735 linhas celulares /16S realmente desenvolvidos pequenos tumores 40 dias após a injecção, mas estes tumores regrediram espontaneamente em 90-100% dos ratinhos no espaço de 80 dias após a experiência foi iniciada (Fig. 4B e C).

(A-C) os gráficos mostram as curvas de crescimento do tumor de todos os três linhas de células em ratinhos singénicos, 1-100 dias após a injecção de 2 × 10

5 células. Cada gráfico mostra o desenvolvimento do tumor em cada animal (n = 5 por grupo).

regressão tumoral espontânea na K1735 /M4 e K1735 linhas celulares /16S pode ser devido a células em apoptose dias após a implantação ou As células restantes dormente durante um longo período de tempo. Estudámos, portanto, o número de células apoptóticas nestes tumores 40 dias após a injecção em almofadas plantares de ratinhos C3H /HeN. análise TUNEL de apoptose revelou números significativamente maiores de células em apoptose em tumores derivados de linha K1735 /celulares 16S e K1735 /M4, em comparação com que os tumores na K1735 /16-derivados (Fig. 5). Esta constatação indica que o potencial tumorigénico do melanoma é específico do ensaio e que o

in-vivo

heterogeneidade fenotípica de diferentes subpopulações de células em animais normais não podem ser previstas apenas pelo seu potencial stemness.

A apoptose foi avaliada utilizando o ensaio TUNEL. (A-C) representativos imagens microscópicas (ampliação de X20) de células de FITC-positivos apoptóticas tumorais (verde) e contra-coloração com iodeto de propídio (vermelho). (D) percentagem de células apoptóticas foi quantificada por o número médio de células de FITC-positivos em 6 campos microscópicos de alta potência. Os dados são expressos como a média + SD (n = 6 tumores, P 0,001). análise TUNEL revelou que o número de células em apoptose em tumores derivados de linha K1735 /16 células foi significativamente menor do que na K1735 /16S e tumores K1735 /M4 linhas celulares derivadas.

Expression perfil de célula-tronco marcadores

a evidência sugere que as células tumorigénicas pode ser distinguido a partir de células não tumorigénicas com base na expressão de marcadores específicos. Por conseguinte, foi examinada a capacidade das células estaminais marcadores relatados para prever o fenótipo clínico de as três linhas de células de melanoma. Foi mostrado anteriormente que a c-Kit, CD133 e CD271 ensaios de expressão pode distinguir tumorigénico de células de melanoma não tumorigénicas [13], [37], [38], [39]. Também foi investigada a expressão de Sca-1α, que foi mostrado estar relacionado com o potencial tumorigénico em cancros da mama, da próstata e do pulmão [13], [37], [38], [39]. Estudámos, portanto, a expressão destes marcadores por citometria de fluxo em todas as três linhas de células. As células foram destacadas usando clivagem de tripsina ou em condições de livre-enzimáticos utilizando EDTA. A Figura 6-células tratadas com tripsina e Figura S1-EDTA células tratadas mostra que c-Kit, CD133 e CD271 células positivas foram detectadas apenas na minoria das células. Em contraste, a expressão Sca-1α foi encontrada em 50% das 16 células /K1735, mas não nas outras linhas de células. Estes resultados foram confirmados por RT-PCR quantitativo análises.

A expressão de marcadores de células-tronco foi determinada utilizando anti-Sca-1α, c-Kit, CD133 e CD271 Abs. Ao contrário de outros marcadores, SCA-1α foi expressa em 50% das células da linha de células K1735 /16, mas não nas outras linhas de células. Os resultados são de uma de três experiências representativas. A percentagem de células positivas e marcadores são mostrados no canto superior direito. células de melanoma B16 de rato, de medula óssea (BM) ou células cerebrais (BC) foram usados ​​como controles positivos.

Nós ainda procurou identificar outros marcadores CSC expressas por células de melanoma, que pode prever o seu fenótipo tumorigénico. Assim, nós analisamos outros 16 marcadores mostrado previamente para ser expresso em CSCs [12], [13], [21], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Usando a análise de RT-PCR quantitativo não fomos capazes de detectar maior expressão de ABCG2, ABCB5, CD20, CD24, CD34, CD44, CD166, Oct4, Cripto-1, CD-90, Gli1 ou Sox2 em qualquer um dos K1735 /M4, K1735 /16S e /16 linhas celulares de K1735 (Fig. 7). Confirmou-se estes resultados em alguns dos marcadores por Western blot (Fig. 8). Curiosamente, três marcadores nanog, ALDH3A1 e nestina, foram expressos na linha celular K1735 /16, mas não na sua linha de célula filha K1735 /16S ou na linha de células metastática K1735 /M4. No total, foram rastreados 19 marcadores diferentes que foram previamente sugeridas para ser associada com o potencial tumorigénico de células de cancro, e em todos eles, as linhas de células altamente tumorigénicas K1735 /M4 e K1735 /16S tinham expressão semelhante ou inferior em comparação com o linha de células de baixa tumorigénico.

a expressão relativa de 15 marcadores anteriormente sugerido para uso de prever o potencial de auto-renovação das células cancerosas. ALDH3A1, Nanog e nestina são expressos na maior parte na linha de células K1735 /16, mas não no K1735 /16S e linhas de células K1735 /M4. Outros marcadores de células estaminais, incluindo SOX2 não mostrou qualquer expressão diferencial entre as três linhas de células. Os dados são a média ± DP de três experiências diferentes. células da medula óssea recém-dissociados e cérebro foram utilizados como controlos positivos (coluna da direita).

Estes marcadores foram previamente sugerido para uso de prever o potencial melanoma auto-renovação. astrócitos de murídeo (AST) HTB-72 linha celular de melanoma humano e foram utilizados como controlos positivos. Note-se que o único marcador que foi expressa pelas linhas de células de melanoma murino foi Nestine, que foi expressa na linha celular não metastática (K1735 /16).

Finalmente, procurou-se confirmar os resultados por celular clonal de classificação no nível da célula única. Este ensaio foi dirigido para determinar se sub-populações de K1735 /M4 pode dar origem a clonogenicidade melhorada e de auto-renovação.