Abstract
Fundo
pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) tem um prognóstico sombrio . O alto risco de recorrência após ressecção cirúrgica fornece a base racional para a terapia adjuvante. No entanto, apenas um subconjunto de pacientes beneficiar da terapia adjuvante. Identificação de marcadores moleculares para predizer o resultado do tratamento é, portanto, justificado. O objetivo do presente estudo foi avaliar se a expressão de novos biomarcadores candidatos, incluindo microRNAs, pode prever o resultado clínico em pacientes PDAC tratados com terapia adjuvante.
Metodologia /Principais Achados
formalina-fixo espécimes embebidos em parafina a partir de uma coorte de 82 casos PDAC coreanas ressecados foram analisados quanto à expressão da proteína por imuno-histoquímica e por expressão microARN quantitativa utilizando PCR em tempo real. Riscos proporcionais de Cox análise do modelo no subgrupo de doentes tratados com a terapia adjuvante (n = 52) mostrou que inferior a mediana miR-21 de expressão foi associada com uma proporção significativamente mais baixa de risco (RR) de morte (HR = 0,316, IC de 95% = 0,166-0,600; P = 0,0004) e recorrência (HR = 0,521; IC95% = 0,280-0,967; P = 0,04). estado de expressão de miR-21 emergiu como o biomarcador preditivo mais único para o resultado do tratamento entre todos os 27 biológica e 9 fatores clínico-patológicos avaliados. Nenhuma associação significativa foi detectada em pacientes não tratados com terapia adjuvante. Em uma coorte de validação independente de 45 tecidos congelados PDAC de casos italianos, todos tratados com terapia adjuvante, inferiores a mediana miR-21 expressão foi confirmado para ser correlacionado com maior sobrevida global, bem como livre de doença. Além disso, a transfecção com anti-miR-21 aumentou a quimio-sensibilidade das células PDAC.
Conclusões Significância
Baixa expressão de miR-21 foi associado a beneficiar de tratamento adjuvante em duas coortes independentes de casos PDAC, e anti-miR-21 aumentou a atividade anticancerígena de drogas
in vitro
. Estes dados fornecem evidências de que miR-21 pode permitir a estratificação para a terapia adjuvante, e representa um novo alvo potencial para a terapia em PDAC
Citation:. Hwang JH, Voortman J, Giovannetti E, Steinberg SM, Leon LG, Kim YT, et ai. (2010) Identificação de MicroRNA-21 como um biomarcador para chemoresistance e evolução clínica após a terapia adjuvante em ressecável cancro do pâncreas. PLoS ONE 5 (5): e10630. doi: 10.1371 /journal.pone.0010630
editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |
Recebido: 23 Janeiro, 2010; Aceito: 20 de abril de 2010; Publicado em: 14 de maio de 2010
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita
Financiamento:. Em parte financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, programa intramural National Cancer Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte relacionada com cancro e nas últimas décadas pouca melhoria na sobrevida tem sido observado, apesar dos esforços de investigação extensas [1]. Cerca de 95% dos cânceres de pâncreas exócrinas são adenocarcinomas pancreáticos ductal (PDAC), dos quais incidência tem aumentado de forma constante nas últimas décadas [1], [2]. A cirurgia é viável em 15-20% dos pacientes, mas, mesmo após a ressecção completa, o prognóstico permanece sombrio, com uma taxa de sobrevida em 5 anos ficando em 10-20% [3].
O câncer de pâncreas é notoriamente resistente a quimioterapia e radioterapia. O tratamento adjuvante é modestamente eficazes e podem ter toxicidades significativas. Por conseguinte, o papel da terapia adjuvante em cancro do pâncreas e operável ainda não é claro, embora geralmente pensado para beneficiar um subconjunto de pacientes [4], [5]. Ser capaz de identificar este subconjunto seria um grande avanço no tratamento desta doença, uma vez que permitiria a estratificação dos pacientes para o tratamento adjuvante [6]. Portanto, marcadores de previsão da sensibilidade à terapia adjuvante, assim como novos alvos terapêuticos são urgentemente necessários nesta doença [7], [8].
expressão alterada de vários factores tem sido associada a comportamento agressivo PDAC e prognóstico. Por exemplo, entre todos os cânceres, PDAC tem a maior frequência de
K-Ras
mutações, o que levou à especulação sobre a sua aplicação como um diagnóstico, bem como um marcador de prognóstico [7]. O produto de proteína de
K-Ras
é uma proteína de ligação ao GTP de mediar um número de funções celulares críticas, incluindo a proliferação, a sobrevivência celular e a motilidade. No entanto, a maioria das evidências, até o momento, sugere que
K-ras
mutações não estão significativamente associados com a sobrevivência em pacientes com câncer pancreático [9], [10]. Outros estudos sugeriram o significado prognóstico da expressão alterada de proteínas envolvidas na via de sinalização de Ras, tais como Akt. No entanto, os níveis de expressão Akt fosforilada foram associados com a sobrevida mais curta e mais longa em pacientes PDAC ressecáveis [11], [12]. Outros marcadores relatados como preditores independentes de PDAC prognóstico incluem p16, metaloproteinase 7 (MMP-7) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) expressão [13]. Ainda assim, muitos aspectos biológicos que regulam esta doença ainda são pouco compreendidas e nenhum marcador foi mostrado para predizer com precisão o resultado clínico.
Nos últimos anos, tornou-se claro que a expressão da proteína pode também ser regulada por microARNs (miARNs ) [14]. MicroRNAs são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes que interagem com os ARNm de genes que codificam para dirigir a sua pós-transcricional repressão [15]. MicroRNA foram mostrados para ser envolvido no crescimento do tumor e oncogénese, e também jogar um papel importante na quimiorresistência [16] – [19]
Além disso, a expressão de microRNAs é específico de tecido, e certos histotipos cancerosas. podem ser classificados com base em perfis de expressão microRNA [20], [21]. No câncer de pâncreas, vários miRNAs foram relatados para ser expressas de forma aberrante, incluindo microRNAs com papéis-chave no cancro, tais como “onco (gênicas) -miRs”, miR-21 e miR-155, e “miRs supressores de tumor”, miR- 29b e o miR-34 e let-7 famílias [22] – [29]. Estudos pré-clínicos em células PDAC exógeno mostraram que o miR-34 sobre-expressão foi associada com reconstituição da função supressora de tumor dependente de p53 em células deficientes em p53, bem como a inibição da auto-renovação das células estaminais cancro pancreático [30]. -Regulação de let-7 está associado com inversão de epitelial para mesenquimal (EMT) em células de gemcitabina-resistentes [31]. MicroRNA-29b pode ter como alvo de novo ADN metiltransferase 3A e 3B (DNMT3A e DNMT3B) e levar a hipometilação global e a sobre-expressão de vários genes supressores de tumores, incluindo p16 [32]. expressão MicroRNA-21 está associada com o aumento da proliferação, as propriedades invasivas, e quimiorresistência gemcitabina e de um estudo anterior demonstrou que a elevada miR-21 de expressão, tal como determinado por hibridação in situ, foi preditiva de sobrevivência mais curtos em pacientes nó-negativo PDAC [28], [33]. MicroRNA-155 está envolvida na repressão de
53 proteína de tumor da proteína nuclear induzida por um
, que é um gene alvo de p53 induzida pelo stress e um efeito pró-apoptótica prognóstico negativo de alta expressão de miR-155 foi observado em uma coorte dos casos PDAC incluindo doentes com doença avançada e /ou R2-ressecção local [34], [35].
o objetivo do presente estudo foi avaliar potenciais marcadores biológicos para prever o resultado da quimioterapia adjuvante. Portanto, temos realizado uma análise integrativa da expressão de miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155 e deixe-7a-2 em uma coorte de pacientes PDAC, com características patológicas e tratamento conhecido . expressão Além disso, investigamos de 20 conhecidos marcadores de proteínas potenciais e metas para a terapia, envolvido em progressão PDAC e prognóstico (Ver Tabela S1 para uma visão completa dos 27 biológica e 9 fatores clinicopatológicos utilizados no estudo) [6], [13 ]. Dado que o carácter expressão de miR-21 emergiu como o marcador mais preditiva único para o resultado do tratamento de todos os factores avaliados em doentes tratados com adjuvantes, a análise posterior da expressão de miR-21 foi realizada em um segundo coorte de 45 pacientes, todas tratadas com terapia adjuvante. Este conjunto independente confirmou a associação significativa de miR-21 status de expressão com a sobrevida e sobrevida livre de doença. Além disso, a associação da expressão de miR-baixo 21 com benefício do tratamento adjuvante foi suportada por
In vitro
dados que demonstram o aumento da quimio-sensibilidade de células PDAC após transfecção com anticorpos anti-miR-21.
métodos
participantes, centros de estudo, detalhes do tratamento
duzentos e quarenta e cinco pacientes submetidos à ressecção cancro do pâncreas com o diagnóstico final de câncer pancreático foram revisados retrospectivamente usando registros médicos eletrônicos durante o período 1999-2007 no Hospital Universitário Nacional de Seul e Universidade Nacional de Seul Hospital Bundang. Entre eles, oitenta e dois pacientes tinham completamente ressecada (R0) e adenocarcinoma pancreático foram incluídos no estudo. estágio do tumor patológico foi determinada de acordo com a Comissão Americana conjunta sobre estadiamento do câncer Cancer (AJCC), 6
th edição [36]. Resumidamente, em fases patológicas T1-2 (pT1-2) envolvimento tumoral é limitada ao pâncreas, o tamanho do tumor a ser menor ou maior do que 2 cm por fases pT1 e pT2, respectivamente. Patológica T3 (pT3) tumores estágio estender além do pâncreas, sem o envolvimento do eixo celíaco ou artéria mesentérica superior, enquanto que os tumores pT4 são caracterizadas pelo envolvimento do eixo celíaco ou artéria mesentérica superior. Quanto ao estágio nodal da linfa, estágio nodal patológica 1 (pN1) indica metástase em linfonodo regional. Finalmente, M1 indica a presença de metástases à distância. fases da doença I, IIA, IIB, III e IV indicam “pT1-2 pN0 M0”, “pT3 N0 M0”, “pT1-3 pN1 M0”, “pT4 qualquer N M0” e “qualquer pT qualquer pN M1”, respectivamente . Os pacientes receberam quimioterapia adjuvante, radioquimioterapia combinada (CCRT) ou ambos (n = 52), ou não receberam tratamento (n = 27). o estado do tratamento de três pacientes era desconhecida. A quimioterapia adjuvante e quimio-radioterapia consistiu de combinações de gencitabina ou 5-fluorouracilo (5-FU). amostras FFPE foram revistos para o diagnóstico e o conteúdo do tumor no Hospital da Universidade Nacional de Seul, assim como no Instituto Nacional do Câncer, NIH, Bethesda, MD. A coorte de validação foi composta por amostras congeladas de 45 pacientes italianos adenocarcinoma do pâncreas consecutivos diagnosticados no período 2001-2004 no Centro de Referência Regional para a doença Pancreatic Tratamento, Hospital Universidade de Pisa, Pisa, Itália [37]. O tratamento adjuvante consistiu no tratamento de modalidade combinada à base de gemcitabina. Detalhes de regimes adjuvantes estão listadas na Tabela S2.
Ética
Paciente aprovação consentimento e estudo foi obtido a partir dos locais Institucionais Review Boards de acordo com as normas legais dos países participantes. consentimento informado por escrito foi obtido de pacientes coreanos que ainda estavam vivos no momento do estudo através do banco de tecidos humanos. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Centro de Pesquisa Clínica Humano. No que diz respeito pacientes italianos, foi obtido consentimento por escrito. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Pisa.
Imunohistoquímica
A expressão de 20 proteínas marcadores e alvos para a terapia foram estudados por imuno-histoquímica (IHQ). Como relatado na Tabela S1 foram avaliados os níveis de expressão dos seguintes marcadores: factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), metaloproteinase-2 de matriz (MMP2), metaloproteinase-7 de matriz (MMP7), metaloproteinase-9 da matriz (MMP9), inibidor de tecido de metaloproteinase-3 (TIMP3), receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), reparação de excisão de grupo trans-complementação 1 (ERCC1), quimioquina (motivo CXC) do receptor 3 (CXCR3), quimioquina (motivo CXC) receptor 4 (CXCR4), anfirregulina, epirregulina, factor de crescimento de hepatócitos (HGF), a neuropilina, factor de crescimento semelhante a insulina 1 beta do receptor (IGF-1R), Ron β, c-Met, fosforilado-c-Met (PC-Met), a timidilato sintetase (TS), E -cadherin, e a subunidade M1 a ribonucleótido-redutase (RRM1). tissue microarray (TMA) seções foram construídos utilizando biópsias de tecidos núcleo (2 mm de diâmetro) obtidas a partir de amostras de cancro individuais embebidos em parafina coreano pancreáticas. As biópsias foram incluídos nos novos blocos de parafina receptor utilizando um aparelho de trephine (Superbiochips Laboratories, Seul, República da Coreia). Cada bloco de arranjo de tecido continham até 50 núcleos e 2 blocos de matriz foram preparados durante o estudo.
seções TMA foram desparafinados utilizando xileno, re-hidratadas em álcool e coradas com anticorpos específicos como listadas na Tabela S3. Para ERCC1, o H-score indica a intensidade da coloração (de 0 a 3), multiplicada por um factor determinado pela proporção de células positivas: 0 se células positivas para 0%, 0,1%, 09/01, se se 0,5 10-49%, uma Se 50% de células positivas. Para todos os outros factores, a coloração positiva entende-se um sinal de intensidade igual ou superior a 2 e mais do que 20% de células positivas.
expressão MicroRNA
O ARN foi isolado a partir de secções FFEP o RECOVERALL total Nucleic kit de isolamento de ácido (Ambion, Austin, TX) e a partir de secções de tecido congeladas, conforme relatado anteriormente [38]. ARN (10-100 ng) foi utilizado para a análise de miR-21 (coorte italiano) ou miR-21, o miR-29, o miR-34a /b /c, deixa-7a-2, e miR-155 (coorte coreana expressão ) por quantitativa PCR em Tempo real (qRT-PCR) com os ensaios TaqMan-microRNA e os 7900 HT-fast PCR em Tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando pequena U66 RNA nuclear ou RNU43, como os controles de normalização endógenos para os espécimes coreano e italiano, respectivamente. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e resultados que não preencheram os critérios de controle de qualidade metodológicas foram omitidos. Quantificação da expressão de microARN relativa foi realizada utilizando o método Ct Delta. Expressão foi determinada como alta quando o nível de expressão foi igual ou acima da mediana da coorte e de baixo quando estava abaixo da mediana da coorte.
Os estudos in vitro
Os humanos PDAC linhas celulares BxPC3 , HPAF-II, HPAC, PANC-1 e PL45 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), e foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina (50 UI /ml) e estreptomicina (50 ug /mL) (Gibco, Gaithersburg, MD). As células foram mantidas a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO
2 em 75 cm
2 frascos de cultura de tecidos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha) e colhidas com tripsina-EDTA em seu crescimento exponencial Estágio. O ARN foi extraído utilizando um protocolo de Trizol-clorofórmio (Sigma, St. Louis, MO). rendimento e integridade de ARN foram verificadas por medição da densidade óptica a 260/280 nm com um espectrofotómetro Nanodrop®.
A expressão basal de miR-21 foi avaliada por quantitativa-PCR em tempo real, como descrito acima para os tecidos PDAC . Quantificação da expressão de miR-21 foi realizada utilizando o método Ct Delta, normalizar os dados de amplificação Ct com RNU43. miR-21 os níveis de expressão relativa foram expressos em unidades arbitrárias (UA).
de inibição do crescimento celular por 5-FU (0,1-1000 | iM), e gemcitabina (0,1-1000 nM) mais a irradiação (100 cGy), foi determinado a partir de três experiências separadas, utilizando o ensaio SRB (sulforrodamina-B), e foi expressa como a percentagem do controlo (células tratadas com veículo) absorvância, corrigida para a absorvância, antes da adição do fármaco, tal como descrito anteriormente [39]. Para a irradiação, as células em crescimento exponencial foram plaqueadas em placas de 100 mm de cultura de tecidos (Costar), deixou-se aderir durante 24 horas, e irradiado utilizando um acelerador linear de 6 MV fotão (General Electric, Buckinghamshire, Reino Unido). Após a irradiação, as células foram colhidas e 10
4 células /poço foram semeadas em placas de 96 poços e deixadas a crescer durante mais 48 h em meio isento de droga ou tratados com gemcitabina, como descrito anteriormente [40]. A concentração inibidora de 50% (IC
50) de crescimento de células para cada linha celular foi determinada por não-linear de mínimos quadrados curva de ajuste das curvas de dose-resposta (o GraphPad Prism Versão 5, software intuitivo para Ciência, San Diego, CA ). O efeito de miR-21 sobre o crescimento celular e a quimiossensibilidade foi avaliada através da transfecção das células com os oligonucleótidos anti-sentido (anti-miR-21) adquirido a Applied Biosystems Ambion-(Ensaio de identificação, AM10206), em 30 nM de concentração final. As células foram plaqueadas a 200.000 células /poço em 3 ml de RPMI com 10% de FBS e 1% de antibióticos. Após 24 h as células foram expostas a 9 oligofectamine ul (Invitrogen, Paisley, UK) em meio isento de soro, misturou-se durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido pela adição de 3 ul de 6,25 uM miR-21 precursora ou inibidor. As células foram também incubadas com controlos negativos e miARN FAM marcado com anti-Mir (Ambion). Após 24 horas o meio foi removido dos poços e substituído com meio RPMI com 10% de FBS, sem antibióticos. Em seguida, as células foram colhidas por tripsinização e transferidos para uma placa de 96 cavidades, onde foram deixadas a crescer durante mais 48 h em meio isento de fármaco ou tratadas com 5-FU, como descrito acima. Os poços de controlo adicionais foram utilizados para a extracção de ARN, tal como descrito acima, enquanto que a eficiência de transfecção com controlos anti-mir marcado com FAM foi avaliada por microscopia de fluorescência.
Métodos estatísticos
Comparações de parâmetros foram dicotómicos feita entre dois grupos usando o teste exato de Fisher. Uma versão generalizada do teste exato de Fisher foi utilizado para comparações de idade, estágio do tumor e grau de diferenciação quando dividido em três categorias [41]. A probabilidade de sobrevivência global (OS) ou sobrevida livre de doença (DFS) como uma função de tempo foram determinadas pelo método de Kaplan-Meier, com um teste de log-rank utilizado para determinar a significância estatística da diferença de curvas de Kaplan-Meier [42], [43] Para os fatores prognósticos univariadas análises, casos em que os pacientes foram finalmente agrupadas em duas categorias, determinada após avaliação preliminar das quatro categorias utilizando os quartis da distribuição do parâmetro de agrupamento, teve o valor p ajustado por multiplicando-se o valor de p não ajustados por três. Isso explicaria o teste implícito que resultou em uma decisão de colocar os pacientes em duas categorias, com uma diferença de prognóstico maior entre os grupos. A riscos proporcionais de análise do modelo de Cox foi realizada para determinar a associação conjunta de fatores inicialmente encontrados para ter potencial associação com a evolução nas análises univariadas (avaliando nesta
modelo final
apenas os parâmetros com p não corrigida 0,10 a partir de um log teste -rank) [44]. Todos os valores-p são bicaudais, e exceto conforme mencionado acima, são apresentados sem ajuste para comparações múltiplas.
Todos os
in vitro
experimentos foram realizados em triplicado e repetidas pelo menos duas vezes. Os dados foram expressos como valores médios ± SE e analisadas pelo teste t de Student e /ou teste de Mann Whitney. A significância estatística foi estabelecido em p 0,05
Resultados
Características dos pacientes
A tabela 1 resume as características clínico-patológicas.. Nos pacientes coreanos, OS mediana e DFS foram 18,1 e 9,1 meses, respectivamente. Nesta coorte SO foi significativamente mais longa para os pacientes tratados com quimioterapia e /ou CCRT (n = 52): sobrevivência média foi de 21,3 vs 14,7 meses para os pacientes tratados versus não tratados com a terapia adjuvante (n = 27); p = 0,017. Veja a Figura S1 para as parcelas de Kaplan-Meier.
Resultados da análise da expressão
A expressão de miR-21, miR-34a, miR-155 e deixe-7a era detectável em todos os 82 casos , e expressão de miR-29b, o miR-34b, e miR-34c em 81, 73 e 80 casos, respectivamente. De acordo com estudos anteriores que mostraram que o miR-34b e 34c-miR partes do mesmo promotor de transcrição [45], os valores destes miARNs expressão foram correlacionados (dados não mostrados). Resultados IHC estavam disponíveis para neuropilina e MMP-9 em 80 casos, a anfiregulina, o HGF, EGFR e TIMP3 em 79 casos, para Ron, CXCR-3, E-caderina, RRM1, IGF-1R, TS, VEGF, MMP-2 e MMP-7, em 78 casos, para CXCR-4 em 77 casos, para c-Met e Met-Pc em 76 casos, para ERCC1 em 75 casos e para epirregulina em 73 casos.
Tal como descrito no secção de métodos, para cada uma das proteínas que teve a intensidade de coloração e a percentagem de células coradas positivamente. Na Figura S2, imagens representativas de coloração imuno-histoquímica da P-c-Met são mostrados. A Tabela 2 resume os resultados de coloração imuno-histoquímica para todas as proteínas estudadas.
A análise univariada
Um total de 36, variáveis de microRNA e proteína clínico-patológicos foram avaliados quanto à sua associação com o sistema operacional ou DFS na coorte coreano. Com base na análise univariada, um conjunto de 10 e 12 parâmetros foram considerados para avaliação nos modelos de Cox para OS e DFS, respectivamente (ver Tabela S4). Os parâmetros selecionados foram também testados de acordo com o estado do tratamento adjuvante (Tabela S4). Além disso, para qualquer parâmetro, a população foi dividido em 4 grupos de comparação: (1) parâmetro negativo, (2) nenhum parâmetro negativo versus tratamento adjuvante, adjuvante versus tratamento (3) parâmetro positivo, não vs tratamento adjuvante (4 ) parâmetro positivo, o tratamento adjuvante. Tabela S4 lista apenas combinações com um valor de p 0,10. Notavelmente, foi demonstrada uma forte interação de miR-21 status de expressão e de tratamento adjuvante de status para OS e DFS. Baixa expressão de miR-21 foi associada com mais OS e DFS nos pacientes adjuvantes tratada, com valores de p de 0,016 e 0,02, respectivamente, mas não em pacientes não tratados com terapia adjuvante (p-valores de 0,49 e 0,93, respectivamente). Esta associação diferencial entre o miR-21 e tratamento de estado foi suportada por comparação do subgrupo de baixo miR-21, os pacientes tratados contra adjuvantes restantes pacientes. O grupo de pacientes com baixo miR-21 que foram tratados com o tratamento adjuvante teve OS mediana e DFS de 27,7 e 16,2 meses, respectivamente. Os demais pacientes tiveram sobrevida média de 14,3 e DFS de 7,0 meses, com valores de p de 0,002 para OS e 0,0095 para DFS. Veja também a Figura 1 e Figura S3.
A sobrevida global de acordo com o status de miR-21 em (A) não adjuvante pacientes tratados e (B) pacientes adjuvantes tratada. sobrevida livre de doença de acordo com o status de miR-21 em (C) não adjuvante pacientes tratados e (d) pacientes adjuvantes tratada.
Cens .: censuradas
.
parâmetros que contenham
modelos de Cox para sobrevida global ea sobrevida livre de doença
Usando um algoritmo de seleção para trás, um modelo de Cox foi construído que foram encontrados para ser associado, em conjunto com o OS. Um segundo modelo foi identificado para a determinação do prognóstico de DFS (Tabelas 3 e 4). A partir da análise multivariada entre todos os pacientes, como o parâmetro mais significativamente associada tanto para OS e DFS, pacientes com baixa miR-21 que foram tratados com terapia adjuvante foram mostrados para ter uma taxa de risco significativamente mais baixo (HR) para a morte (0,443, 95% IC: ,263-,748; valor-p 0,002) e para a recorrência (0,358, IC de 95%: 0,188-0,682; valor p: 0,002) em comparação com todos os restantes pacientes. Em contraste, em doentes não tratados com a terapia adjuvante, inferior a mediana miR-21 de expressão não foi associado com uma HR significativamente diferente para a morte ou recorrência de 0.880, os valores de p de 0,76 e 0,30, respectivamente.
Comparação de co-variáveis de acordo com adjuvante tratados vs. pacientes não tratados
Desde que os casos não foram randomizados para tratamento neste estudo, queríamos determinar se houve diferenças significativas na distribuição covariável entre os pacientes tratados e não tratados com a terapia adjuvante (Tabela S5). A única diferença significativa foi a menor idade média no grupo tratado adjuvante em 61 anos (variação: 45-75 anos) vs. 66 anos (variação: 49-83 anos) no grupo não tratado (p-valor: 0,002, Wilcoxon dois -teste de amostra). Ver Tabela S6 para a expressão diferencial de proteínas. Adicionalmente, construiu-se modelos de Cox separadas para os doentes tratados com a terapia adjuvante versus pacientes que não foram tratados com a terapia adjuvante. Em primeiro lugar, fizemos uma análise univariada em ambos os grupos (Tabelas S7 e S8). análise do modelo de Cox demonstra que apenas no subgrupo de pacientes tratados adjuvantes baixo status miR-21 foi associado a uma HR significativamente menor de morte e recorrência (Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7 e Tabela 8). No subgrupo de não adjuvante doentes tratados, invasão angiolifática positiva e expressão de miR-34a acima da mediana foram associados a aumento da frequência cardíaca por morte e recorrência, respectivamente, enquanto que o miR-21 não tem um valor de p suficientemente baixa para inclusão no modelo final.
comparação de co-variáveis de acordo com a miR-21 expressão
Distribuição de co-variáveis clínico-patológicas e IHC foi comparado entre o baixo miR-21 e miR-21 pacientes altos, como relatado na Tabela 9 e Tabela S9. A idade mediana no grupo de baixo miR-21 foi de 63 anos (intervalo: 45-83 anos), não significativamente diferente do grupo alto miR-21, com idade mediana de 64 anos (intervalo: 46-78 anos), p-valor: 0,94 . No entanto, houve uma tendência para um estágio mais avançado AJCC (IIa vs IIb) no grupo de alta expressão de miR-21 (p: 0,07). De igual modo, houve mais casos com pobre grau de diferenciação no grupo elevado miR-21, embora este grupo também continha mais casos com tumores bem diferenciados (Tabela 5). Nós não poderia confirmar uma associação previamente relatada de miR-21 e expressão TIMP3 [46], enquanto descobrimos que Pc-Met e expressão VEGF foi significativamente mais comum em miR-21 casos elevadas (Tabela S9).
Como a alta expressão de miR-34a foi demonstrado estar associada com a diminuição da DFS temos adicionalmente comparados distribuição de co-variáveis clínico-patológicas e IHC entre baixo miR-34a e pacientes miR-34a elevados. Alta expressão de miR-34a-se fortemente associada com elevada expressão de fosfo-c-Met (valor p: 1x10E-6). Além disso, elevada expressão de miR-34a foi associada com baixa expressão de HGF (valor-p: 0,01), bem como elevada expressão de VEGF (valor-p: 0,01). Finalmente, a baixa expressão de miR-21 foi mais frequente em casos de baixa miR-34a. (P-value: 3x10E-8)
High miR-21 expressão mostra associação com o aumento da distância
taxa de recorrência
em seguida, comparamos a taxa de recorrência distante vs. locais da doença no grupo de baixo vs alta expressão de miR-21. No grupo expressão elevada de miR-21 25 de 41 pacientes (61%) tinham doença recorrente num local distante, que foi significativamente diferente do grupo de baixa expressão de miR-21, no qual apenas 12 dos 38 pacientes (32%; com três pacientes perderam para follow-up) experimentando recorrência distante (p: 0,013). Para efeito de comparação, no grupo que recebeu terapia adjuvante 25 de 51 pacientes (49%) tinham doença recorrente. Este não foi significativamente diferente do grupo não tratado com a terapia adjuvante com 11 dos 26 pacientes (42%) apresentaram recidiva à distância (p: 0,63; com 5/82 pacientes ausente devido a dados insuficientes)
Apesar de não ser estatisticamente significativa, alta miR-21, também evidenciou uma tendência para maior palco e estado linfonodal positivo (Tabela 5).
Validação coorte
uma série de 45 ressecado doentes com adenocarcinoma do pâncreas , todos tratados com gemcitabina adjuvante, foi utilizado para validar o papel preditivo de miR-21 de expressão em caucasianos. Median OS e DFS foram 20,4 e 18,7 meses, respectivamente. Ver Tabela 1 para os parâmetros clínico (coorte italiana). expressão miR-21 foi detectável em todas as amostras. A análise univariada mostrou uma tendência de associação significativa entre a diferenciação do tumor pobres e mais curto OS (p: 0,07), enquanto que a ocorrência de infiltração neural foi marginalmente associado significativamente menor DFS (p: 0,047), mas não OS (p- valor: 0,90), como relatado na Tabela S10. Idade, sexo, estágio, linfonodos e infiltração vascular não foram associados com o resultado. Pacientes com elevada expressão de miR-21 teve um sistema operacional significativamente mais curto, isto é, mediana 15,6 comparado com 24,4 meses em pacientes com miR-21 nível de expressão inferiores a mediana (valor p: 0,006). O DFS mediana de pacientes com alta expressão de miR-21 foi 14,0 meses, em comparação com 23,8 meses em pacientes com a baixa expressão de miR-21 (valor-p: 0,0042). Veja a Figura 2 para as curvas de Kaplan-Meier. modelos de Cox foram construídos que confirmou a associação do estado de expressão de miR-21 e duração de sobrevivência, com elevada expressão de miR-21, como o fator único remanescente, associada a um aumento de RH para a morte na CI 3.538 (95%: 1,415-8,849; p -valor: 0,007) e recorrência na CI 4.008 (95%: 1,385-11,595; valor-p: 0,01). análise conjunta das duas coortes confirmou a importância significativa preditivo de miR-21 status de expressão, tal como relatado nas Figuras S4 e S5.
(A) a sobrevivência geral de acordo com o miR-21 status e (B) livre de doença status de sobrevivência de acordo com o status de miR-21.
Cens .: censurado
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miR-21 e os efeitos antiproliferativos de 5-FU em células PDAC
A expressão de miR-21 foi detectável em todas as células PDAC linhas, variando de 4,5 em células PL45 para 1,5 au nas células BxPC-3 (Figura 3A). A inibição dependente da dose do crescimento das células foi observada após tanto de 5-FU, e gemcitabina mais radioterapia tratamento, como mostrado na Figura 3B-C. Em particular, o tratamento com 5-FU resultou em uma inibição modesta do crescimento celular em células PANC-1 e PL45, com IC
50s de 138,4 ± 23,4 uM e 174,2 ± 31,1 uM, respectivamente. Entre as linhas celulares estudadas, BxPC3 e HPAF-II foram os mais sensíveis a gemcitabina e 5-FU, respectivamente, enquanto PL45 foi o mais resistente a ambos 5-FU e gemcitabina mais radioterapia.
(A) MiR -21 expressão em 5 linhagens de células PDAC. A expressão foi determinada por PCR quantitativa, utilizando o método Ct Delta com RNU-43 como uma referência e os valores estão em au. (B-C) curvas representativas do crescimento efeitos inibidores de 5-FU (B) e gemcitabina mais radioterapia (C) , exposição à droga de 48 horas. (D). As células foram semeadas a 10
4 /poço e os efeitos anti-proliferativos foram avaliados utilizando o ensaio de SRB, como descrito nos métodos. O IC significativo
50 valores para o 5-FU (48 h de exposição contínua) foram como se segue: 36,3 uM (BxPC-3), 30,9 uM (HPAF-II), 138,4 pM (PANC-1) e 174,2 uM (PL45 ); enquanto que os valores de IC50 para (gemcitabina em células pré-tratadas com 100 cGray) foram de 2,1 nM (BxPC-3), 3,4 nM (HPAF-II), de 10,2 nM (PANC-1) e 11,4 nM (PL45).