Abstract

O papel do neo-angiogênese no câncer de próstata de crescimento (APC) e metástase está bem estabelecida, mas o desenvolvimento de inibidores farmacológicos eficazes e não tóxicas de angiogénese continua a ser um objectivo inacabada. A este respeito, tendo como alvo a angiogénese aberrante através fitoquímicos não tóxicos pode ser uma estratégia angiopreventive atraente contra APC. A lógica do presente estudo foi comparar o potencial anti-angiogênico de quatro flavonolignans diastereoisom�icos puras, ou seja, Silybin A, B silybin, isosilibina A e B isosilibina, que estabelecemos anteriormente como componentes biologicamente ativos no extrato do cardo de leite. Os resultados mostraram que a alimentação oral destes flavonolignans (50 e 100 mg /kg de peso corporal) inibem eficazmente o crescimento de xenoenxertos DU145 APC humanas avançada. As análises de imuno-histoquímica revelaram que estes flavonolignans inibir biomarcadores tumorais angiogénese (CD31 e nestina) e moléculas de sinalização que regulam a angiogénese (VEGF, VEGFR1, VEGFR2, fosfo-Akt e HIF-1α) sem afectar adversamente o recipiente de contagem em tecidos normais (fígado, pulmão, e rim) de ratinhos portadores de tumor. Estes flavonolignans também inibiu a germinação de microvasos a partir de aortas de rato dorsais

ex vivo

, e a proliferação celular induzida por VEGF, a formação do tubo capilar do tipo e capacidade de invasão de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

In vitro

. Outros estudos em HUVEC mostrou que estes diastereoisómeros alvo do ciclo celular, apoptose e cascata de sinalização induzida por VEGF. Três ensaio de crescimento dimensional, bem como a invasão de co-cultura e

In vitro

estudos de angiogénese (com células HUVEC e DU145) sugeriram a eficácia diferencial dos diastereoisómeros em relação a APC e as células endoteliais. No geral, esses estudos elucidada a eficácia anti-angiogênico comparativo de flavonolignans puros de Milk Thistle e sugerem a sua utilidade no PCA angioprevention

Citation:. Profundo G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina K, Gu M, Agarwal C , et ai. (2012) Angiopreventive Eficácia de Flavonolignanos puros a partir de leite Thistle Extrato contra câncer de próstata: Segmentação VEGF-VEGFR Sinalização. PLoS ONE 7 (4): e34630. doi: 10.1371 /journal.pone.0034630

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de dezembro de 2011; Aceito: 02 de março de 2012; Publicação: 13 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 funda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NCI R01 bolsas CA102514 e CA104286. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o mais frequentemente diagnosticado malignidade não-cutânea entre os homens nos Estados Unidos, e é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer [1]. Evidências clínicas e experimentais sugerem que os tumores humanos pode persistir durante anos como lesões microscópicas em um estado de dormência e seu posterior crescimento depende criticamente da obtenção de um “fenótipo angiogênico” [2], [3], [4], [5] . ‘interruptores Angiogênicas’ envolvendo a alta VEGF e receptor VEGF (VEGFR) níveis foram identificados e considerados responsáveis ​​pela progressão PCA de baixa PIN grau (neoplasia intraepitelial prostática) palco para PIN de alto grau e após mais agressivo, pouco diferenciado, e androgénio fases malignas independentes [6]. Além disso, o nível de angiogênese em PCA tem sido correlacionada diretamente com pontuação de Gleason, estágio do tumor, progressão, metástase e sobrevivência [6], [7], [8]. Por conseguinte, visando a angiogénese tem sido objecto de várias investigações clínicas para melhorar a qualidade de vida de doentes com cancro [9], [10], [11]. Além disso, a prevenção do início da angiogénese em tumores indolentes (referido como ‘angioprevention’) tem sido sugerida como uma abordagem nova e fundamento lógico para controlar o crescimento de APC, a progressão maligna e as metástases para locais secundários.

xenoenxertos DU145 foram iniciadas e os ratinhos foram administrados ou o veículo (CMC) ou 50 e 100 mg /kg de peso corporal de doses de cada diastereoisómero. (A) O volume do tumor foi medida e representada graficamente como uma função do tempo (dias). Cada valor nas curvas é média ± SEM de 10-12 ratinhos. (B-D) Xenoenxerto tecidos foram analisados ​​para PCNA, TUNEL e caspase-3 (CC3) por IHC. Os dados mostrados nos diagramas de barras representa a média ± SEM de 4-5 amostras. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

tecidos de xenoenxerto DU145 foram analisadas para CD31, nestin, VEGF e VEGFR2 por IHC. análises quantitativas foram realizadas utilizando Zeiss Axioscope 2 microscópio (Carl Zeiss, Alemanha) e fotografias foram originalmente capturados (pelo 400x) com uma câmera Carl Zeiss AxioCam MRC5 com Axiovision Rel 4,5 software. Os dados mostrados nos diagramas de barras representa a média ± SEM de 4-5 amostras. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; *, P ≤ 0,001.

tecidos de xenoenxerto DU145 foram analisadas para VEGFR1, HIF-1α, fosforilada Akt

Ser473 e os níveis totais de Akt por IHC. análises quantitativas foram realizadas utilizando Zeiss Axioscope 2 microscópio (Carl Zeiss, Alemanha) e fotografias foram originalmente capturados (pelo 400x) com uma câmera Carl Zeiss AxioCam MRC5 com Axiovision Rel 4,5 software. Os dados mostrados nos diagramas de barras representa a média ± SEM de 4-5 amostras. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; *, P ≤ 0,001.

Cerca de quatro décadas atrás, Judah Folkman primeiro previu o papel potencial para os inibidores anti-angiogénicos contra tumores sólidos, e até à data, vários inibidores da angiogénese foram testados contra muitas doenças malignas [ ,,,0],12], [13], [14], [15]. Muitos destes inibidores de já ter sido aprovado pela FDA para a sua utilização, quer isoladamente ou em combinação com medicamentos quimioterapêuticos do cancro [13], [15], [16]. Por exemplo, foi aprovado VEGF humanizado contra o colo-rectal, do cérebro, do pulmão, cancros renais e [16]. Da mesma forma, o sorafenib inibidores da tirosina quinase e sunitinib, que têm como alvo a actividade VEGFR, foram aprovados para uso contra o carcinoma das células renais [16]. Embora a inibição da angiogénese no cancro, em princípio, é uma boa estratégia preventiva /terapêuticos, a abordagem actual de alvejar uma única molécula, tais como VEGF ou VEGFR é falho, como as células cancerosas desenvolver resistência através de contornar estas moléculas e continuar a espalhar redes vasculares [17 ]. Ao lado de sua limitada eficácia em termos de melhora na sobrevida do paciente, essas opções de tratamento são extremamente caros e têm mostrado níveis inaceitáveis ​​de toxicidade [18], [19]. Portanto, racionalizada a necessidade de identificar agentes naturais não tóxicos com eficácia de largo espectro anti-angiogénico; e, nesse sentido, no presente estudo, que incidiu sobre a eficácia anti-angiogênico de quatro diastereoisómeros puros de Milk Thistle (

Silybum marianum

) extrair, ou seja, silybin A, B silybin, isosilibina A e B. isosilibina estes diastereómeros são flavonolignans com uma fracção de flavonóides idênticos e diferem apenas nas suas configurações sobre a porção de lignano, e as suas propriedades químicas e biológicas foram detalhados anteriormente [20], [21], [22], [23], [24]. Aqui, pela primeira vez que analisaram a eficácia angiopreventive destes flavonolignans no modelo de xenotransplante PCA e vários

ex vivo

,

in vivo

e

in vitro

ensaios de angiogênese.

(a-B) pulmões, fígado e rins a partir de cada ratinho foram colhidos e analisados ​​quanto à imunorreactividade CD31, assim como para análises histopatológicas. análises quantitativas foram realizadas utilizando Zeiss Axioscope 2 microscópio (Carl Zeiss, Alemanha) e fotografias foram originalmente capturados (pelo 400x) com uma câmera Carl Zeiss AxioCam MRC5 com Axiovision Rel 4,5 software. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: isosilibina A, ISO B: isosilibina B.

Flavonolignanos (A) inibir a angiogênese

ex vivo

. aortas de rato foram plaqueadas em matrigel e tratou-se com flavonolignans. As setas na imagem marcam os vasos emergentes das aortas. (B) Flavonolignanos inibir a formação do tubo induzida por VEGF em HUVEC. As HUVEC foram plaqueadas em matrigel e efeito do tratamento diastereoisómeros na formação do tubo induzida por VEGF foi analisada. microfotografias rede tubular representativos são mostrados em 100x (painel superior). comprimento do tubo foi quantificada como detalhado em ‘métodos’ (painel inferior). Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; *, P ≤ 0,001.

(A) As HUVEC foram induzida com VEGF e tratou-se com cada flavonolignan em meio de soro a 0,5%, e o número total de células foi analisada após 24 horas. (B) HUVEC foram plaqueadas na câmara superior com DMSO ou diastereoisómero individual, enquanto o VEGF foi adicionado na câmara inferior e invasão HUVEC foi estudada. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

(A-B) HUVEC foram tratadas com DMSO ou flavonolignan individual e analisados ​​para o número total de células e distribuição do ciclo celular. (C) As HUVEC foram tratadas com flavonolignans, e 24 h mais tarde, lisados ​​de células totais foram preparados e analisados ​​quanto a reguladores do ciclo celular. Os valores de densitometria apresentadas a seguir as bandas são “mudança dobra” em relação ao controle após o carregamento de controle (α-tubulina) normalização. (D) As HUVEC foram tratadas com flavonolignans (na dose de 30 uM) durante 36 h e analisadas por morfologia (fotomicrografias representativas são mostrados na 100x), os níveis de cPARP clivada, caspase 3 e 9, e células apoptóticas percentuais. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

HUVEC foram privadas de soro durante 22 h, tratada com diastereoisómeros durante 2 h e estimuladas com VEGF (10 ng /ml) durante 10 minutos. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e analisados ​​para moléculas sinalizadoras mencionados. Os valores de densitometria apresentadas a seguir as bandas são ‘desistir mudança “em relação ao controle após o carregamento de controle (β-actina) normalização.

(A) Efeito da flavonolignans (a 90 mM dose) na tridimensional o crescimento de células DU145 foi estudado como descrito em «Materiais e Métodos». Representativos esferóides microfotografias são mostrados em 100x e 400x. (B) No ensaio de invasão Transwell, quer de células DU145 (plaqueadas na câmara inferior) ou HUVEC (plaqueadas na câmara superior) foram tratados com os diastereoisómeros individuais (na dose de 30 | iM), e invasividade de HUVEC foi medida. (C) células DU145 foram tratados com diastereoisómeros individuais (em 30 de dose M) e meios condicionados foram recolhidos. As HUVEC foram plaqueadas em matrigel, juntamente com 0,5% de FBS ou meios condicionados a partir de diferentes grupos de tratamento; e formação do tubo foi analisado. fotomicrografias representativas de rede tubular são mostrados na 100x. Abreviaturas: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; ISO A: Um isosilibina, iso B: isosilibina B; CM: condicionado meios de comunicação; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01.

Silybin A, B silybin, isosilibina A e isosilibina angiogênese alvo B em tumores da próstata através de segmentação moléculas de sinalização em células de PCA, bem como em células endoteliais, o componente importante da PCA microambiente.

Métodos

Linha celular e

células Humano PCA DU145 Reagentes

eram de ATCC (Manassas, VA) e cultivadas como descrito anteriormente [25]. As HUVEC foram de Lonza (Walkersville, MD) e foram cultivadas em meios EBM2 com EGM-2 SingleQots suplementos. Matrigel e câmara de invasão eram da BD Biosciences (New Bedford, MA). kit de ensaio de TUNEL foi da Promega (Madison, WI). Carboximetilcelulose (CMC), a hematoxilina de Harris e anticorpo β-actina foram da Sigma (St. Louis, MO). DAB kit era de Vector Laboratories (Burlingame, CA). A estreptavidina e o anticorpo PCNA eram de Dako (Carpinteria, CA). Os anticorpos para CD31, VEGF e nestina foram de Abcam (Cambridge, MA). Os anticorpos para a VEGFR1, VEGFR2, e HIF-1α [utilizados para imuno-histoquímica (IHC) análise], bem como anticorpos para Cdk2, Cdk4, Cdc2, ciclina D1, ciclina D3, ciclina B1, p21, p27, Skp 2, Cdc25A e Cdc25C e soro normal de cabra eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticorpo de p27 foi de Neomarkers (Fremont, CA) e o anticorpo p21 era da Upstate (Charlottesville, VA). Os anticorpos que reconhecem os níveis de proteínas fosforiladas e /ou totais de VEGFR1, VEGFR2, Src, ERK1 /2, Akt, Bad, mTOR, p70S6K, clivada da caspase 3, caspase 9, e anticorpos secundários conjugados com HRP de cabra anti-coelho foram partir celular sinalização (Beverly, MA). sistema de detecção de ECL e anticorpo secundário conjugado com HRP anti-ratinho eram de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). VEGF foi de R D (Minneapolis, MN). Silybin A, B silybin, isosilibina A e B isosilibina foram isolados (pureza 97%) a partir de extrato em pó dos frutos do

Silybum marianum

(L.) Gaertn. [Obtido a partir Euromed, S.A. (Barcelona, ​​Espanha)]. Os híbrido cromatográficas /técnicas e procedimentos precipitative para a purificação escala de gramas desses flavonolignans já estão relatado anteriormente [26].

In Vivo

Tumor Study Xenoenxerto

atímicos (

nu /nu

) ratinhos nus machos eram do NCI (Frederick, MD). O protocolo de tratamento foi aprovado pela Comissão Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Colorado em Denver. Aproximadamente 3 × 10

6 DU145 células foram suspensos em 50 ul de meio isento de soro, misturou-se com 50 mL de matrigel, e injectado s.c. no flanco direito de cada ratinho. No dia a seguir à implantação de xenoenxerto, os ratinhos foram aleatoriamente divididos em nove grupos, e todos os tratamentos foram feitos por gavagem oral como: os ratinhos do grupo I (grupo de controlo do veículo) com 200 uL de 0,5% de CMC (w /v) em água estéril; Grupos II e III ratinhos com 50 e 100 mg /kg de peso corporal dose de silibina A; camundongos grupos IV e V com 50 e 100 mg kg dose /peso corporal de silybin B; Grupos VI e VII ratinhos com 50 e 100 mg /kg de peso corporal dose de isosilibina A; e ratinhos Grupos VIII e IX, com 50 e 100 mg /kg de peso corporal dose de isosilibina B, respectivamente. Todos estes tratamentos (5 dias /semana), foram dadas no 200 uL de 0,5% de CMC. Como todos os quatro compostos têm o mesmo peso molecular (482,1), cada nível de dosagem foi equimolar entre estes agentes. Uma vez que o crescimento de xenoenxertos de tumor começou, tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes por semana utilizando o volume da pinça e tumor digital foi calculada pela fórmula: 0,5236 L

1 (L

2)

2, em que L

1 é longo diâmetro, e L

2 é o diâmetro curto.

IHC Análises

amostras de tumor foram processados ​​e seguintes métodos publicados coradas imuno-[27], [28], [29]. Percentagem de PCNA, TUNEL, caspase 3 clivada e células positivas HIF-1α foi calculado por contagem do número de células coradas positivas (coradas de Brown) e o número total de células em cinco campos seleccionados arbitrariamente a partir de cada tumor com aumento de 400x. Microvasos coradas com CD31 e nestina foram quantificados em 5 microscópicas (aumento de 400X) Campos aleatórios por tumor. VEGF, VEGFR1, VEGFR2, pAkt

Ser473 e Akt imunorreatividade foi analisada em 5 áreas aleatórias para cada tecido do tumor e foi classificada como 0+ (sem coloração), 1+ (coloração fraca), 2+ (coloração moderada), 3+ (coloração forte), 4+ (coloração muito forte).

Ex Vivo

formação capilar Ensaio

aortas isoladas de ratos foram limpas, cortadas em pequenos fragmentos e colocado em poços cobertos de matrigel e coberta com uma outra Matrigel 100 uL. Após estas aortas foram cultivadas durante 24 h, o meio (meio completo HUVEC) foi substituído com ou sem flavonolignans (30 e 60 um). Os tratamentos foram substituídos depois de 48 h. Após 6 dias de incubação total vasos brotando do aortas foram fotografados usando Canhão Força do chute câmera A640 em microscópio Zeiss invertido.

Formação tubo de ensaio

HUVEC (4 × 10

4) foram cultivadas em 1 ml EBM2 (suplementado com 0,5% de FBS e 4 ng /ml de VEGF) com vários diastereoisómeros (5-30 | iM) em placas revestidas de Matrigel. Após 9 horas de incubação, a formação de estruturas tubulares foi quantificada através do cálculo do comprimento do tubo (em 100x) com microscópio Zeiss usando invertida do canhão de energia shot A640 e software AxioVision Rel.4.7. Numa experiência relacionada, células DU145 foram tratados com a dose de 30 | iM de cada flavonolignan durante 72 h, e meio fresco (0,5% de FBS) foi adicionado e recolhidas após 12 h (rotulado como “meio condicionado”). Os meios condicionados misturados com 0,5% de FBS suplementado meios EBM2 (75:25 proporção) foi então adicionada a HUVEC e formação do tubo foi estudado como descrito acima.

Ensaio de viabilidade celular

HUVEC foram tratadas com ou sem VEGF (10 ng /ml) e diferentes concentrações de flavonolignans (5-30 uM). Após o tratamento desejado, o número total de células foi determinada utilizando um hemocitómetro.

Transwell Invasão Ensaio

Neste ensaio, as câmaras inferiores de Transwell foram cheios com meio de EBM2 contendo 0,5% de FBS suplementado com 4 ng /ml de VEGF, e nas câmaras superiores HUVEC (4 × 10

4) foram semeadas em 500 uL EBM2 (0,5% de FBS) mais 30 uM de cada dose de flavonolignan. Após 10 h, as células invasivas foram quantificados como descrito anteriormente [30], [31]. ensaio semelhante também foi realizada com células DU145 plaqueadas na câmara inferior (meio RPMI com 0,5% de soro) e (EBM2 meios com 0,5% de soro) HUVEC na câmara superior. Em duas experiências separadas, foram adicionados flavonolignans quer nas câmaras superiores ou nas câmaras inferiores e invasividade de HUVEC foi estudado em cada caso.

Distribuição

ciclo celular e apoptose

a distribuição do ciclo celular (saponina /PI coloração) e apoptose (anexina-PI coloração) foram analisadas por FACS [32], [33].

imunotransferência

HUVEC foram tratadas com 30? M de cada dose de flavonolignan com ou sem estimulação de VEGF, foram preparados e analisados ​​por imunotransferência método padrão tal como descrito lisados ​​anteriormente [33], [34]. α-tubulina e β-actina foram usadas para confirmar carga igual de proteína.

Tridimensional Formação esferoidal Ensaio

Em placas de 24 poços, 100 ul de matrigel foi adicionado. Depois disso, ~ 1 × 10

3 DU145 células adicionou-se 100 ul de meio RPMI-1640 e da mistura de matrigel (50:50) contendo. Após 15 min, 1 mL de meio RPMI-1640 com FBS a 10% contendo veículo de DMSO ou 90 ^ M de cada concentração flavonolignan foi adicionado no poço; tratamentos foram substituídos cada 48 horas durante 2 semanas. No final do experimento, a formação esferóide foi contado sob o microscópio Zeiss invertida em 100x.

Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Sigma Stat versão 2.03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA ). A significância estatística de diferenças entre o controlo e grupos tratados foi-determinada pelo teste t de Student e p 0,05 foi considerado significativo. ANOVA unidireccional seguida pelo teste de Tukey foi usado para as comparações múltiplas. As auto- radiografias /bandas foram digitalizadas, e densidade de bandas (quando mencionado) foi determinada usando o Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA). Dizer

Resultados

Efeito da Flavonolignanos no PCA DU145 xenoenxerto crescimento

em termos de eficácia anti-tumor, a administração oral de flavonolignans efetivamente inibiu o crescimento de xenoenxertos DU145 em ratinhos nus, e este foi discernível a partir da terceira semana em diante (Fig. 1A). No final da experiência (10 semanas), silibina Um tratamento inibiu o volume do tumor de 44 e 50%, com 50 e 100 mg /kg de peso corporal de doses, respectivamente (p 0,05) (Fig. 1A); enquanto silibina B inibiu o volume de tumor de 38 e 47% em doses idênticas, respectivamente (p 0,05) (Fig. 1A). Em isosilibina A ratinhos tratados, o volume de tumor foi inibido por 44 e 50% (p 0,05) (Fig. 1A), ao passo que em ratinhos tratados com isosilibina B, o volume do tumor foi inibido por 46 e 67%, com 50 e 100 mg /kg doses de peso corporal, respectivamente (P 0,05) (Fig. 1A). Em geral, isosilibina B foi mais eficaz na inibição do crescimento de xenoenxerto DU145, seguido de silibina A ou isosilibina A e B. Embora silibina, estas diferenças no efeito biológico de cada diastereoisómero não atingiu significância estatística; Estes resultados foram consistentes com relatado anteriormente

in vitro

estudos [21], [22].

No momento da necropsia, todos os animais foram examinados para patologia grave, e nós não observamos sinais de anormalidade em todos os órgãos vitais examinados. Além disso, a administração destes compostos por meio de gavagem oral não provoca qualquer alteração significativa no padrão de consumo da dieta ou ganho de peso corporal de ratinhos (dados não mostrados). Além disso, não observamos qualquer efeito adverso em termos de comportamento geral dos animais, sugerindo uma natureza segura global destes compostos.

Efeito da Flavonolignanos na proliferação e apoptose em DU145 xenoenxertos

O IHC a análise de amostras de tumores DU145 mostraram que o tratamento flavonolignans inibe significativamente a imunocoloração para PCNA (um biomarcador para a proliferação celular) (Fig. 1B), mas aumenta os TUNEL e 3 células positivas-caspase clivados (biomarcadores para apoptose) (Fig. 1C e 1D ). Embora estatisticamente significativa, o efeito de flavonolignans na proliferação e apoptose relacionado biomarcador foi modesta, e não podia explicar completamente o crescimento mais lento de xenotransplante observada e perto de inibição do crescimento de 50% com o tratamento flavonolignan (Fig. 1A). Portanto, da próxima analisamos os tecidos tumorais para o efeito flavonolignans sobre a angiogênese, o que é absolutamente necessário para os tumores a crescer além do tamanho 1-2 mm [3].

Efeito da Flavonolignanos na angiogênese em DU145 xenoenxertos

para investigar se estas flavonolignans individuais inibiu o crescimento de xenotransplante por suprimir a angiogênese do tumor, que manchou a seção de tumor com CD31 (um biomarcador para microvasos amadurecidas) e nestina (um biomarcador para microvasos imaturos e recém-formados). Todos os quatro compostos inibiram a densidade de microvasos, tanto maduro e recém-formada, mas isosilibina B foi relativamente mais eficazes no seu efeito inibitório sobre a nestina-positivas microvasos (Fig. 2). O VEGF é um potente factor de pró-angiogénico [17], [35], e IHC análises de secções de tumor mostrou claramente que o tratamento com estes diastereoisómeros diminui tanto a expressão de VEGF e de VEGFR2 em tecidos de tumor (Fig. 2). Notavelmente, excepto silibina A, expressão VEGFR1 foi também significativamente reduzida por estes agentes (Fig. 3). Em geral, isosilibina B foi relativamente mais potente na sua eficácia em VEGF, VEGFR2 e expressão VEGFR1. HIF-1α é o factor de transcrição principal que é estabilizado sob condições hipóxicas em tumores de crescimento e metabolismo do tumor controlos, bem como a expressão de factores pró- angiogénicos, tais como VEGF [36], [37], [38]. Embora a estabilização de HIF-1α ocorre sob condições de oxigénio baixas, a sua expressão é também controlada pela serina /treonina quinase Akt [39]. Akt desempenha igualmente um papel importante em vários processos celulares, tais como a sobrevivência celular, apoptose, metabolismo e migração [40], [41]. IHC análises de tumores mostrou que todos os quatro flavonolignans diminuir fortemente HIF-1α e pAkt

níveis Ser473, com efeito marginal sobre a expressão Akt total, apenas por isosilibina A e isosilibina B (Fig. 3).

efeito da Flavonolignanos na angiogênese em não-alvo órgãos

para confirmar que os efeitos anti-angiogénicos destes flavonolignans são específicas para tecidos tumorais, foram analisados ​​os órgãos não-alvo (fígado, pulmão e rim) para CD31 expressão para determinar a densidade de microvasos. Não houve diferença na densidade de vasos no fígado, pulmão e rim entre o controlo e os ratinhos alimentados com flavonolignans puro (Fig. 4A, os dados CD31 quantificação não mostrado). H E as análises mostraram também que estes diastereoisómeros não têm nenhum efeito adverso sobre a histologia de órgãos normais (Fig. 4B).

Efeito da Flavonolignanos na angiogênese em

Ex Vivo Comprar e

In Vitro

Ensaios

Foram examinados ainda mais a atividade anti-angiogênico dos flavonolignans em

ex vivo

ensaio de formação capilar utilizando aortas dorsais do rato. Após seis dias de cultura em Matrigel, em condições angiogénicas, observou-se um significativo número de vasos que brotam de aortas de rato (assinalados por setas), que foi inibida de um modo dependente da dose por flavonolignans tratamento (Fig. 5A).

um dos passos importantes durante neo-angiogénese é a formação e fusão de tubos produzidos pelas células endoteliais que formam uma complexa rede de vasos e capilares [42], [43]. Para entender o efeito da flavonolignans sobre este evento biológico, foi realizado ensaio de formação de tubo. Como mostrado na Fig. 5B, painel inferior, os quatro compostos inibiram significativamente o comprimento do tubo induzida por VEGF em HUVEC. Como se mostra nas figuras (Fig. 5B, painel superior), o tratamento com VEGF induziu a formação de redes tubulares por HUVEC, que foi interrompida por flavonolignan tratamentos.

Efeito do Flavonolignanos sobre a proliferação induzida por VEGF e Quimiotáticos Motilidade

o VEGF desempenha um papel importante durante a neo-angiogenese através do seu efeito mitogénico e motogenic em células endoteliais [17], [35]. Nos nossos estudos, o tratamento com VEGF induziu o crescimento de HUVEC que foi fortemente inibida por tratamento flavonolignans (Fig. 6A). Tais tratamentos também inibiu a motilidade quimiotáctica de HUVEC em direcção VEGF no ensaio de invasão Transwell (Fig. 6B). Importante, isosilibina B foi o menos eficaz em comparação com os outros diastereoisómeros em termos de efeito inibitório sobre a motilidade quimiotática de HUVEC.

Efeito da Flavonolignanos na viabilidade, a progressão do ciclo celular e apoptose em HUVEC

para melhor elucidar o efeito biológico destas flavonolignans em células endoteliais, analisou-se a viabilidade, ciclo celular e apoptose em HUVEC. Como mostrado na Fig. 7A, as quatro flavonolignans (5-30 uM) inibiu a viabilidade HUVEC de uma maneira dose e dependente do tempo. A análise do ciclo celular revelaram que todos os diastereoisómeros induzido a paragem em G1 após 24 h de tratamento, mas apenas silibina A, B silibina e isosilibina A também causada G2 /M prisão (Fig. 7B). Depois de 48 h de tratamento, o efeito notável de silibina A, B silibina e isosilibina A em HUVEC era a indução da paragem G2 M /, que estava ausente tratamento com isosilibina B (Fig. 7B). Isosilibina Um tratamento (a 30 pM) paragem da fase S induzida significativamente após 48 h de tratamento, o que pode ser ligada a uma forte morte apoptótica induzida por isosilibina A (Fig. 7B).

próxima examinou o efeito de estes flavonolignans sobre várias moléculas reguladoras do ciclo celular, ou seja, as ciclinas, os inibidores de Cdks Cdks e, bem como os seus reguladores Skp2 e fosfatases cdc25. Como mostrado na Fig. 7C, os quatro flavonolignans diminuiu os níveis de Cdk2 e Cdk4 com efeito marginal sobre a Cdc2. Estes compostos também diminuiu os níveis de ciclina D1, ciclina D3, ciclina A, ciclina B1 e. Silibina e isosilibina Uma Um moderadamente aumentou a expressão de p27, mas foi reduzida pela isosilibina B (Fig. 7C). Pelo contrário, a expressão de p21 foi diminuída por silibina A, B silibina e isosilibina A, mas não por isosilibina B (Fig. 7C). No entanto, todas as quatro diastereoisómeros diminuiu fortemente a expressão de Skp2 e Cdc25C com nenhuma ou moderado efeito inibitório sobre Cdc25A nível (Fig. 7C). Estes resultados sugerem que estas quatro diastereoisómeros têm poucos efeitos contrastantes semelhantes (mas que diferem no grau) e alguns sobre a expressão de moléculas reguladoras do ciclo celular.

Em seguida, examinou o efeito das flavonolignans puros (a 30 pM) na apoptose após 36 h de tratamento em HUVEC. Como mostrado na Fig. 7D, isosilibina B foi o menos eficaz, em termos de indução da apoptose relacionada com características morfológicas (descolamento e arredondamento), moléculas envolvidas em apoptose (cPARP clivada, caspase 3 e 9) e percentagem da população celular apoptótica em HUVEC sinalização. Por outro lado, silybin A, B e silybin isosilibina A morte por apoptose induzida fortemente em HUVEC (Fig. 7D).

Efeito da Flavonolignanos sobre a sinalização induzida por VEGF em HUVEC

Em seguida, examinamos efeito flavonolignans na cascata de sinalização induzida por VEGF que controla a proliferação, motilidade e tubo de formação em células endoteliais [35]. O tratamento com VEGF aumentou fortemente a fosforilação de VEGFR2 Ser1175 no local, um marcador fiável para a sua actividade, o que foi inibido pelo pré-tratamento com flavonolignans (Fig. 8). Da mesma forma, VEGF aumentou a fosforilação de VEGFR1, Src, ERK1 /2, Akt, BAD, mTOR, e p70S6K. Como mostrado na Fig. 8, com excepção de ERK1 /2 e mTOR, a fosforilação em outros locais foi inibida por estes compostos ainda que em diferentes proporções. Comparado com os seus outros diastereoisómeros, isosilibina B foi o menos eficaz em termos de efeito sobre as moléculas de sinalização induzida por VEGF em HUVEC.

sensibilidade diferencial de Flavonolignanos Para PCA e células endoteliais

resultados anteriores [ ,,,0],20], [21], [22], [24] e o presente estudo sugere que, entre os quatro flavonolignans puros, isosilibina B é o mais eficaz em termos de eficácia contra células de PCA, mas, surpreendentemente, que tem a menor eficácia em termos do seu efeito em HUVEC (inibição da motilidade quimiotáctico ou indução da apoptose) (Figs. 6 e 7). Portanto, foi realizada uma série de experiências para elucidar a eficácia relativa destas quatro diastereoisómeros contra células PCA vis-à-vis de células endoteliais. Primeiro, analisou-se o seu efeito sobre o crescimento de três dimensões de células DU145 em matrigel. O tratamento com estes compostos inibiram fortemente o número e tamanho de esferóide formada por células DU145 com isosilibina B sendo mais eficaz (Fig. 9A). Em seguida, realizamos estudos de co-cultura utilizando câmaras Transwell. Nós banhado HUVEC na câmara superior, enquanto que as células DU145 foram cultivados na câmara baixa. Em duas experiências separadas, células HUVEC ou DU145 foram tratados com flavonolignans puros, e em seguida, através de HUVEC invasão de matrigel foi estudado em cada caso. Como mostrado na Fig. 9B, isosilibina B foi o mais eficaz na diminuição da migração de HUVEC quando as células DU145 foram tratados, mas foi menos eficaz quando HUVEC foram tratados.

Para seguir este, nós tratados DU145 células com estes diastereoisómeros (30 mm) e recolhido o meio condicionado. O potencial pró-angiogênico do meio condicionado foi analisado em um ensaio de formação do tubo utilizando HUVEC. Como mostrado na Fig. 9C, o meio condicionado a partir de células DU145 aumento do comprimento do tubo, bem como rede tubular formada por HUVEC. Os meios condicionados das células DU145 flavonolignan tratados diminuíram de forma significativa o comprimento do tubo, bem como a rede tubular (Fig. 9C).