Abstract

Os inibidores de poli [ADP-ribose] polimerase 1 (PARPis) mostram a promessa para o tratamento de cancros que não têm capacidade para reparação de recombinação homóloga (FCR). No entanto, novas estratégias terapêuticas são necessários a fim de superar a resistência inata e adquirida a estes medicamentos e, assim, expandir a matriz de cancros que poderiam beneficiar dos mesmos. Mostra-se que linhas de células de cancro humano que respondem fracamente à ABT-888 (um PARPi), tornam-se sensíveis a que, quando co-tratados com vorinostat (um inibidor da desacetilase de histona (HDACi)). Vorinostat PARPis também sensibilizados linhas celulares de cancro insensível à 6-tioguanina (6-TG) -a droga que tem como alvo PARPis células sensíveis. O efeito sensibilizador de vorinostat foi associado com o aumento da fosforilação do factor eucariótico de iniciação (EIF) 2α que em si e por si aumenta a sensibilidade das células cancerosas para ABT-888. Mais importante, estas combinações de fãrmacos não afecta a sobrevivência de fibroblastos normais e células da mama, e aumentou significativamente a inibição do crescimento do tumor de xenoenxerto em relação a cada fármaco isoladamente, sem afectar o peso ratinhos ou a sua função hepática e renal. Os nossos resultados mostram que a combinação de vorinostat e ABT-888 poderia ser útil para o tratamento de cancro com resistência inata para PARPis devido às máquinas HRR activa, enquanto a combinação de vorinostat e 6-TG poderia superar a resistência inata ou adquirida a PARPis devido BRCA mutações secundárias ou de reversão, à diminuição da PARP-1 nível ou a um aumento da expressão de proteínas resistentes a drogas múltiplas. É importante ressaltar que as drogas que aumentam a fosforilação de eIF2α pode imitar o efeito sensibilizante de vorinostat na resposta celular ao PARPis ou 6-TG, sem ativar todos os seus efectores a jusante

Citation:. Yalon M, Tuval-Kochen L, Castel D, Moshe I, Mazal I, Cohen O, et al. (2016) Resistência superação das células cancerosas a PARP-1 Inibidores com três diferentes combinações de fármacos. PLoS ONE 11 (5): e0155711. doi: 10.1371 /journal.pone.0155711

editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 05 de julho de 2015; Aceito: 03 de maio de 2016; Publicado: 19 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Yalon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. https://ec.europa.eu/research/mariecurieactions/Grant # PCIG10-GA-2011-303795. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, foi descoberto que as células da mama, do ovário e cancro da próstata que carregam mutações bi-alélicas para susceptibilidade genética do cancro da mama (BRCA) 1 ou BRCA 2 ou que são fosfatase e homólogo angiotensina deficiente (e, portanto, incapaz de expressar RAD51), são extremamente sensíveis a inibidores da PARPis e ao apagamento de PARP-1 [1,2]. Estes resultados reforçam a noção de que a capacidade diminuída para resultados HRR na sensibilidade para PARPis.

A família de PARP humana consiste em 17 enzimas cada uma das quais é o produto de um gene diferente. As enzimas todos possuem domínios catalíticos conservados e os domínios de ligação de ADN. A PARP-1 liga-se a garfos de replicação paralisadas, bem como a quebra de cadeia simples (SSB) que podem formar-se espontaneamente, durante a reparação de excisão de bases ou em resposta a agentes que danificam o DNA. A ligação a lesões do ADN activa a PARP-1 levando a adição de poli (ADP-ribose) porções de NAD

+ para proteínas envolvidas na reparação do ADN e a replicação incluindo PARP-1 em si e histonas na vizinhança de locais de ligação de PARP-1 . Acumulação de poli (ADP-ribose) leva ao recrutamento de proteínas de reparação do ADN. No SSBs o principal papel da PARP-1 é recrutar reparação de raios-x de proteína-complementando cruzamento 1 (XRCC1), enquanto em forquilhas de replicação paralisadas sua actividade envolve o recrutamento de quinase checkpoint 1 (CHK1) [3-5]. A PARP-2 também é activada por lesão do ADN e tem um papel na supressão da formação espontânea de lesões tóxicas de ADN, contudo, a sua abundância relativa e as actividades catalíticas são inferiores aos de PARP-1 [3]. Enquanto PARP-1 – /- ou PARP-2 – /- ratos são viáveis ​​e saudáveis, os ratos do knockout duplamente morrem no útero, o que sugere que alguns dos papéis desempenhados por cada um desses PARPs são essenciais e redundante [1,3] . A inibição farmacológica da PARP-1 ou actividade de supressão inibe a sua reparação de SSB, que na ausência de HRR funcional pode levar à formação de não reparados quebras de cadeia dupla (DSB) durante a replicação, a replicação garfo colapso e morte celular [1,3,4 ]. Portanto, está claro por que as células-alvo PAPRis ​​com BRCA mutado ou que são prejudicados de outra forma na sua capacidade de HRR. Infelizmente, para além da sua população alvo limitada, o desenvolvimento de resistência a PARPis é uma grande preocupação. mutações secundárias BRCA, que restaurar a estrutura do BRCA de leitura aberta (ORF) e do terminal C funcional, bem como aumento da expressão de resistência a múltiplas drogas (MDR) 1 ou diminuição da expressão de PARP-1 todos levam a perda de sensibilidade ao PARP-1 inibidores [1 , 3]. Além disso, a diminuição da expressão de 53BP1 foi demonstrada para ab-rogar a sensibilidade de células de BRCA1 mutado para PARPis [6]. Por isso, é importante encontrar maneiras de superar a resistência à PARPis independentemente de ele ser adquirida ou inata.

Relevante para essa noção são as conclusões que HDACis diminuir o nível de proteínas HRR e a 5? M, vorinostat (o primeiro HDACi para ser aprovado pela FDA para o tratamento do cancro) reduz drasticamente o nível destas proteínas em células cancerosas mas não em células normais [7,8]. Portanto, vorinostat é esperado para sensibilizar células cancerosas ao tratamento com PARPis, independentemente da sua capacidade inata de reparo do DNA. Além disso, a actividade de NF-kB e de CHK1, que está associada com a resistência à vorinostat [7] é dependente de PARP-1 atividade [5,9]. Assim, vorinostat e PARPis são esperados para aprimorar mutuamente o efeito anti-neoplásica de um ao outro. De fato, enquanto este trabalho estava em andamento vários laboratórios relataram que HDACis sensibilizados células cancerosas cultivadas para PARPis [10-14].

Além de PARPis, o anti-metabólito 6-tioguanina (6-TG) também alvos células com mutação BRCA ou com outras deficiências na sua capacidade para HRR [15]. 6-TG é actualmente utilizada no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. Dentro das células 6-TG é metabolizado em 6-TG nucleótido que é incorporado no ADN durante a replicação. Após a sua incorporação no ADN do nucleótido 6-TG passa por S-metilação, ativando a reparação incompatibilidade (MMR) e desencadeando a formação de LAP que exigem HR para reparação [16]. Além disso, a acumulação de 6-TG-dependente das espécies reactivas de oxigénio conduz à oxidação da incorporadas 6-TG e a formação MMR-independente de ligações cruzadas inter-cadeia (ICL) [17], que requer a acção combinada da anemia de Fanconi ( FA) e HRR caminhos para a sua reparação [17,18]. Interessantemente, as células que se tornaram resistentes a PARPis devido a uma mutação secundária BRCA2 ainda eram sensíveis a 6-TG [15]. Aparentemente, mutações secundárias não permitem as proteínas BRCA para reparar lesões independentes MMR seguinte formação da ICL [15,18]. Como se viu, BRCA1 tem um papel único na reparação FA dependente da ICL, que não pode ser cumprida por BRCA1 com uma mutação secundária que revogou a sensibilidade à PARPis [18]. A capacidade de vorinostat para diminuir drasticamente o nível das proteínas de reparação de ADN, incluindo a de BRCA1 é susceptível de aumentar o efeito de 6-TG ao diminuir tanto reparação FA-dependente e RH. Além disso, nem o vorinostat nem 6-TG várias resistentes (MDR) 1 substratos de drogas [7,15] e, portanto, sua ação combinada não devem ser afetados por um possível aumento do nível de MDR1. Por último, também é esperado aumento induzido por vorinostat na fosforilação de eIF2α para contribuir para a inibição de HRR [19] conduzindo assim a resposta celular melhorada para ambas as PARPis e 6-TG.

As experiências apresentadas aqui demonstram que as células que respondem fracamente a PARP-1-inibidor ABT- 888 -Torne sensível a ele na presença de vorinostat. Do mesmo modo, o vorinostat melhorado a resposta das células de cancro a 6-TG. Nas nossas condições experimentais o tratamento combinado de vorinostat e ABT-888 mostrou apenas um efeito moderado sobre o nível de BRCA1 e nenhuma sobre RAD51, mas levou ao aumento da fosforilação de eIF2α. As experiências com o inibidor farmacológico de eIF2α desfosforilação-salubrinal-, bem como com o phosphomimetic S51D e as variantes S51A não fosforilável de eIF2α mostraram que o aumento da fosforilação de eIF2α -in e de si-sensibiliza células cancerosas para ABT-888.

Finalmente, os tratamentos combinados de vorinostat e ABT-888 ou vorinostat e 6-TG aumentou significativamente a inibição de xenoenxerto de tumores de crescimento em relação a cada droga sozinho, sem afetar funções renais ou hepáticos ou causar qualquer perda de peso significativa.

Materiais e Métodos

cultura celular

da mama humano MDA-MB-231, L-87 linhas celulares de cancro BT-549 e MCF-7 e de glioblastoma humano, bem como células mamárias humanas primárias foram da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). fibroblastos humanos dérmicos foram obtidos por consentimento por escrito de dois doadores (aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Sheba Medical Center, protocolo nº 7044). MDA-MB-231, MCF-7, BT-549 e U-87 foram autenticadas pela curta repetição em série de perfis.

condições de crescimento

células MCF-7 foram cultivadas em baixa glicose no Dulbecco modificado meio de eagle (DMEM), células U87 foram cultivadas em meio DMEM de glicose elevada, as células MDA-MB-231 e BT-549 em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 meios de linha celular foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina e estreptomicina a partir Biological Industries Kibbutz Beit-Haemek, Il. O meio de crescimento de BT-549 também foi suplementado com 0,023 UI /mL de insulina recombinante humana (Sigma, St. Louis, MO.). Os fibroblastos foram cultivados em DMEM de alto teor de glucose suplementado com FBS a 20%, penicilina-estreptomicina, aminoácidos não essenciais a 1% e 0,2% β-mercaptoetanol (Invitrogen, Life Technologies Grand Island, NY). células de mama humanos normais primários foram cultivados em meio basal das células epiteliais mamárias contendo insulina humana recombinante, e TGFa, L-glutamina, epinefrina, apo-transf errina, extracto de pituitária e hemissuccinato de hidrocortisona toda a partir de ATCC. Para a análise de Western blot de proteínas celulares As células foram plaqueadas a uma densidade de 4 x 10

3 por cm

2 e foram adicionados 48 horas pós-plating a partir de soluções de reserva em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, St. drogas Louis MO). Os controlos receberam o veículo. A concentração de DMSO no meio de crescimento não ultrapassou 0,08%.

Drugs

Salubrinal foi da Calbiochem-Merck4Biosciences (Darmstadt, Alemanha), vorinostat dos laboratórios LC (Boston, MA), ABT -888 a partir SelleckChem ou APExBIO (Houston, TX), 6-TG a partir de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido) ou Sigma, (St. Louis, MO.), Z-VAD-FMK foi comprado de APExBIO e senescência coloração β-galactosidase kit foi comprado de sinalização celular Technologies (Boston, MA).

Colony ensaio de sobrevivência

chapeamento para o ensaio de sobrevivência das colónias, contagem de colônias, e cálculo da percentagem de morte clonogênica (CD) foi realizada em triplicata como descrito anteriormente [19-21]. As colónias foram fixadas, coradas e contadas 10-14 dias após o plaqueamento, quando 90-95% das colónias no controlo possuíam mais de 50 células. Experimental índices de combinação (IC) e os simulado a ED50, ED75, ED90 e ED95 foram obtidos através da utilização do programa de computador de acordo com Chou CompuSyn [21]. CI 0,9 indicam interacção sinérgica. células da mama primários não formam colônias. As células foram, por conseguinte, colocadas em placas a uma densidade de 300 células /cm

2 e os vários fármacos foram adicionados um dia mais tarde durante mais cinco dias. A morte celular foi determinada por ensaio de exclusão de azul de tripano realizada em triplicado e expressos como morte celular por cento (CD). As concentrações de fármacos utilizados em nosso ensaio de sobrevivência das colónias estavam na gama de plasma Cmax alcançada em estudos pré-clínicos com animais de laboratório [22,23] e em estudos clínicos com humanos [24].

análise de Western blot

Preparação de lisados ​​e análise das mudanças induzidas pelo tratamento em nível de proteína e fosforilação celulares foram feitas como descrito anteriormente [19]. O teor de proteína foi determinada com um reagente de ácido bicinconínico (Bio-Rad, Hercules, CA), e o carregamento igual foi verificado por medição da absorvância a 520 nm de Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO), extraiu-se com tampão de fosfato (2,67 mM KCl, KH 1,47 mM

2 PO?

4, Na 8,1 mM

2HPO

4 e NaCl 1,125 M) a partir de tiras individuais de uma corrida duplo [19,20]. As manchas foram expostas a filme de raios-X para a quimioluminescência após o tratamento com reagente ECL West Pico (Thermo Scientific Rockford, IL). Os valores para a densidade de luz integrada de autorradiogramas foram obtidos com software Image J NIH e foram utilizados para a determinação das alterações induzidas pelo tratamento nos níveis de proteína e na proporção de eIF2α fosforilado (p-eIF2α) ao nível total da proteína. Os anticorpos de coelho que reconhecem quer p-eIF2α (# 9721) ou ambos (# 9722) a fosforilada e não fosforilada eIF2α, de coelho anti-RAD51 (# D4B10), de coelho anti-53BP1 (# 4937), anticorpo de coelho anti-PARP (# 46D11) e anticorpos monoclonais de coelho contra c-IAP1, c-IAP2, survivina e XIAP (# 9770) foram de Cell Signaling Technologies (Boston, MA). Rato anticorpos monoclonais contra BRCA1 (clone D9 # SC-6954) e contra a proteína tiorredoxina interagindo (TXNIP) # SC-166234 foram de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX). Os anticorpos monoclonais de ratinho contra a poli (ADP) ribose (PADPR) (10H # ab14459) eram de abcamBiochemicals

® (Cambridge, Reino Unido).

associada com a senescência β-galactosidase coloração

senescência β-galactosidase kit de coloração era de sinalização celular Technologies e coloração foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

a transfecção de células com plasmídeos que codificam para eIF2α variantes

heIF2α S51A e heIF2α S51D em pcDNA3.CD2 foram obtidas a partir de Addgene (Cambridge, MA). transfecção transiente foi realizada com JetPei (Polyplus, Nova Iorque, NY) de acordo com as instruções do fabricante, tal como foi descrito antes [19]. As experiências foram realizadas em triplicado em placas de 6 cavidades, com 1.5 ug de plasmídeo em 2 ml de meio de crescimento sem antibióticos durante 24 horas antes da adição de 0,5 ml de meio e prosseguindo com o protocolo experimental.

O crescimento do tumor em ratinhos nus

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o protocolo experimental nº 609/10 /ANIM que foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal do Sheba Medical Center. As células foram suspensas numa mistura de Matrigel (redução do factor de crescimento) (BD Biosciences, Bedford, MA) e meio RPMI (1: 1). As células (1,5 * 10

6 em 200 ul) foram injectadas na almofada de gordura mamária inguinal da

nu

atímicos – /

nu

– ratos do sexo feminino ( Harlan, Israel) pesando ~ 20 gr. Os animais foram pesados ​​1-2 vezes por semana, e o tamanho do tumor foi medido 2-3 vezes por semana com um calibrador digital. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula

V

= (

a

×

b

2) × 0,5, onde

‘um

‘ é a dimensão maior e

‘b

‘ o diâmetro perpendicular. As experiências incluiu 7 ratinhos por grupo experimental ao testar o efeito combinado de vorinostat e 6-TG no crescimento do tumor e 10 ratinhos por grupo ao testar o efeito combinado de vorinostat e ABT-888. O veículo foi constituído por 40% de PEG e 20% de DMSO em NaCl a 0,72%. Os fármacos foram administrados diariamente através de injecção intraperitoneal (i.p.) ao longo da experiência começando um ou dois dias antes da inoculação de células e os controlos receberam o veículo. O volume de injecção foi 250 ul. Devido a danos acidentais causados ​​pelas injeções, alguns ratos desenvolveram, no prazo de 24 horas após a injecção, muito grande hematoma no lado injectado que foram associados com sinais de sofrimento (postura arqueada e dificuldades nos movimentos). Estes ratos foram submetidos à eutanásia por CO

2 asfixia. O seu número na experiência que testou o efeito do tratamento vorinostat combinadas e ABT-888, foi o seguinte: C- (3 de 11), V- (2 de 10), ABT-888 – (nenhum), V e ABT -888 (2 de 11). O número de ratinhos que morreram da mesma maneira que durante a experiência testou o efeito do vorinostat combinadas e tratamento de 6-TG foram como se segue: C- V- (Nenhum) (1 de 7) 6-TG- (1 de 7) V e 6-TG- (1 de 7). Os experimentos foram terminou cerca de quatro semanas pós-iniciação quando os tumores começaram a mostrar sinais de necrose. Os ratinhos foram sacrificados por CO

2 amostras por asfixia e de sangue foram colhidas por punção cardíaca. hemograma completo, juntamente com funções hepáticas e renais foram realizados por A.M.L Divisão de Veterinária, Herzlia, Il. As amostras de órgãos internos foram fixadas em 4% de formalina tamponada e processados ​​para hematoxilina e eosina (H E) e coloração azul da Prússia

A análise estatística

Os ensaios in vitro para a sobrevivência clonogênica:. Significado de as diferenças entre grupos experimentais que receberam tratamento com dois agentes e cada um dos grupos que receberam o tratamento com um agente ou controlos foi verificada com Student independente

t

teste.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Experimentos com ratos nus:. ANOVA com medidas repetidas foi utilizada para testar a significância das diferenças observadas no volume do tumor entre os vários grupos experimentais. A análise incluiu os ratinhos que sobreviveram ao longo das experiências. foram utilizados tempo dentro fator assunto e V e ABT ou V e 6-TG entre fatores sujeitos. Para abordar a distribuição normal, os dados foram analisados ​​após a transformação raiz quadrada. ANOVA com medidas repetidas também foi empregado para demonstrar a falta de mudanças induzidas pelo tratamento em peso camundongos.

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Vorinostat sensibiliza células cancerosas in vitro para o tratamento com ABT- 888

foi relatado que vorinostat reduz o nível de proteínas de reparo de DNA no cancro mas não em células normais [8]. Nós também observado que vorinostat levou a uma diminuição dependente da dose de BRCA1 e nível RAD51 em MDA-MB-231 (FIG) S1. Estes resultados levaram-nos a testar o efeito do vorinostat sobre a sensibilidade das células cancerosas à PARPi-ABT-888.

Tem sido relatado que 5 um ABT-888 ~ conduz a redução de 90% na sobrevivência clonogénica of-436 MDA-MB linha BRCA1 mutado células do cancro da mama [25]. Em contraste, MDA-MB-231 que possui BRCA1 tipo selvagem [26] responderam pobremente ao tratamento com 7-10 uM ABT-888 (Figura 1). Ainda assim, o inibidor activo estava no interior das células, como demonstrado pela sua capacidade para anular H

2O formação

2-induzida de poli (ADP) -ribose (Figura 1b). A linha celular de cancro da mama triplo negativo BT-549 e glioblastoma U-87 foram igualmente resiliente para ABT-888, enquanto a linha celular dependente de estrogénios do cancro da mama MCF-7 foi relativamente sensível ao fármaco. No entanto, como observado na Fig 1a, vorinostat-aumentou a resposta de todas estas linhas celulares para ABT-888 e todas as IC experimental e simulado indicou que a interacção entre o vorinostat e ABT-888 é sinérgica (Fig 1a e S1 Tabela). Nas nossas condições experimentais, fibroblastos humanos normais e células de mama quase não foram afetados por qualquer um destes agentes ou a sua combinação.

a. morte clonogénica em resposta ao tratamento combinado de vorinostat e ABT-888: linhas celulares de cancro e os fibroblastos foram plaqueados para ensaios de sobrevivência clonogénicas e tratou-se com vorinostat, ABT-888, ou ambos. Os valores são médias de morte clonogénica (CD) (%) de triplicados ± SEM. Determinação da morte celular por cento (CD) para células normais da mama foi realizada por ensaio de exclusão de azul de tripano. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. As diferenças entre o CD do tratamento combinado e de cada um dos tratamentos únicos ou os controlos foram significativas. *

P

0,05, ** p 0,01. índices de combinação (CI) foram 0.9. b. ABT-888 é activa dentro das células: MDA-MB-231 foram incubadas durante a noite com 10 ^ M de ABT-888 de 15 min com 1 mM de H2O2 antes da colheita e processamento para detecção de poli (ADP-ribose) (PADPR) por western blot .

mecanismos moleculares que estão na base do efeito sensibilizante de vorinostat

Usando as condições experimentais representados na figura 1a determinou-se o nível de proteína de reparo do DNA em células tratadas com vorinostat, ABT-888 e sua combinação. Em contraste com as expectativas, verificou-se que a combinação de vorinostat e ABT-888 teve apenas um efeito moderado sobre o nível de BRCA1, reduzindo-a em não mais do que ~ 40%, enquanto que o nível de RAD51 não foi afectada. Curiosamente, o nível de 53-BP1 foi aumentada por vorinostat, e por ABT-888, e a sua combinação aumentou o nível de 53BP1 mais de cada fármaco isoladamente (Fig 2a-2c). A possível implicação do aumento do nível de 53BP1 em face da diminuição do nível de BRCA1 de sensibilidade celular à PARPis é considerado na discussão (Fig 2).

O tratamento combinado de vorinostat e ABT-888 reduziu o nível de BRCA1 por ~ 30% (a), não afectou o nível de RAD51 (b), o nível de aumento em relação ao controlo 53BP1 ABT-888 ou células vorinostat tratado (C) e diminuiu o nível de TXNIP (d). ABT-888 (10 uM), vorinostat (0,5 uM) e a sua combinação foram adicionados às células 48 horas após a galvanização. As células foram colhidas 48 horas mais tarde e processadas para análise por Western blot das alterações nos níveis de BRCA1, RAD51 e TXNIP. Os números na parte inferior dos autorradiogramas indicam mudanças relativas a controlos do nível de BRCA1, RAD51, TXNIP e de proteínas carregadas (Ponceau). O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. Unabridged imagens dos autorradiogramas apresentados nos painéis (a) e (b) é mostrada na Fig S2.

Na ausência de um efeito dramático do tratamento combinado sobre o nível de BRCA1 ou RAD51 determinamos o efeito de vorinostat, ABT-888 e a sua combinação com o nível de proteína celular que interage tioredoxina (TXNIP). Tem sido relatado antes que a expressão aumentada de TXNIP subjaz o efeito diferencial de vorinostat em células cancerosas [27]. Nós também demonstrado que altas concentrações de vorinostat conduziu a um aumento dependente da dose de TXNIP em MDA-MB-231 (FIG) S1. No entanto, sob as nossas condições experimentais, a combinação de vorinostat e ABT-888, que a morte celular aumentada repetidamente levou a uma diminuição, em vez de um aumento do nível de TXNIP em células MDA-MB-231 (Figura 2D).

Além TXNIP, fosforilação aumentada de eIF2α também tem sido demonstrado, por vários laboratórios incluindo o nosso, para mediar o efeito citotóxico de vorinostat em células cancerosas [19,28]. Estudámos, portanto, o nível de eIF2α fosforilação nas células tratadas tanto com vorinostat e ABT-888 e verificou que vorinostat em concentrações que o aumento da sensibilidade para ABT-888, conduziram a um aumento acentuado na eIF2α fosforilação, enquanto que ABT-888 sozinho conduziu apenas a um ligeiro aumento da fosforilação da proteína. Em células tratadas com ambos os agentes do nível de eIF2α fosforilado foi semelhante ao obtido com vorinostat sozinho. Em contraste, a acção combinada da vorinostat e ABT-888 não conseguiu aumentar o nível de eIF2α fosforilada em fibroblastos humanos ou em células normais da mama humanos (Figura 3a).

a. Vorinostat aumento eIF2α fosforilação em ABT-888 células MDA-MB-231 tratadas mas não em ABT-888 fibroblastos tratados e as células normais da mama: ABT-888 (10 uM), vorinostat (0,5 uM) e a sua combinação foram adicionados às células 48 horas após a galvanização. As células foram colhidas 48 horas mais tarde e processadas para análise por Western blot das alterações na proporção p-eIF2α /eIF2α. Os números na parte inferior dos autorradiogramas indicam mudanças relativas a controlos de p-eIF2α /eIF2α e de proteínas carregadas (Ponceau). O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. b. Salubrinal aumenta CD de células MDA-MB-231 em resposta a ABT-888: As células foram tratadas com salubrinal, ABT-888, ou ambos. Os valores são médias de CD (%) de triplicados ± SEM. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. As diferenças entre o CD (%) do tratamento combinado e de cada um dos tratamentos experimentais ou controlos foram significativas. **

p Art 0,01, *

p Art 0,05. CI foram 0.9. c. Um phosphomimetic eIF2α variante aumenta a morte clonogénica em resposta a ABT-888: A PARPi (10 uM) foi adicionado às células 18 horas após a transfecção com 1.5μg /2ml eIF2α S51A ou eIF2α S51D. As colónias foram processados ​​para análise de 10 dias de iniciação de pós-tratamento. Os valores são médias de CD (%) de amostras em triplicado ± SEM. O experimento foi reproduzido duas vezes com resultados semelhantes. As diferenças entre cada um dos controles e seus ABT-888 homólogos tratados, bem como entre as ABT-888 tratados variantes S51A e S51D foram significativas. SA-não-fosforilável S51A eIF2α, SD-phosphomimetic S51D eIF2α. d. Salubrinal aumenta a fosforilação eIF2α e expressão 53BP1 em ABT-888 células tratadas sem afectar o nível de BRCA1 ou RAD51: ABT-888 (10 | iM) e salubrinal (4,5 uM) foram adicionados às células 48 horas após a galvanização. As células foram colhidas 48 horas mais tarde e processadas para análise por Western blot das alterações no BRCA1, RAD51, 53BP1 e a proporção p-eIF2α /eIF2α. Os números na parte inferior dos auto-radiogramas são mudanças relativas a controlos do nível de BRCA1, RAD51, 53P1, a relação P-eIF2α /eIF2α e as quantidades de proteínas carregadas (Ponceau). O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. e. O nível de eIF2α fosforilada é mais elevado e o nível do total eIF2α é inferior em fibroblastos e células da mama normal do que em células de cancro: As células foram colhidas para análise por Western blot quatro dias pós-chapeamento. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. Os números na parte inferior dos autorradiogramas indicar as mudanças relativas ao controlo de peIF2α /eIF2α e a quantidade de proteínas carregadas (Ponceau). O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. Unabridged imagens do autorradiograma MDA no painel (a), RAD51 e 53BP1 no painel (d) e dos autorradiogramas no painel (E) estão apresentados na Fig S3.

Para determinar se o aumento da fosforilação de eIF2α em ABT-888 células de cancro tratados contribui para o efeito sensibilizador de vorinostat, foi avaliado o efeito de um inibidor de salubrinal-de-eIF2α desfosforilação sobre a sensibilidade das células para ABT-888. Como observado na Figura 3B e na Tabela S2, salubrinal aumentada a sensibilidade das células para ABT-888, e foram obtidos resultados semelhantes com a variante phosphomimetic eIF2α S51D (Fig 3C). De acordo com o seu efeito sobre a sensibilidade das células de cancro para ABT-888, salubrinal imitou o efeito de vorinostat no aumento da fosforilação da eIF2α em ABT 888-células tratadas e semelhante para a combinação de vorinostat e ABT-888, a combinação de salubrinal e ABT-888 não reduziu o nível de RAD51. No entanto, em contraste com o efeito de vorinostat, o efeito sensibilizador de salubrinal foi alcançada sem em todos afectar o nível de BRCA1 (Fig 3D). Curiosamente, o efeito de salubrinal sozinho no nível de 53BP1 foi maior do que a observada com vorinostat ou ABT-888 sozinho, e nas células tratadas tanto com salubrinal e ABT-888 ao nível de 53BP1 foi maior do que a observada em ABT-888 tratadas células e semelhantes ao observado nas células tratadas por salubrinal sozinho (Figura 3D).

de nota, nos fibroblastos não tratadas ou células da mama normais, o nível do total eIF2α foi muito inferior e o nível da proteína foi fosforilada muito mais elevada do que na linha celular de cancro da mama humano não tratado MDA-MB-231 (figura 3e), o que sugere que as células normais podem ser mais tolerante do que as células cancerosas para aumento da fosforilação de eIF2α.

de acordo com as nossas condições experimentais, o efeito de sensibilização vorinostat na resposta celular para ABT-888 não foi afectada pela presença do inibidor de caspase-pan-z-VAD-fmk (Fig S4). Um efeito independente de caspase de vorinostat na sobrevivência celular foi demonstrado anteriormente por Xu et al. [29]. Curiosamente, z-VAD-fmk, por si só conduziu a uma diminuição dependente da dose, na sobrevivência de células-um fenómeno que tem sido observado antes em vários sistemas celulares [30-32].

concentrações relativamente elevadas de vorinostat (5 -10 dobras maiores do que aqueles empregues nos nossos estudos) foram mostrados para reduzir drasticamente o nível do inibidor de proteína da família da apoptose (IAP) como c-IAP1, c-IAP2, XIAP e survivina [29]. Por conseguinte, examinado o efeito do vorinostat e a do tratamento combinado de vorinostat e ABT-888 ao nível destas proteínas (Fig S5). Nas nossas condições experimentais, vorinostat não afetou o nível de c-IAP1, survivina e XIAP. Além disso, ABT-888 não afecta o nível destas proteínas. O nível de c-IAP2 foi reduzido por tratamento vorinostat mas foi aumentada por ABT-888. No entanto, nas nossas condições experimentais, o tratamento combinado não afetar o nível destes IAP.

O tratamento combinado de vorinostat e ABT-888 foi, porém, associada a um aumento aparecimento de células senescentes planas alargada à procura que manchadas para a actividade de β-galactosidase (Fig S6). Aqui também, um efeito semelhante de vorinostat foi relatado antes por Xu et ai. [33].

Curiosamente, semelhante ao tratamento com vorinostat e ABT-888, o tratamento com salubrinal e ABT-888 conduziu a um aumento do aparecimento de células senescentes, que procuram coradas para β-galactosidase (Fig S6). Além disso, como vorinostat, salubrinal não afectou o nível de c-IAP1, survivina e XIAP mas levou a uma diminuição do nível de C-IAP2, e como vorinostat e ABT-888, o tratamento combinado de salubrinal e ABT-888 não afecta a nível destas IAP (Fig S5).

aumento da inibição do crescimento do xenoenxerto de tumor em ratinhos tratados com ambos vorinostat e ABT-888

o efeito de vorinostat sobre a sensibilidade de MDA-MB-231 para ABT-888 foi reproduzida in vivo. O tratamento combinado de vorinostat e ABT-888 conduziu a uma inibição significativa do crescimento do tumor em relação a cada tratamento por si só (Figura 4a). Os vários tratamentos não levar a um efeito significativo no peso corporal (Fig 4b) e não parecem afetar hemograma, fígado ou rins funções completas (Tabelas S3 e S4). H E a coloração de secções de um órgão interno não apresentam alterações induzidas pelo tratamento no coração, fígado, rim e os pulmões. b. c. b. b. c. b.