Sumário

A desregulamentação do não-receptor tirosina quinase ETK /BMX tem sido relatada em vários tumores sólidos. Neste relatório, nós demonstramos que a expressão ETK é progressivamente aumentada durante a progressão do câncer de bexiga. Descobrimos que a regulação negativa da ETK em células de cancro da bexiga atenuados atividade STAT3 e AKT passo que a sobre-expressão exógena de ETK teve efeitos opostos, o que sugere que a desregulação de ETK pode atribuir à atividade elevada de STAT3 e AKT freqüentemente detectada no cancro da bexiga. A sobrevivência, migração e invasão das células cancerosas da bexiga foram significativamente comprometida quando a expressão ETK foi derrubado por um shRNA específico. Além disso, mostramos que ETK localiza a mitocôndria em células de cancro da bexiga através da interação com Bcl-XL e regulação da produção de ROS e sensibilidade de drogas. Portanto, ETK pode desempenhar um papel importante na regulação da sobrevivência, migração e invasão por modulação múltiplas vias de sinalização em células cancerosas da bexiga. A análise imuno-histoquímica em microarrays de tecido contendo 619 amostras de tecido da bexiga humanos mostra que ETK é significativamente regulada durante o desenvolvimento do câncer de bexiga e progressão e nível de expressão ETK prevê a taxa de sobrevivência de pacientes com cystectomy. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que ETK pode potencialmente servir como um novo alvo da droga para o tratamento do cancro da bexiga, bem como um biomarcador que poderia ser usado para identificar os pacientes com maior risco de mortalidade, que pode ser beneficiado com terapêutica de segmentação actividade ETK.

Citation: Guo S, Sun F, Guo Z, Li W, Alfano A, Chen H, et al. (2011) de tirosina-quinase ETK /BMX é regulado para cima em cancro de bexiga e prediz mau prognóstico em pacientes com Cystectomy. PLoS ONE 6 (3): e17778. doi: 10.1371 /journal.pone.0017778

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Janeiro, 2011; Aceito: 09 de fevereiro de 2011; Publicação: 07 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH (CA106504) e DOD (W81XWH-08-1-0174) concede ao YQ, China National Natural Science Foundation (30.872.584) e Guangdong Natural Science Foundation (8251008901000018) para SQ Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é um dos cancros mais comuns nos Estados Unidos. Estima-se que haverá 70,530 novos casos e 14,680 mortes devido a cancro da bexiga em 2010 [1], [2], [3]. Múltiplos fatores genéticos e epigenéticos são acreditados para contribuir para o risco de desenvolver câncer de bexiga. Além dos fatores de risco bem conhecidos, tais como o envelhecimento, o sexo, a exposição à fumaça de cigarro e produtos químicos industriais, várias lesões genéticas que fornecem pistas para a transformação celular, proliferação, migração e invasão no cancro da bexiga foram identificados [4]. Estes incluem mutações ou alterações na expressão de p53, pRb, E-caderina, COX2, BLCA-4, CXCL1, MMP-2/9 e EGFR [5]. aumento acumulado nestes defeitos genéticos também fornece avaliação de prognóstico para a evolução da doença. No entanto, uma maior compreensão da biologia do tumor da bexiga é necessário o desenvolvimento de uma terapia mais eficaz. Existe assim uma necessidade para a identificação e a aplicação de novos alvos terapêuticos no cancro da bexiga.

epitelial e endotelial cinase da tirosina (ETK), também conhecida como quinase X de Medula Óssea (BMX), é um membro da família Tec não-receptor de tirosina quinase. ETK contém um domínio NH2-terminal plecstrina homologia, um domínio de homologia de Src 3, um domínio de homologia de Src 2, e um domínio de tirosina-cinase do terminal COOH [6]. ETK pode ser activada por vários estímulos extracelulares, incluindo factores de crescimento, citocinas, hormonas e matriz extracelular [7]. ETK proteína está presente no citoplasma com forte coloração perinuclear nas células, quando examinado através de microscopia de imunofluorescência [8], [9], [10]. A activação da actividade de quinase ETK pode ser conseguido pela interacção do seu domínio plecstrina homologia tanto com o fosfatidilinositol 3-quinase produto fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato ou o domínio FERM da FAK, o que leva a translocação da membrana do plasma de ETK [6], [8]. ETK tem mostrado desempenhar um papel em vários processos celulares, incluindo a proliferação celular, a transformação, diferenciação, migração e metástase. ETK pode interagir com FAK e p130

Cas para regular citoesqueleto de actina e motilidade celular [8], [11]. Também tem sido mostrado que ETK interage directamente com p53 suprimem tumor e inibir a sua translocação nuclear, promovendo, assim, quimiorresistência em células de cancro [9]. Nós já mostrou que ETK é progressivamente regulada durante o desenvolvimento do câncer de próstata humana e progressão [12], [13]. No entanto, o papel de ETK em células de cancro da bexiga permanece desconhecida.

Neste relatório, nós demonstramos que a expressão ETK é progressivamente aumentada durante a progressão do câncer de bexiga. ETK desempenha um papel importante na regulação da sobrevivência, migração e invasão por modulação múltiplas vias de sinalização em células cancerosas da bexiga. Nós adicional mostrou que ETK também está localizada nas mitocôndrias através da interacção directa com a Bcl-XL e regulação da produção de ROS em resposta ao tratamento de fármacos quimioterapêuticos. Além disso, a expressão ETK correlaciona-se positivamente o grau do tumor e prevê resultado para o paciente. Nossos dados sugerem que ETK pode potencialmente servir como um alvo de drogas e marcador de prognóstico para câncer de bexiga.

Resultados

Funcional ETK é sobre-expresso no cancro da bexiga

Foram examinados expressão ETK em um painel de linhas celulares de cancro de bexiga humana e descobriram que o nível de expressão foi variada ETK nestas células. Curiosamente, um nível significativamente mais elevado de proteína foi detectada em ETK UM-UC-3 e T24 células que são derivadas a partir de alto grau e tumores da bexiga invasivos (Fig. 1a). Nós, então, examinou se ETK é funcional nestas células invasoras. Em primeiro lugar, testou se o fator de crescimento poderia ativar a atividade ETK quinase usando fosforilação de tirosina 40 (Y40), um site de autofosforilação por ETK após a sua activação [8], como de leitura. Como mostrado na Fig. tratamento 1B, EGF induziu a fosforilação Y40, sugerindo que ETK é activa em células cancerosas da bexiga. Consistentes com estudos anteriores mostraram que ETK é a montante da STAT3 e vias AKT [15], [16], encontramos o nível de fosforilação de ambos STAT3 e AKT foi comprometida quando a expressão ETK foi derrubado por um específico shRNA (Fig. 1C, Esquerda ). Por outro lado, quando superexpresso ETK em 5637 células com um nível relativamente baixo de ETK endógena, detectamos um aumento da atividade de ambos STAT3 e AKT (Fig. 1C, direita). Estes dados em conjunto indicam que ETK é altamente expresso em linhas celulares de cancro da bexiga invasivo e envolvido na regulação da STAT3 e atividade AKT.

A, perfil de expressão de ETK em linhas celulares de cancro da bexiga. nível de expressão ETK em lisados ​​celulares totais de linhas celulares de cancro da bexiga foi examinado por imunotransferência com anti-ETK. Tubulina foi utilizada como um controlo de carga. B, Ativação de ETK em células de cancro da bexiga tratados com EGF. UM-UC-3 e T24 células foram privadas de soro durante 24 h, em seguida, tratados com 20 ng /ml de EGF para 15 ou 30 min. O nível de EGFR activados e ETK foi monitorizada por imunotransferência com anti-pEGFR (Y1175) e anti-pETK (Y40), respectivamente. O nível de EGFR total e ETK nos lisados ​​celulares também foi detectada com anticorpos anti-EGFR e anti-ETK respectivamente. C, o Regulamento da STAT3 e atividade AKT por ETK em células de cancro da bexiga. UM-UC-3 e T24 células foram infectadas com lentivírus que codifica o shRNA específico para ETK ou um controlo de vector. Às 24 h pós-infecção, as células foram privadas de soro durante a noite e, em seguida, lisadas. O nível da STAT3 activo e AKT foi analisada por imunotransf erência com anticorpos anti-pSTAT3 (Y705) e anti-pAKT (S473), respectivamente, (painel da esquerda). O efeito da ETK superexpressão de STAT3 e atividade AKT foi também examinada no cancro da bexiga 5637 células (painel direito).

ETK está presente nas mitocôndrias e associado a Bcl-XL

Quando examinamos localização celular da ETK em células de cancro da bexiga, observou-se uma distribuição puncate de ETK no citoplasma. Curiosamente, a coloração ETK foi parcialmente sobreposto com rotulagem Mitotracker nestas células (Fig. 2A). Nós também detectada uma quantidade significativa de proteína ETK na fracção mitocondrial, juntamente com outras proteínas mitocondriais conhecidos Bcl-XL e VDAC (Fig. 2B). Como ETK carece de um sinal alvo mitocôndrias, nos perguntamos se ele poderia localizar a mitocôndria através de uma interação proteína-proteína. Como mostrado na Fig. 2C, endógena Bcl-XL foi co-precipitada com ETK em ambas as linhas celulares de cancro da bexiga examinados. Resultados semelhantes foram também obtidos em células 293T sobre-expressando tanto T7-tag ETK e GFP de Bcl-XL. Estes dados sugerem que ETK pode formar um complexo com a Bcl-XL e localizar a mitocôndria. Devido à função anti-apoptótica de Bcl-XL, que examinaram o papel de ETK na regulação de apoptose nestas células. Como mostrado na Fig. 3A, knock-down de expressão ETK por um shRNA específica aumentou significativamente o número de células em apoptose em UM-UC-3 e T24 células. Além disso, a inibição da actividade ETK melhorado a produção de ROS e citotoxicidade em células de cancro da bexiga em resposta a tratamento de Doxorubucin, enquanto que a sobre-expressão de ETK tiveram efeitos protectores (Figura 3B . 3C). O crescimento do tumor e a metástase é regulada em parte pela capacidade das células tumorais para degradar a matriz do tecido circundante e migrar. Para testar se ETK regulação positiva pode causar um fenótipo tais, que ainda examinado os efeitos de ETK knock-down sobre a migração de células de cancro da bexiga e invasão utilizando os ensaios de câmara de Boyden. FIG. 3D mostra que a migração de células ETK-knockdown de UM-UC-3 e T24 foi reduzida para 40% e 60% respectivamente, em comparação com o controlo de células tratadas shRNA. Resultados semelhantes também foram observados quando examinamos sua capacidade de invadir através de matrigel. Estes dados sugerem que a inibição da expressão ETK em células de cancro da bexiga comprometida tanto migração e invasão.

A, ETK localiza a mitocôndria em UM-UC-3 e T24 células. As células foram marcadas com rodamina Mitotracker, seguido por coloração de imunofluorescência com anticorpos anti-ETK. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. Localização dos ETK foi determinada por microscopia confocal. Amarelo mostra co-localização de ETK e Mitotracker. proteína B, ETK é detectado na fracção mitocondrial. Mitocondrial e fracções citosólicas foram preparados como descrito em Métodos. Os extractos fraccionados foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos anti-ETK ou indicados para marcadores de fraccionamento. ERK foi usada como um marcador citosólico, enquanto a Bcl-XL e VDAC como marcadores mitocondriais. C, ETK está associada com a Bcl-XL. Os extractos totais de células de UM-UC-3 e T24 células foram imunoprecipitados com o controlo anti-ETK ou IgG, seguido de imunotransf erência com anticorpos, tal como (painel da esquerda) indicado. As células 293T foram co-transfectadas com T7-ETK e GFP-Bcl-XL, imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpos anti-T7 (painel central) ou anti-GFP (painel da direita), seguida de imunotransferência com anticorpos, tal como indicado.

a, Down-regulação da expressão ETK apoptose induzida em células de cancro da bexiga. UM-UC-3 e T24 células foram infectadas com lentivírus que codifica o shRNA específico para ETK durante 96 h e a apoptose foi avaliada por ensaios de TUNEL. As células apoptóticas foram quantificados por contagem das células positivas TUNEL em cinco campos aleatórios independentes. B, ETK regula a actividade ROS e citotoxicidade em células de câncer de bexiga em resposta ao tratamento Doxorubucin (DOX). As células foram infectadas com a codificação lentivírus shRNA específico para ETK, ETK T7-tag ETK ou um controle de vetor. A 48 h após a infecção, as células foram tratadas com DOX (UM-UC-3, 0,5 ug /ml; células T24, 2,5 ug /ml) durante 20 h e, em seguida, incubadas com 10 nM de 5 (6) -CDCFDA durante 30 min. as células ROS-positivos foram contados sob o microscópio de fluorescência. Os resultados foram expressos como percentagem do controlo. C, ETK regula citotoxicidade em células de câncer de bexiga em resposta ao tratamento DOX. As células foram infectadas tal como descrito em B e tratados com DOX (T24, 5 ug /ml; UM-UC-3, 0,5 ug /ml) durante 48 h. A viabilidade celular foi avaliada por ensaios de WST-1 (painel de cima). O nível de expressão ETK foi monitorizada por imunotransferência com anti-ETK (painel inferior). *, P 0,05 comparado com o controlo; **, P 0,01 comparado com o controlo. D, Knockdown de ETK inibiu a migração e invasão in vitro. A migração celular e ensaio de invasão foram descritos como Métodos. Os resultados foram expressos como percentagem do controlo. *, P 0,05 comparado com o controlo; ** P . 0,01 em comparação com o controle

ETK é regulada no tecido de câncer de bexiga humana e previu a sobrevida do paciente

Para examinar expressão ETK em tecidos tumorais de bexiga humanos, realizamos a análise imuno-histoquímica em microarrays de tecido da bexiga humana contendo 619 amostras de tecidos de 233 pacientes. ETK coloração parece ser tanto positiva citoplasmática e nuclear (Fig. 4A), e expressão ETK foi significativamente aumentada em tecidos de tumor da bexiga em comparação com as suas contrapartes benignas (Tabela 1). Além disso, o nível de expressão ETK foi significativamente maior nos tumores invasivos T1-T4 do que nos não-invasivos homólogos Tis /TA (p 0,001); No entanto, a expressão ETK não diferiram significativamente dentro de T1 a T4 tumores (dados não mostrados). Além disso, a expressão ETK aumentou com o grau do tumor (p 0,001). expressão ETK no CIS foi uma exceção notável, com uma média de 12% no citoplasma, que é menor do que pontuações G1-G3 (Tabela 1), sugerindo uma associação de ETK overepression com tumores de bexiga papilares. Para avaliar se ETK poderia ser usado como um potencial marcador de prognóstico, análise de resultado clínico foi realizado em 118 pacientes foram submetidos a cistectomia que foram acompanhados por uma média de 92,3 meses. Identificamos um ponto de corte de 15% para substratification óptima desses pacientes de acordo com a expressão citoplasmática ETK. Havia 75 tumores (64%) com baixa expressão (≤15%) e 43 tumores (36%) com expressão elevada ( 15%). A análise de Kaplan-Meier indicou que os pacientes que tiveram maior coloração citoplasmática de ETK (marcação com 15%) tinham mais pobres probabilidade de sobrevida global (Fig 4B, teste log-rank p = 0,0028).. Além disso, análise multivariada Cox de regressão mostrou que ETK é um preditor significativo da sobrevivência após o ajuste para outras variáveis ​​clínico-patológicas importantes, incluindo a idade, o grau do tumor, estágio e status do nó de linfa positiva (Tabela 2). Tal como indicado no modelo, ETK foi o único preditor independente de prognóstico para a sobrevivência global com taxa de risco de 1,7 (IC 95%: 1,1 a 2,7, p = 0,0159). Tomados em conjunto, estes dados mostraram que a expressão ETK é aumentada no cancro da bexiga e associado com progressão tumoral e prognóstico reservado.

A, Os campos representativos de câncer de bexiga humana TMAs coradas com anticorpo anti-ETK. B, a análise de Kaplan-Meier na associação de coloração citoplasmática ETK com a taxa de sobrevivência de pacientes com cystectomy.

Discussão

A superexpressão de ETK tem sido relatada em vários tipos de câncer, incluindo próstata, mama e pulmão [8], [13], [17], [18]. Este é o primeiro relatório sobre a desregulamentação de expressão ETK no cancro da bexiga. ETK expressão elevada frequentemente em células cancerosas da bexiga ETK sugeriu que pode desempenhar um papel causal para o desenvolvimento e progressão da doença. Isto foi suportado pela nossa observação de que a actividade ETK pode ser estimulado por EGF, que foi previamente demonstrada para induzir o crescimento e melhorar a invasão de células cancerosas da bexiga através da regulação da actividade de AKT [19], [20]. O receptor de EGF foi avaliado altamente expresso em células de cancro de bexiga e está associada com a progressão do cancro e um mau prognóstico em pacientes [21], [22], [23]. Portanto, ETK pode provavelmente actuar como um efector a jusante de EGF /EGFR para promover o crescimento do tumor da bexiga e metástase. Tem sido mostrado que a sobre-expressão ETK pode aumentar a proliferação em epitélio da próstata do rato e resultar no desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial prostática (PIN), em parte através do aumento da actividade de AKT e STAT3 [13]. Descobrimos que a regulação negativa da ETK em células de cancro da bexiga atenuados atividade STAT3 e AKT passo que a sobre-expressão exógena de ETK teve efeitos opostos. A desregulação da STAT3 e PI3K /AKT vias tem mostrado desempenhar um papel importante no desenvolvimento do carcinoma urotelial e se correlaciona com a progressão tumoral [24], [25]. É possível que ETK pode exercer o seu papel no cancro da bexiga através da regulação dessas vias. Metástase tumoral é dependente da capacidade de células tumorais para invadir tecidos normais. Nós mostramos que as células de câncer de bexiga pode efetivamente invadir uma barreira matriz in vitro, e essa capacidade foi marcadamente demitido quando a expressão ETK foi derrubado por um shRNA específico. Knockdown ETK leva à ativação diminuída de STAT3, que desempenha um papel na invasão cancro da bexiga, parcialmente explicado o possível mecanismo de inibição da invasão. O efeito da ETK sobre a migração celular pode ser explicada com base na função estabelecida de ETK na migração celular em células de câncer de próstata e de mama através de integrina mediada por FAK sinalização [8].

Além de STAT3 e AKT percursos que são conhecidas por ser activadas pelo ETK, também demonstraram, pela primeira vez, que ETK localiza a mitocôndria em células cancerosas da bexiga e, portanto, a produção de ROS e regula a sensibilidade ao fármaco. Outras tirosina cinases, incluindo Src e EGFR, têm sido mostrados para estar presentes na mitocôndria. Salvi

et ai relataram que Src está localizada nas mitocôndrias no cérebro de rato [26]. EGFR e Src pode translocar para mitocôndrias através da ligação a subunidade de citocromo mitocondrial coxidase (Coxα) de uma forma dependente de EGF e modular a função mitocondrial através de fosforilação Coxα [27]. No entanto, a função exacta da ETK na mitocôndria tem ainda de ser estabelecidos. Descobrimos que ETK está associado com um membro da família Bcl-2, Bcl-XL em células cancerosas da bexiga. Knockdown de expressão ETK leva a um aumento da produção de ROS e sensibilização de células da bexiga caner aos medicamentos quimioterápicos. Tem sido demonstrado que danificam o DNA, a irradiação e a hipóxia pode induzir ROS nas células cancerosas [28], [29]. Nós já mostrou que ETK pode conferir resistência a drogas em células de câncer de próstata através da interação com p53 e inibindo sua função transdução nuclear. É possível que ETK também pode promover a resistência ao fármaco através do seu efeito protector sobre a função mitocondrial. Os resultados demonstraram que, por conseguinte, proporciona um ETK fenótipo maligno invasivo e de células cancerosas da bexiga através da regulação múltiplas vias de sinalização (Fig. 5).

Tem sido demonstrado que a actividade da STAT3 e expressão é aumentada no cancro da bexiga tumor e prevê recorrência do tumor e sobrevida do paciente [30], [31]. Nossa análise IHC no cancro da bexiga TMAs mostraram que a expressão ETK é aumentada em tecidos de cancro da bexiga em comparação com os seus homólogos benignas. Considerando-se que a expressão específica de ETK na próstata do rato leva ao desenvolvimento de PIN de [13], é possível que ETK também pode desempenhar um papel na transformação oncogénica nas células uroteliais de bexiga. Mais importante ainda, a expressão ETK é maior no invasiva (T1-T4) do que os tumores da bexiga não invasivos (TIS /TA), sugerindo que ETK também pode desempenhar um papel na invasão tumoral e metástases. Esta possibilidade foi apoiada por nossa observação de que knockdown de expressão ETK em células de cancro da bexiga inibir a sua actividade em

in vitro

ensaios de invasão. Além disso, descobrimos que o nível de expressão ETK também pode prever a sobrevida dos pacientes com o tratamento cistectomia independente de outras variáveis ​​clínico-patológicas importantes, incluindo a idade, o grau do tumor, estágio e status de linfonodo positivo. Portanto, ETK pode potencialmente servir como um novo alvo da droga para o tratamento do cancro da bexiga, bem como um biomarcador que poderia ser utilizado para estratificar pacientes com maior risco de mortalidade. Estes pacientes podem ser benéficos da terapêutica alvo atividade ETK.

Materiais e Métodos

cultura de células, transfecção e infecção lentiviral

linha de células de cancro da bexiga humana T24, 5637, J82, RT-4 e de UM-UC-3, bem como 293T foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). UM-UC-3, células T24 e 293T foram crescidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco. 5637, J82 e células RT-4 foram mantidas em RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino e 1% (v /v), penicilina e estreptomicina (100 ug /ml) e mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 atmosfera. As células foram transfectadas com HD FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals), seguindo as instruções do fabricante. infecção por lentivírus foi realizada tal como anteriormente [9].

Imunoprecipitação e Western Blot

As células foram lisadas em tampão de lise (20 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 1 mM de Na

3VO

4, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, e 1 mM de fluoreto de fenilmetil-sulfonilo). O material insolúvel foi removido por centrifugação, e os anticorpos foram adicionados a lisado para a noite a 4 ° C. Os anticorpos foram obtidos utilizando G-Sefarose esferas de Proteína A ou proteína, e os complexos de proteínas foram lavadas três vezes a 4 ° C com o tampão de lise. A imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [9]. Resumidamente, as quantidades iguais de amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida de SDS e transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram incubadas com os anticorpos primários indicados durante a noite a 4 ° C e seguida por detecção com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. O anticorpo monoclonal anti-BMX (BD Transduction Laboratories) foi utilizado a 1:2000, enquanto que anti-pSTAT3 (Y705), AKT, pAKT (S473), EGFR, pEGFR (Y1175) e pETK (Y40) (Cell Signaling Technology, Danvers , MA) foram usados ​​a 1:1,000. Anti-Bcl-XL, anti-tubulina, ERK, VDAC e anti-sinal transdutores e activadores de transcrição 3 (STAT3) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foram usadas em 1:2,000.

WST -1, a formação de colónias e os ensaios de TUNEL

as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

3 células /poço e infectadas com lentivírus que codifica o ETK shRNA ou um shRNA controlo. Em cada ponto de tempo indicado, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de WST-1 (Roche) seguindo o protocolo do fabricante. Para o ensaio de formação de colónias, as células (1 x 10

4) foram semeadas em placas de 6 poços e infectaram com o lentivírus para o controlo ou shRNA ETK shRNA. A cultura celular foi mantida em meio completo durante 14 dias. colónias de células foram então visualizadas por coloração com azul de Coomassie. UM-UC-3 e T24 células foram infectadas com a codificação lentivírus ETK shRNA ou um controlo durante 96 horas e as células apoptóticas foram detectadas por ensaio de TUNEL seguindo as instruções do fabricante (Roche). As células apoptóticas foram quantificados por contagem das células positivas TUNEL em cinco campos aleatórios independentes.

ensaios

migração celular e invasão

A migração celular foi avaliada por ensaio Transwell como descrito anteriormente [8]. Resumidamente, as células infectadas foram colhidas, ressuspensas em meio isento de soro, e depois transferidas para as câmaras superiores (5 × 10

4 células por cavidade), enquanto as câmaras inferiores que contêm 0,5 ml de meio condicionado a partir de fibroblastos NIH 3T3. Após 24 h de incubação, as células na superfície superior foram raspadas e lavados, ao passo que as células que migraram para a superfície inferior foram fixadas e coradas com 4 ‘, 6-diamidino- 2-fenilindole (DAPI) durante 5 min e, em seguida, contados sob um microscópio de fluorescência, e o número relativo ao controlo do vector foi calculada. ensaio celular invasão foi realizada em condições de modo semelhante ao acima, excepto para os filtros Transwell foram pré-revestidos com Matrigel (BD Biosciences) e 1 × 10

5 células foram usadas por poço.

imunofluorescência e microscopia confocal análise

As células foram marcadas em meio de cultura fresco com 200 nM Mitotracker (Invitrogen) a 37 ° C durante 30 minutos, e foram então fixadas com 3,75% de formalina durante 15 min, seguido por incubação com solução bloqueadora [10% de burro 0,5% de soro albumina de soro bovino, 0,3% de triton X-100 em PBS] e tratou-se com anticorpo ETK dia para o outro a 4 ° C. As reacções imunológicas foram revelados por incubação das células com anticorpo de cabra anti-ratinho FITC conjugado IgG-488 (Jackson Immuno Research) e DAPI (1:5000) durante 5 min. Finalmente, a lamela contendo as células imunomarcadas foram montadas com um meio de montagem (gel Biomeda montagem, Electron Microscopy Sciences) anti-desbotamento. As células foram avaliadas usando uma imersão em água 40X lente objetiva de um microscópio confocal Zeiss 510 equipado com 347-, 488- e 543-nm feixes de laser.

preparação mitocondrial e Espécies Reativas de Oxigênio detecção (ROS)

fracção mitocôndrias as mitocôndrias foi purificado com um estojo de isolamento de células de cultura (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. ROS intracelular foi medida usando o corante 5 (6) -CDCFDA (Molecular Probes). Depois de passar através da membrana plasmática, esta lipofílico e não-fluorescente composto é desesterif içado para um álcool hidrofilico (H2DCF) que pode ser oxidado para se DCF fluorescente por um processo geralmente consideradas como envolvendo com ROS. As células em cultura foram carregadas com 10 uM 5 (6) -CDCFDA em meio normal a 37 ° C durante 30 min. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com meio e deixado o último meio de lavagem para estudos de imagiologia. Imagem foi feita pelo microscópio de fluorescência usando uma Nikon TE2000s microscópio invertido com 10x objetiva.

microarray Tissue, imuno-histoquímica e análise estatística

Tissue microarrays (TMAs) foram preparados pelo Departamento de Patologia da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA) Medical Center, como previamente descrito [14]. Os investigadores só foram fornecidas com os dados clínicos-patológicos, como o estágio do tumor e grau. Todos os identificadores dos pacientes foram removidos de modo que não é possível detectar qualquer tecido de um paciente em particular. Portanto, a confidencialidade do paciente está protegida. No âmbito do protocolo aprovado pelo comitê IRB na UCLA, sem consentimento do paciente é necessário para este estudo. TMA foram desparafinadas com xileno e corados como descrito anteriormente [13]. Resumidamente, as lâminas foram re-hidratados e recuperação de antigénio foi alcançada através de microondas durante 15 min em tampão de citrato. As lâminas foram então incubadas em peróxido de hidrogénio a 0,3% para extinguir a peroxidase de rábano endógena (HRP) durante 30 min. As lâminas foram pré-incubadas com soro normal de cabra em PBS (1:20) durante 60 min à temperatura ambiente. As lâminas foram então incubadas com anticorpo primário ETK (1:2000) a 4 graus durante a noite. Posteriormente, as lâminas foram incubadas com anti-IgG de coelho marcado com biotina e incubou-se com o complexo de peroxidase avidina-biotina pré-formado. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas.

As lâminas foram analisadas utilizando o scanner de slides automatizado Ariol SL-50 (Imagiologia Aplicada, San José, Califórnia) para quantificar a quantidade de coloração positiva para cada área de interesse. Limiares para cada imagem foram aplicados usando o software analítico Ariol com base em vários parâmetros: RGB algoritmo, forma e tamanho. Todas as análises foram realizadas com o script MultiStain. classificadores limiarizadas foram personalizados para cada mancha.

Para avaliar a coloração nuclear, coloração DAB positivo foi calculado aplicando dois limites de cores com um reconhecimento de fundo azul (hematoxilina manchado) células e outros que reconhecem células positivas marrom e azul, não células positivas (número total de células). As células individuais foram discriminados por incorporação dos limiares de forma e dimensão, proporcionando, em conjunto com os limites de cor, as contagens de células reais. Percentagem de positividade foi determinada dividindo-se o número de células detectadas pelo limiar de Brown pelo número total de células, detectado por a soma dos limiares de castanho e azul. área de tecido total analisado também foi incluído na análise final (mm

2).

Para avaliar a coloração citoplasmática, a mancha positiva a área foi calculada pela aplicação dos limiares de cor para detectar pixels marrom positivos. Por cento de positividade foi determinada dividindo a área total positivo mancha (mm

2) pela área total do tecido analisado (mm

2).

A pontuação imunorreactivo para cada caso foi quantificada pela média de quatro núcleos. As associações entre a expressão ETK e os parâmetros patológicos foram avaliados com os testes de Kruskal-Wallis. Diferentes pontos de extremidade de sobrevivência /recorrência foram avaliados para os pacientes que se submeteram TUR e pacientes submetidos a cistectomia. As curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para estimar sobrevivência /curvas de tempo livre de recidiva eo teste de log rank foi usado para testar se as curvas diferiam entre os grupos. COX modelo de múltiplos riscos proporcionais foi usado para avaliar quais co-variáveis ​​afetam o tempo de sobrevivência /livre de recidiva. Para cada co-variável, foi relatada a taxa de risco relativo eo associado

valor P

. Todas as análises foram realizadas com o software SAS versão 9.2.

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Allan J. Pantuck para seu conselho na análise de dados.