Abstract

Em muitos tipos de cânceres, uma população lateral (SP) foi identificado com base na alta capacidade de efluxo, enriquecendo, assim, para as células quimiorresistentes, bem como para as células-tronco do câncer candidato (CSC). Aqui, nós exploramos se adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC) contém uma SP, e se o seu perfil de expressão gênica está associada com chemoresistance, CSC e prognóstico. Após a dispersão em células individuais e incubação com corante Hoechst, analisamos ressecções PDAC humanos espécimes por citometria de fluxo (FACS). Nós identificamos um SP e população principal (MP) em todos os espécimes de ressecção PDAC humanos (n = 52) analisaram, mas detectado imune (CD45

+) e endotelial (CD31

+) células nesta fracção, juntamente com as células tumorais . As células SP e MP, ou fracções purificadas mais empobrecido de CD31

+ /CD45

+ células (PSP e PMP), foram classificadas por FACS e submetido a análise de expressão de todo o genoma. Este revelou a regulação positiva de genes associados com a resistência à terapêutica e de marcadores identificados antes no CSC pancreático putativo. PSP assinaturas genéticas de 32 ou 10 para cima ou genes reprimidos foram desenvolvidos e testados para a competência discriminatório entre PSP e PMP em diferentes conjuntos de amostras PDAC. O valor prognóstico dos genes PSP foi validado em uma grande série de pacientes independente PDAC (n = 78) usando a análise nCounter de expressão (em tumor

contra

tecido pancreático circundante) e regressão de Cox para-livre de doença e global sobrevivência. Desses genes, os níveis de

ABCB1 Comprar e expressão

CXCR4

foram correlacionados com pior sobrevida do paciente. Assim, o nosso estudo, pela primeira vez demonstra que PDAC humano contém um SP. Esta subpopulação tumor pode representar um alvo terapêutico importante dadas as suas características de expressão gênica chemoresistance- e CSC-associados com potencial valor prognóstico

Citation:. Van den Broeck A, Vankelecom H, Van Delm W, Gremeaux L, Wouters J , ALLEMEERSCH J, et al. (2013) Câncer de pâncreas humano contém uma População Side Expressando Cancer Stem Cell-Associated e Genes prognósticos. PLoS ONE 8 (9): e73968. doi: 10.1371 /journal.pone.0073968

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2013; Aceito: 23 de julho de 2013; Publicação: 17 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Van den Broeck et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo é apoiado pelo Fundo de Investigação Científica Flanders (FWO ASP-08-00379; 3M080177). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de grandes esforços para melhorar o seu prognóstico, o cancro do pâncreas (adenocarcinoma ductal pancreático ou PDAC) continua a ser uma das principais causas de mortalidade [1] relacionada ao câncer. detecção tardia e resistência à terapia são determinantes críticos de falha do tratamento PDAC. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência a terapia, portanto, é essencial. Em vários tipos de cancro, uma população lateral (SP) tem sido identificada como uma subpopulação que enriquece para as células que são quimio- e radiorresistente devido à presença de transportadores de múltiplas drogas e a capacidade para reparar danos no ADN e resistir a apoptose [2]. Com base em sua capacidade de efluxo, células SP são identificados no fluxo de citometria de análise (FACS) como um ramo lateral das células ‘Hoechst-baixo “após incubação com o corante Hoechst33342 [3].

resistência à terapia também é considerado uma característica particular dos chamados “células-tronco cancerosas” (CSC) [4]. CSC são pensadas para sobreviver terapias convencionais e, portanto, responsável pela reincidência do tumor. Candidatos populações CSC pancreáticos foram recentemente identificados com base em marcadores de membrana celular. CD24

+ /CD44

+ /molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM)

+ células e CD133

+ células mostraram exibir propriedades CSC [5], [6]. No entanto, apenas foi encontrado sobreposição parcial entre estas populações CSC pancreáticas diferentes, indicando a necessidade de estratégias de identificação alternativa. Em vários tipos de cancro, a SP tem sido mostrado para ser enriquecido com CSC (-like) fenótipo e actividade [7]. Em relação câncer de pâncreas, um SP foi previamente encontrados em linhas de células cultivadas [8] – [11] e, recentemente, o nosso grupo identificou um SP em tumores de xenoenxerto cultivadas a partir de amostras humanas PDAC em ratinhos imunodeficientes [12]. Estes SPs foram demonstrados possuir capacidade resistente à quimioterapia. No entanto, não foi demonstrado se PDAC directamente a partir do paciente, sem intervir cultura ou a expansão no ambiente hospedeiro murino, também contém um SP. No presente estudo, nós relatam que PDAC isolado a partir de pacientes abriga um SP e que esse SP expressa genes associados com a CSC pancreático e quimiorresistência, bem como com o prognóstico do paciente.

Materiais e Métodos

Amostras PDAC e Análise SP

Entre 2008 e 2010, as amostras de ressecção cirúrgica PDAC foram obtidos de 52 pacientes no Hospital Universitário de Leuven (UZ Leuven, Bélgica), após consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética UZ /KU Leuven antes do recrutamento de pacientes, e recebeu o número do estudo ML3452. O estudo foi registrado na clinicaltrials.gov sob o número NCT00936104. Após a ressecção, os blocos tumorais foram picadas em pequenos pedaços e incubados com colagenase de tipo IV (1 mg /ml em meio 199; Invitrogen, Grand Island, NY) durante 2-3 h, enquanto se mecanicamente dispersos em pontos de tempo de 20 min regulares. A suspensão de células final foi filtrada através de uma malha de nylon de 40 um (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica), e o número de células e a viabilidade determinada. A viabilidade das células obtidas após a dispersão dos tecidos PDAC foi rotineiramente ~ 50% e o rendimento de 400 mm

3 amostras PDAC obtidos de fresco era de aproximadamente 3 x 10

6 células vivas.

SP análise foi realizada conforme descrito antes

3. As células foram incubadas com Hoechst33342 (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) durante 90 min a uma concentração final de 5 ug /ml, e analisadas por FACS (FACSVantage SE, equipado com o software DIVA FACS, versão 6.0; BD Biosciences). Os lasers utilizados foram: near-UV (375 nm, 10 mW de saída), azul (488 nm, 13 mW) e amarelo-verde (561 nm, 30 mW). Os filtros utilizados foram: 450/40 para a Hoechst azul; 630/22 e 610 LP para a Hoechst vermelho; 530/30 e 520 LP para FITC; e 582/15 para o PE. iodeto de propídio (2 ug /mL; Sigma-Aldrich) foi adicionada para marcar as células não viáveis, excluindo os resíduos no canal Hoechst-azul e a Hoechst-vermelho. Duplo comprimento de onda a análise por FACS identificaram um ramo lateral de células ‘Hoechst-baixo »como o SP, adicionalmente verificada por co-adição de verapamil (100 uM, Sigma-Aldrich), o que resulta na redução do tamanho SP, bloqueando o efluxo de corante através de múltiplas drogas transportador (s). A principal população (MP) foi fechado como a maior parte das células “Hoechst-brilhantes”. Para caracterização adicional, as células foram imunocoradas PDAC para o CD31 marcador endotelial e hematopoiética a /CD45 marcador imunológico. Após incubação com Hoechst, as células foram dissolvidas em tampão de coloração (PBS + 2% FBS), e de fluoresceína (ITCF) marcado com anti-CD31 humano e ficoeritrina (PE) marcado com anticorpos CD45 anti-humano foram adicionados utilizando diluições recomendadas pela fabricante (BD Biosciences). Ambos isotipo (BD Biosciences) e controlos positivos foram realizadas. colorações adicionais não foram feitos como estes poderiam impedir a análise dos resultados FACS.

todo o genoma Análise Expressão por Microarray

25000 SP e 25000 células MP (total ou empobrecido de CD45

+ /CD31

+ células) foram classificadas por FACS em solução de lise frio do Micro RNeasy Kit (Qiagen, Venlo, Países Baixos). O ARN total foi extraído de acordo com as instruções do fabricante. a concentração e a pureza do RNA foram determinadas espectrofotometricamente utilizando o sistema de ND-1000 Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) e a integridade de ARN foi avaliada usando um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Somente amostras com RNA Integridade Number (RIN) ≥7.5 foram utilizados para análise microarray no VIB Nucleomics Núcleo (www.nucleomics.be). O ARN foi amplificado com o kit de NuGEN Pico WTA (NuGen Technologies, Santa Carlos, CA) e subsequentemente biotinilado. A mistura final foi purificado ARNA e fragmentada, e, em seguida, hibridizadas na Affymetrix HG U133 mais 2,0 matrizes (Affymetrix, Santa Clara, CA), seguido por coloração e lavagem em uma estação fluídica GeneChip 450 (Affymetrix) de acordo com os procedimentos do fabricante. Para medir a sonda matéria-intensidades de sinal, os chips foram digitalizados usando um scanner GeneChip 3000 (Affymetrix) e analisados ​​com o pacote affy_1.26.0 (Bioconductor, Seattle, WA).

Análise estatística e funcional de Microarray de dados

os dados de microarranjos matérias foram normalizados dentro de matrizes e entre matrizes seguindo o procedimento robusto Multichip Média (RMA) [13]. O 5.0 algoritmo MAS (guia do usuário suíte Microarray, versão 5; Affymetrix 2001) foi utilizado para avaliar a detecção acima do fundo. A partir dos 54616 conjuntos de sondas, 10255 estavam abaixo de fundo e omitido de uma análise mais aprofundada. Análise de Componente Principal (PCA) foi realizada com o pacote de pcurve Bioconductor e usadas para calcular as principais fontes de variação entre as amostras. Para análise comparativa entre SP e MP, os dados foram pareados por paciente. O pacote de limma Bioconductor foi utilizado para avaliar o contraste entre SP e MP [14]. A significância estatística desse contraste foi testada com um teste t moderado (implementado em limma). Significativamente genes a montante ou reprimidos foram definidos como genes com ≥2 vezes a mudança (log

2 SP /MP≥1 ou ≤-1), em combinação com p 0,001. esquemas clássicos para ajustar para testes de múltipla pode resultar em baixo poder estatístico para estudos de microarranjos. O ponto de corte rigoroso de p 0,001 foi utilizado como uma alternativa, a abordagem pragmática de equilibrar o número de falsos positivos e falsos negativos [15]. dados de expressão gênica estão disponíveis a partir da Expressão Gênica Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) através do número de adesão série GSE42404. análise de caminho funcional em todos os conjuntos de sondas significativamente diferencialmente expressos foi feito com o programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com; Redwood City, CA), construído no Engenho Knowledge Base, um banco de dados de literatura curadoria manualmente. Todos os conjuntos de sondas com um valor de p corrigido 0,001 e uma mudança de dobragem de 2 ou -2 foram usados ​​como entrada. No caso de múltiplas sondas referido o mesmo gene, o log médio

2-relação entre o conjunto de valores de entrada para este gene foi feita para posterior análise. redes gerados foram ordenados por um significado pontuação significando, estimado como o rácio entre o número de sondas que mapearam de entrada para a via dividido pelo número total de sondas pathway. Significado de funções biológicas e caminhos canônicos foram testadas por valor-p do teste exato de Fisher após a aplicação do método Benjamini-Hochberg de correção de testes múltiplos. Pathways foram considerados significativos quando p 0,05. identificação adicional de funções biológicas (Gene Ontology, GO) e KEGG (Enciclopédia Kyoto de genes e genomas) Vias foi realizada utilizando o banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID, versão 6.7, http: //www.david.abcc. ncifcrf.org). Para esta análise, a sonda define com um lt valor de p 0,001 e a mudança de 2,0 vezes foram usados ​​como entrada. A pontuação EASE, um teste p-valor modificado exato de Fisher foi utilizado para ajustar para testes múltiplos.

Desenvolvimento de um Gene assinatura

A supervisionado estratégia de aprendizagem foi aplicada aos dados de microarranjos do CD45

– /CD31

– SP e populações MP (ou seja, o SP purificada ou PSP, eo PMP). Uma lista de 200 genes de interesse foi composta com base em um estudo de literatura completa com os seguintes termos: “o câncer de pâncreas”, “células-tronco cancerígenas”, “side population”, “caminhos canônicos ‘,’ genes stemness ‘,’ mesenquimais transição epitelial (EMT) ‘,’ resistência a múltiplas drogas “,” oncogenes “e” genes Polycomb ‘. Os dados pré-processados ​​foram limitados a 512 conjuntos de sondas (195 genes) que tinham símbolos de genes na lista de 200 genes de interesse. No total, foram utilizados 29 abordagens de classificação diferentes, representando várias combinações de 5 modelos de classificação, 3 modos de seleção de recursos e 3 métodos de classificação [16]. Avaliação dessas abordagens foi feito usando o leave-one-out-de validação cruzada (LOOCV) para criar uma curva ROC (ROC) [17]. Os métodos de seleção de características univariadas acabou por ter qualquer valor acrescentado, desde a abordagem ideal com maior área sob a curva ROC (AUC) e taxa de erro menor equilibrada (BER) consistiu de uma máquina de vetores de suporte, sem recurso prévio classificação ou seleção (dados não mostrados ). Para reduzir ainda mais o assinatura de genes, foi utilizada a estratégia PINTA para dar prioridade gene candidato [18]. Ao olhar para expressão diferencial do bairro de um gene em uma rede de interação proteína-proteína de todo o genoma, a estratégia PINTA efetivamente realiza seleção de recursos multivariada através da incorporação de conhecimento prévio da biologia molecular. Um grupo de 32 genes foi atribuído como sendo significativa, e os conjuntos de sondas com o nível de expressão mais elevada foram escolhidos. Finalmente, a assinatura PINTA foi ainda mais reduzido para os 10 genes com a maior mudança vezes (para cima ou para baixo).

O valor preditivo do 32 gene e com a assinatura de 10 gene reduzida foi validado com LOOCV em diferentes SP

conjuntos de dados contra

MP.

Análise nCounter

Entre 2006 e 2010, amostras de tecidos foram coletadas, após consentimento informado, de pacientes submetidos à ressecção pancreática por PDAC. As amostras foram armazenadas a -80 ° C em RNAlater (Qiagen). A partir do tumor primário de 143 pacientes e do pâncreas circundante não tumoral (controlo) de tecido de 14 pacientes, o ARN total foi extraído utilizando o estojo RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Somente amostras com um número de integridade do RNA (RIN) de 7,0 foram usados ​​para análise posterior, ou seja, 78 amostras PDAC (relação masculino /feminino: 41/37; idade: 32-80 anos, com mediana de 64 anos) e 6 tecidos de controle (relação masculino /feminino: 4/2; idade: 51-66 anos, com mediana de 63 anos). características do tumor e características de prognóstico (com um follow-up até julho de 2011) dos 78 pacientes são fornecidos (ver Tabela S1). Usando o sistema de nCounter (Nanostring Technologies, Seattle, WA), os níveis dos marcadores moleculares acima definidas expressão foram quantificados no tumor pancreático

relação

tecido circundante (VIB Nucleomics Core) [19].

ABCB1 imuno-histoquímica em PDAC ressecção espécimes

para analisar a expressão da proteína ABCB1 por imuno-histoquímica, seções 5 mícrons foram preparados a partir embebidos em parafina espécimes PDAC fixados em formol dos 11 pacientes cujos PSP e PMP RNA foram utilizados para análise de microarray. Após desparafinização e reidratação dos slides, recuperação alvo foi feito com EnVision FLEX alvo Retrieval Solution (Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 20 min. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando peroxidase EnVision-reagente bloqueador (Dako) durante 5 min. As secções foram incubadas com anticorpo primário (ABCB1 anti-humano de Monosan, Uden, Holanda) na diluição recomendada (20/01) durante 30 min à temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram processados ​​usando o Dual Link EnVision (Dako). O complexo foi visualizado com DAB (3,3′-diaminobenzidina; Dako), seguido por um hematoxilina (DAKO) de contraste. Fotos foram tiradas com uma Leica DC 300 câmera em um microscópio Leica DMLB

Análise Estatística

SAS Statistical Software (versão 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Foi utilizado para todas as análises estatísticas. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS) foram calculados utilizando o método de Kaplan-Meier (Tabela S1). Para testar valor prognóstico de genes, a análise univariada para DFS e OS foi realizada por meio de regressão de Cox com e sem estrias cúbicos restritas (RCS), seguido de análise multivariada para OS utilizando regressão de Cox. Um modelo selecionado foi utilizado para a análise independente das variáveis ​​já correlacionados com a sobrevivência (ECLNI, sexo, pM e PT; ver Tabela S1).

Resultados

O cancro do pâncreas humano contém uma População Side

amostras de ressecção PDAC humano foram analisadas quanto à presença de uma população lateral (SP). Em todas as amostras analisadas (n = 52), a SP foi identificado que representa entre 0,2 e 21,5% (mediana: 1,8%). Das células PDAC totais (Fig. 1A)

A) Dot lote de dual- comprimento de onda análise FACS de células PDAC de seres humanos após incubação com Hoechst33342 que descreve uma cauda de células ‘Hoechst-baixos’ (SP), em relação a um volume maior de células ‘Hoechst-brilhantes’, a população principal (MF) (

esquerdo painel

). Um exemplo representativo é mostrado e a proporção SP indicado. PI

células pos (mortos) foram excluídos da análise para Hoechst33342, CD45 e CD31 rotulagem. O boxplot (

inserir

) resume as proporções SP das 52 amostras analisadas PDAC. blocos verapamil Hoechst efluxo, reduzindo assim o tamanho SP e confirmando o fenótipo SP (

painel direito

). B) gráfico de pontos FACS do PDAC SP, histoquímica para CD45 e CD31. Um exemplo representativo é mostrado. Os números indicam as proporções de CD45

+, CD31

+ e CD45

– /CD31

– células dentro do SP. C) Análise de Componentes Principais (PCA) de perfis de expressão do genoma inteiro obtido a partir CD45

– /CD31

– SP (PSP,

vermelho) e CD45

– /CD31

– MP (PMP,

azul) (n = 11). D) A coloração por imuno-histoquímica de ABCB1 em amostras de ressecção PDAC (n = 11). Um exemplo representativo (4% SP na análise FACS) é mostrado. ampliação original: x200 (

esquerdo

) e x400 (

direito

)

células “população main ‘(MP) (SP e ver Fig 1A para.. gating) foram classificadas por FACS e submetido a todo o genoma perfil de expressão (n = 10 PDAC). O Engenho Pathway Analysis (IPA) revelou nos genes de SP, e vias relacionadas com processos imunológicos, tais como a “diferenciação de células T-helper ‘,’ A comunicação entre células imune inata e adaptativa ‘e’ maturação de células dendríticas ‘(dados não mostrados). células do tipo imunitário, bem como as células endoteliais, são conhecidos a co-segregar em diferentes extensões no SP de tecidos e tumores. Assim, analisamos o PDAC humana SP por citometria de fluxo para a expressão do marcador imunológico CD45 /CD31 hematopoiético e o marcador endotelial. Cerca de 60% das células de SP forem CD45

+ (mediana: 61,4%, gama: 19,5-75,4%; n = 18) ao passo que apenas um pequeno número de células de SP forem CD31

+ (mediana: 0,7%, intervalo: 0,2-2,1%; n = 15) (Figura 1B).. CD45

+ e CD31

+ células também foram observados no MP em níveis comparáveis ​​(mediana de 63,7% e 1,6%; e gama: 41,1-75,4% e 0,1-6,7%, respectivamente). Para as análises posteriores, a SP e MP foram empobrecido do CD45

células

+ e CD31 +.

O purificada PDAC SP Mostra Expressão de Genes CSC-associados

classificadas a CD45

– /CD31

– SP e CD45

– /CD31

– células MP (ainda que se refere o SP como purificada ou PSP, e MP purificada ou PMP, respectivamente) a partir de 11 amostras PDAC e novamente realizado todo o genoma expressão profiling. Análise de Componentes Principais (PCA) mostra que o cluster PSP e segregar das PMPs (Fig 1C.)

Dos 1861 conjuntos de sondas que são diferencialmente expressos (≥2 vezes, p 0,001)., 993 são regulada na PSP e 868 são regulados negativamente (ver GEO, número de acesso GSE42404). O transportador multidroga

ABCB1

(

MDR1

,

P-glicoproteína) é altamente regulada na PSP

contra of the PMP (dobra: 5,3, p 0,001), e é potencialmente subjacente ao fenótipo SP. A análise imuno-histoquímica confirmou que a expressão em células tumorais ABCB1 PDAC, localizado principalmente na superfície apical das células (n = 11 amostras PDAC; Fig. 1D).

ABCG2

, um outro transportador que pode mediar SP efluxo, não é expresso diferencialmente (p 0,5), mas o sinal de microarray foi geralmente baixa e não acima do fundo em metade das amostras. Curiosamente, descrito anteriormente marcadores CSC pancreáticas (incluindo

CD44, CD133

e

CXCR4

) são significativamente sobre-expressos em PSP (Tabela S2). Além disso, outros (câncer) ‘stemness’ genes (como

LGR4, SOX9, KLF5

e

TEM

) também são regulados positivamente na PSP.

De todos diferencialmente expressos conjuntos de sondas, 1690 poderia ser mapeado para genes no Engenho base de Conhecimento, e foram submetidos a IPA (Tabela S3). As redes mais upregulated na PSP são ‘metabolismo de aminoácidos’ (que inclui

HNF4A

ou “fator nuclear Hepatócito 4 alpha ‘, dobra: 2,7, p 0,001),’ Cell-a-célula sinalização ‘( que inclui

TJP2

ou “junção apertado proteína 2 ‘, dobra: 2,4, p 0,001) e’ o crescimento e proliferação celular” (que inclui

EphA2

ou “A2 receptor Ephrin ‘, dobre : 2.1, p 0,001; e

EPHA4

, dobra:. 2.6, p 0,001)

as funções biológicas enriquecidas em PSP

contra of the PMP abranger “movimento Cellular ‘,’ a sinalização celular para célula e interação “,” crescimento e proliferação celular “,” O desenvolvimento embrionário “,” morfologia do tumor ‘e’ Cancer ‘(Tabela S3). Para discriminar entre PSP- e funções biológicas PMP-associados de forma mais detalhada, foi aplicada a análise DAVID. Clusters relacionados a ‘junção célula-célula’ (Pontuação Enriquecimento ou ES: 6,8), “A actividade da proteína quinase ‘(ES: 3.4),’ Desenvolvimento ‘(ES: 3,0),” ativada por mitógeno (MAP) a actividade da quinase’ (ES: 1.8), ‘integrina sinalização’ (ES: 1,6) e “Regulamento de apoptose” (ES: 1,4) são enriquecidos na PSP

caminhos Canonical, com base em genes diferencialmente expressos, também foram analisados ​​utilizando IPA.. Um número de 46 vias canónicos atingiu a significativa enriquecimento SP corte de P 0,05, incluindo ‘pluripotência humano estaminais embrionárias célula “,” sinalização tight junctions “,” sinalização de NF-kB’, ‘sinalização /β-catenina Wnt’, “sinalização de integrina” e “Efrina sinalização ‘(Tabela S3). Além disso análise detalhada usando DAVID (vias KEGG) mostrou regulação positiva da “via de sinalização ErbB” (incluindo

ErbB3

, dobra: 2,1, P 0,001). Na PSP

assinaturas de gene que discriminam o PDAC PSP a partir da PMP

Usando uma estratégia de aprendizagem supervisionado aplicado aos dados de expressão de todo o genoma do 11 CD45

– /CD31

– PSP e PMP pares como analisado anteriormente, foi desenvolvido um um conjunto de 512 conjuntos de sondas (genes) 195 como o potencial gene assinatura PSP ‘. A precisão de discriminar entre PSP e PMP usando essa assinatura foi de 95% na coorte de formação, avaliada com LOOCV (ver Materiais e Métodos).

Usando PINTA (ver Materiais e Métodos), este grande gene assinatura pSP foi reduzida para 32 genes, dos quais 19 são regulados positivamente e 13 reprimidos (Tabela S4). A validação deste gene assinatura pSP reduzida no conjunto de dados inicial (n = 11 amostras PDAC) demonstraram uma precisão da classificação de 91% de PSP e PMP, comparável com a previsão utilizando a assinatura 195 para o gene. Dentro da assinatura de 32 genes, os genes regulados positivamente na PSP incluem anteriormente proposto marcadores CSC pancreáticas (

CXCR4

,

CD133

) ou desempenhar um papel na resistência a múltiplas drogas (

ABCB1

) e em vias importantes na tumorigénese e a progressão do tumor (ver Tabela S4).

Finalmente, estreitou ainda mais a assinatura de genes para os 10 genes com maior dobrar para cima ou a regulação negativa (Tabela S4, em negrito). A precisão deste gene assinatura condensada para distinguir PSP de PMP (90%) é comparável com o poder discriminatório do conjunto de 32 genes.

Como um teste final do valor de discriminação do 32 e 10- assinaturas de gene, aplicamos ambos os conjuntos para uma série adicional, independente de 10 de SP pares /MP usando LOOCV. Ambas as assinaturas genéticas apresentou uma precisão discriminar entre SP e MP de 85%.

valor prognóstico da ABCB1 e CXCR4

Para investigar se os genes da PSP (32 e 10-) assinaturas genéticas têm valor prognóstico, os níveis de expressão foram determinados em primeiro lugar através de uma série independente dos pacientes (n = 78; Tabela S1) no tumor

relação

tecido circundante por meio de análise nCounter (ver Materiais e Métodos) e, em seguida, submetido a análise univariada para potencial correlação com o prognóstico /sobrevivência. Em primeiro lugar, genes assinatura overexpressed na PSP são relacionadas com prognóstico, enquanto que não houve correlação com os genes de assinatura reprimidos na PSP (dados não mostrados). Além disso, a regulação positiva de

ABCB1

e

CXCR4

é significativamente correlacionada com pior prognóstico, ou seja, com menor OS e DFS (Tabela S5). A análise multivariada foi então realizada nos genes com p 0,1 na análise univariada (

ABCB1

,

ADAM10

,

CDH1

,

CXCR4

,

ESRP1

,

MMP1

,

RAB25

,

ST14

), designando

ABCB1

como um preditor independente de pobre OS (Tabela S5) .

Discussão

no presente estudo, identificamos uma SP em câncer pancreático humano. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que descreve a presença de um SP em PDAC analisados ​​de doentes. Como em outros tecidos e tumores, a PDAC SP contém uma fracção de CD31

+ células endoteliais e CD45

+ células do sistema imune [20]. No estudo atual, nós nos concentramos sobre a não-endotelial, SP não imune (PSP) e examinou seu perfil de expressão gênica. O PSP representa principalmente as células epiteliais tumorais dada a elevada expressão de

CDH1

,

EPCAM, TJP1

e

TJP2

[21]. Neste PDAC pSP encontramos regulação positiva do transportador multidroga

ABCB1

, que pode ser responsável pela quimiorresistência destas células. A imunocoloração confirmou a presença de ABCB1 em PDAC, localizado principalmente na superfície apical das células tumorais em que possa ocorrer o transporte da droga activa. Regulação positiva de fatores de regulação da apoptose (

Bcl2L11,

dobrar: 2,9, p 0,001;

EphA2

, consulte Resultados) no PDAC PSP poderá apoiar ainda mais seu caráter resistente à quimioterapia. Mostrámos recentemente que o SP é altamente resistente a gemcitabina num modelo de rato em que PDAC foi crescido como xenoenxertos [12]. Resistência da SP para gemcitabina também tem sido relatada em linhas celulares de cancro do pâncreas e

In vitro

[8], [9], [11]. Tomados em conjunto, o SP parece representar uma subpopulação resistente à quimioterapia do tumor pancreático, podendo, assim, ser um dos culpados para o fracasso do tratamento e recorrência do câncer.

Em vários tipos de câncer, o SP é enriquecido para o candidato CSC [7], [22]. Descobrimos que os marcadores recentemente identificadas em populações CSC putativos de cancro pancreático humano, são regulados positivamente no PDAC PSP. Além disso, foram detectados alguns outros marcadores “stemness câncer ‘(por exemplo,

LGR4, SOX9, KLF5, MET

), bem como fatores relacionados à embriogênese do pâncreas que pode ser re-iniciadas na CSC (por exemplo,

HNF4A

) [5], [6], [23] – [26]. Além disso,

in silico

análise funcional dos dados de expressão destaca a ocorrência de vias de desenvolvimento embrionário e pluripotência das células-tronco embrionárias no PDAC SP, apoiando ainda mais a sua ‘stemness’. Além disso, em linhas celulares de cancro do pâncreas, o SP apareceu enriquecido em CSC [9] – [11]. No entanto, é claro que são necessárias mais provas para demonstrar conclusivamente o fenótipo CSC da PSP, incluindo a atividade tumorigênico

in vitro

(esfera formação) e

in vivo

(o crescimento do tumor em ratinhos imunodeficientes ).

O PDAC pSP poderá representar um alvo terapêutico interessante dado o seu chemoresistance- e caráter CSC-associado. As células PSP expressam altos níveis de

CXCR4,

que após a ativação, pode estimular as células a se mover ou se submeter a “transição epitelial-mesenquimal ‘(EMT), a progressão do cancro processo de condução e malignidade. Em linhas celulares de cancro do pâncreas, o SP pode, efectivamente, ser activados no sentido de EMT quando tratados com TGF [21]. No PDAC PSP, observou-regulação positiva de

Smad3

, conhecida por mediar a sinalização TGF. Mais interessantemente,

CXCL12

, o ligando de CXCR4, é altamente expresso no tecido pancreático circundante do tumor PDAC (dados não mostrados) e podem atrair células de tumor para a invasão ou disseminação posterior. Em analogia, a expressão de CXCR4 foi encontrado para caracterizar uma subpopulação de a CD133

+ CSC pancreático que parecem ser reponsável para a metástase do tumor [6], [27].

A sobre-regulação de

EphA2

e

EPHA4

na PSP está em linha com um importante papel da via de sinalização Ephrin no PDAC patogênese. A expressão do EphA2 em PDAC tem sido associado com o aumento da capacidade invasiva e metastática e baixa sobrevivência [28]. Knockdown de expressão EPHA4 diminui a viabilidade celular PDAC [29]. Além disso, verificou-se que a via de sinalização ErbB é regulada no sistema PSP (análise KEGG), incluindo a maior expressão de

ErbB3

. O receptor ErbB3 desempenha um papel crucial no desenvolvimento do pâncreas, bem como na tumorigénese pancreático. Superexpressão de

ErbB3

se correlaciona com estágio PDAC avançada e diminuição da sobrevida global e, recentemente, o seu papel como mediador potente da sinalização PI3K foi destacado [30], [31]. Além disso, a activação de ErbB3 pode ser essencial para a resistência a um único agente, a inibição do EGFR. Especificamente inibição da actividade de ErbB3 (por exemplo, com MM-121) parece promissora

In vitro,

e, assim, também pode ter um potencial clínico [31]. Ambas as vias de sinalização e Efrina ErbB pode apresentar potenciais alvos terapêuticos PDAC. Deve-se notar que o nosso estudo não examinou o valor prognóstico da

EphA2

e

ErbB3

uma vez que estes genes não foram incluídos nas assinaturas PSP avaliadas contra a sobrevivência.

A desenvolvidos assinaturas genéticas PSP confiantemente discriminar o PSP do PMP. Alguns dos genes regulados positivamente estão relacionados com a CSC ‘stemness câncer’ /tais como

CXCR4, CD133, EPCAM

e

SOX9

[5], [6], [24], enquanto outros são associada a apoptose (

FASLG, TJP2, DUSP4

), a via MAPK (

MAP2K4, DUSP4

) e chemoresistance (

MMP1

, um

ETS1

gene alvo) [32], [33]. Além disso, a assinatura contém genes relacionados com aumento da motilidade e invasão (

ADAM10, RAB25, DUSP4, CXCR4

). Além disso, alguns desses genes podem representar alvos promissores.

Finalmente, foi avaliada a relevância prognóstica de genes incluídos nas assinaturas PSP.

CXCR4

e

ABCB1

são negativamente relacionada à sobrevida após a ressecção curativa, que também é encontrada em outros relatórios [34], [35].