Abstract

Fundo

Nós usamos proteômica modernas intensivas abordagens para identificar proteínas preditivos no cancro do ovário. Nós identificar proteínas regulado para cima em ambos soro e fluido peritoneal. Para avaliar o desempenho global da abordagem que acompanhar o comportamento dos 20 marcadores validados através destes experimentos.

Metodologia

espectrometria de massa com base proteômica quantitativos seguintes extensa fracionamento de proteínas foi utilizado para comparar o soro de mulheres com câncer de ovário seroso a mulheres saudáveis ​​e mulheres com tumores de ovário benignos. A quantificação foi conseguida por aminoácidos de cisteína isotopicamente de rotulagem. espectrometria de massa livre de etiqueta foi utilizado para comparar fluido peritoneal de mulheres com tomadas do cancro do ovário seroso e aqueles com tumores benignos. Todos os dados foram integrados e anotado com base em se as proteínas foram previamente validado utilizando ensaios baseados em anticorpos.

Achados

Foram selecionados 54 proteínas séricas quantificados e 358 proteínas do líquido peritoneal cujas diferenças de caso-controle excedido um limite predefinido. Dezessete proteínas foram quantificadas em ambos os materiais e 14 são extracelular. Dos 19 marcadores foram identificados e validados que todos foram encontrados no fluido peritoneal do cancro e um subconjunto de sete foram quantificados no soro, com uma destas proteínas, IGFBP1, recentemente validado aqui.

Conclusão

proteoma profiling aplicada a casos de cancro do ovário sintomáticos identifica um grande número de up-regulada proteínas séricas, muitos dos quais são ou foram confirmados por imunoensaios. O número de marcadores validados atualmente conhecidos é mais elevada no líquido peritoneal, mas eles fazem uma percentagem mais elevada das proteínas observadas em ambos soro e fluido peritoneal, sugerindo que os 10 marcadores adicionais neste grupo podem ser candidatos de alta qualidade.

Citation: Amon LM, Direito W, Fitzgibbon MP, JA Gross, O’Briant K, Peterson A, et al. (2010) Integrative proteômica Análise de soro e peritoneal Fluidos ajuda a identificar proteínas que são sobre-regulada em soro de mulheres com cancro do ovário. PLoS ONE 5 (6): e11137. doi: 10.1371 /journal.pone.0011137

editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Março, 2010; Aceito: 26 de maio de 2010; Publicação: 15 de junho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Amon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi financiado em parte com fundos federais do National Cancer Institute, National Institutes of Health, com os números de concessão U01 CA111273, CA83636 P50, contrato No. HHSN261200800001E, ea Fundação Canárias. O conteúdo desta publicação não reflecte necessariamente a posição nem as políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica o endosso pelo Governo dos EUA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário (OC) é uma das principais causas de sofrimento e morte para as mulheres nos Estados Unidos, e diagnosticar numa fase pré-metastático pode reduzir drasticamente a mortalidade. Embora as contas de OC para apenas 4% de todos os diagnósticos de câncer em mulheres (National Cancer Institute. https://www.cancer.gov) é o mais letal de todos os cânceres ginecológicos. Tal como acontece com muitos tipos de câncer, a sobrevivência de uma mulher [1] com o OC está fortemente associada com o seu estágio no momento do diagnóstico. câncer de ovário seroso (SOC) é a histologia mais prevalente e mortal; mais de 70% de todos os casos OC são diagnosticados em um estágio metastático.

estratégias de detecção precoce dos OC actualmente a ser avaliada tipicamente envolveu a combinação de um ou mais marcadores de sangue (tipicamente o marcador CA-125) como um meio de encaminhar as mulheres a uma modalidade de imagem de confirmação, tais como ultra-sonografia transvaginal. Quando se utiliza um marcador como uma tela de primeira linha, o desempenho de toda a estratégia de rastreio será limitado pelo desempenho deste marcador e um atributo de desempenho extremamente importante para um marcador de detecção precoce é lead-time, isto é, como mais cedo no processo da doença o marcador eleva. Embora os resultados preliminares sugerem que a obtenção de um limiar de valor preditivo positivo de 10% [2] é possíveis, usando a abordagem multimodal sequencial, as abordagens de modelagem [3] – [6] e estudos de validação pré-clínicos de perfis CA 125 e outros marcadores [7 ] sugerem que o lead-time obtido a partir de CA 125 pode ser insuficiente para reduzir significativamente a mortalidade em uma grande fração de mulheres.

Muitos outros de CA 125 marcadores foram identificados e validados em estudos independentes, utilizando amostras coletadas no tempo de diagnóstico clínico [8] – [18]. Referimo-nos a esses marcadores como “proteínas preditivos validados”, o que queremos dizer proteínas confirmados utilizando imunoensaios em várias amostras independentes e, portanto, como um grupo, são susceptíveis de ser predominantemente positivos verdadeiros. Mais recentemente, muitos destes marcadores foram avaliados em amostras obtidas antes do diagnóstico e sugerem que podemos esperar algumas proteínas validados na doença sintomática para elevar também antes de desenvolver sintomas [7]. Claramente, melhorando a detecção precoce para SOC vai exigir a identificação de novas classes de marcadores, possivelmente por plasma ou abordagens proteômicas soro.

Um dos objetivos do nosso estudo inclui a identificação de marcadores adicionais usando proteômica do soro. No entanto, a viabilidade de descobrir proteínas diferenciais no soro e plasma tem sido controversa e não muito bem sucedida, e assim um objetivo secundário do nosso estudo é validar o fluxo de trabalho experimental proteoma global soro utilizando vários marcadores como padrões de ouro. Neste artigo descrevemos um conjunto de experimentos de proteômica que interrogar misturas complexas de biomateriais OC humanos. Os experimentos tiveram dois propósitos; o primeiro era para identificar proteínas anteriormente não identificados que podem ser candidatos adicionais como marcadores preditivos. O segundo foi validar a abordagem proteômica do soro, acompanhando o comportamento das proteínas preditivos validados conhecidas a fim de estabelecer que a plataforma é capaz de descobrir marcadores. Primeiros esforços de descoberta de plasma e proteoma do soro, na maioria das vezes contando com SELDI ou métodos MALDI [19] – [26], ter falhado a este respeito. As abordagens mais recentes utilizando MS em tandem combinado com fraccionamento intensiva [27] – [29] pode ser mais adequada para a descoberta de soro e plasma como biomarcador que foram mostrados para identificar proteínas para o cancro pancreático [30] que foram subsequentemente validado. No entanto, porque o sucesso de qualquer abordagem de descoberta certamente dependerá das características da doença, tanto quanto a tecnologia, antes de investir recursos no desenvolvimento de anticorpos para novos marcadores, primeiro desejado para confirmar que o método é capaz de produzir resultados reprodutíveis.

Temos interrogado tanto um fluido circulante, soro, fluido e uma extremidade proximal para o tumor, o fluido ascítico ou fluido peritoneal de pacientes de controlo com tumores benignos serosos (BST). Realizamos duas experiências diferentes no soro: a primeira experiência em comparação pools de soro de pacientes SOC metastáticos para piscinas de voluntários assintomáticos saudáveis ​​pareados; No segundo experimento, em comparação pools de soro de um conjunto diferente de pacientes SOC metastáticos para pools de soro de mulheres com BST. Para os experimentos de fluidos proximais, comparamos poças de líquido de ascite de pacientes SOC metastáticos para poças de líquido peritoneal de pacientes com BST. Em todas as experiências, as amostras foram emparelhados com base na idade, duração de armazenamento, de substituição hormonal utilização terapêutica e tempo de recolha antes da cirurgia (para comparação caso /controle). Ao combinar esses conjuntos de dados e identificação de proteínas que parecem ser regulada para cima no SOC no soro e proximal fluido para o tumor, esperamos enriquecer a nossa lista de potenciais candidatos com marcadores específicos do cancro.

Resultados

Anotação de proteínas com base em recursos de dados existentes

a lista de 21 proteínas previamente mostrado ser regulada para cima no plasma ou soro de SOC em relação ao controle saudável por ensaios de ELISA foi compilado através da análise do biomarcador OC literatura. Identificamos essas proteínas, bem como uma proteína adicional, IGFBP1, descobertos e validados neste trabalho como verdadeiros controlos positivos. Quatro das verdadeiras proteínas positivos não foram identificadas no plasma ou fluido peritoneal: MUC16 [31] – [33], TNFRSF6B [14], VTCN1 [14], [17] (alias de CA 125, DcR3, B7-H4, respectivamente ) e VEGF [16]. A Tabela 1 lista os 19 verdadeiros positivos proteínas que foram identificadas no plasma ou fluido peritoneal [14], [16], [17], [31] – [33]. Todos eles foram observados e quantificados em fluido peritoneal, e 7 foram observadas no plasma; há controlos positivos foram identificados exclusivamente no plasma.

comparações soro

Os experimentos de proteômica séricas (descritos abaixo), em comparação metastático câncer de ovário seroso (SOC) para formas assintomáticas (HA) mulheres saudáveis ou mulheres com tumores benignos serosos (BST). A Tabela 2 mostra o número total de proteínas quantificadas em cada experiência soro. Mais de 360 ​​proteínas foram quantificados em cada experiência e um total de 470 proteínas foram quantificados em, pelo menos, uma ou a outra experiência. Colapso destas proteínas por resultados símbolo gene em totais ligeiramente mais baixas, devido às diferentes isoformas identificadas para o mesmo gene. Na Figura 1, a associação entre a proporção de log2 para todas as proteínas quantificadas pelo símbolo gene para os dois experimentos do soro é representada graficamente (eixo horizontal e vertical reflectir SOC contra HA e contra SOC BST, respectivamente). Note-se que todas as proporções são orientados de maneira que um valor positivo significa uma proporção maior de proteína em SOC. Proteínas que não foram observados em um experimento são representados por uma razão de pseudo ‘1’ (log2 = 0) para esse experimento.

pontos verdes representam proteínas up-regulamentados em ambos os experimentos. Os pontos azuis representam proteínas sobre-regulada em um experimento e não observada na outra. * Marcador de Referência validado por ensaio de ELISA; ** Novo marcador validado por um ensaio ELISA

Figura 1 revela um padrão promissora que se pode esperar para ver em um experimento que compara duas misturas complexas e em que algumas proteínas diferenciais são observados.: a maioria das proteínas caem perto da origem e pode variar de uma maneira não correlacionadas uma vez que não há mudanças sistemáticas que ocorrem, mas são um número deles na tendência quadrante superior direito longe da massa. Para o propósito de caracterizar os nossos resultados, nós rotular como uma proteína sobre-regulada, se a sua razão de consenso atende ou excede uma alteração de 2 vezes (ou seja, log2 (SOC /ha) + log2 (SOC /BST) ≥1 como indicado pela linha na Figura 1). Todos os 54 proteínas que preenchem este critério são mostrados em verde, se observada em ambas as comparações ou azul se observado em apenas um. Estas proteínas também são listados na Tabela S1 (na informação suplementar).

Aquelas proteínas que correspondem às nossas proteínas de “referência” a partir da Tabela 1 são indicados com um asterisco. Um total de sete proteínas de referência foram observadas no soro incluindo seis que foram previamente validados, bem como um marcador adicional, IGFBP1, denotado com um asterisco duplo, que foi validado aqui com base nestas experiências. Todos os sete das proteínas de referência observados foram up-regulada pelos nossos critérios. O enriquecimento observada (7 de 7) é altamente significativa (p-value = 1e-6), demonstrando que a nossa análise proteômica do soro encontra alta concordância com os ensaios validados.

experimentos líquido peritoneal

A experimentos líquido peritoneal são comparadas usando um método sem rótulo que nos permite quantificar todas as proteínas observadas, não só aqueles que contêm um aminoácido de cisteína isotopicamente. Após o colapso pelo símbolo do gene, 2950 proteínas são observados em ambos os experimentos. A comparação de log2 (péptido contagens espectrais) entre SOC para BST está representada na Figura 2. Por conveniência, as proteínas com contagem espectral = 0 em um líquido, mas são observados no outro fluido é definida como 0,5. Definimos uma proteína sobre-regulada como se dispõe de um péptido SOC contar, pelo menos, duas vezes maior do que a contagem de BST péptido correspondente. A partir das 2950 proteínas identificadas por símbolos gene, 358 são selecionadas como potencialmente-regulada com base neste critério (ver Tabela S1). Proteínas que também foram encontrados-regulada nos experimentos de soro são mostrados em vermelho. Nós também anotar essas proteínas relatados por Kuk

et al

[34] que avaliou líquido ascítico SOC. Em nossos experimentos, 73 dos candidatos Kuk são observados, mostrado em azul na Figura 2, e são amplamente distribuídas entre os SOC e BST conta com apenas 37-regulada. Kuk

et al

não avaliou material do BST. Como nas experiências de soro, encontramos um enriquecimento significativo de biomarcadores validados entre as proteínas sobre-regulada em líquido ascítico. Dos 19 proteínas de referência observados em qualquer fluido peritoneal (marcado na Figura 2), mas todos os dois, MIF e MSLN, foram sobre-regulada (p-valor = 2e-16). Note-se que MIF-regulação é possivelmente associado com viés de amostra apuração [9]. Os dados aqui são consistentes com as conclusões do Kuk

et al.

Que o fluido ascítico câncer pode ser um recurso valioso para a identificação de candidatos biomarcadores, embora os nossos resultados do BST sugerem que muitos deles não vai ser câncer específico.

pontos vermelhos são regulados positivamente no soro SOC. Os pontos azuis são proteínas observadas no líquido ascítico cancro do ovário por Kuk et al [34]. proteínas de referência estão rotulados. Pontos acima linha tracejada verde são consideradas-regulada no líquido peritoneal.

Comparação de soro contra peritoneal

fluido

Para comparar os dois tipos diferentes de, as relações de consenso log2 fluidos mais de dois experiências de soro foram representadas em função do rácio de log2 de fluido ascítico SOC sobre BST fluido peritoneal, conforme mostrado na Figura 3. Uma vez que apenas as proteínas observadas em ambos os materiais podem ser representados graficamente, esta comparação inclui apenas os 358 proteínas observadas em ambos soro e fluido peritoneal. Um total de 17 destas proteínas foram designados como regulado para cima em ambos os conjuntos. A concordância global de todas as proteínas, tal como medido pela correlação nas proporções, não é forte, mas isto não é inesperado uma vez que a maioria das proteínas não muda entre as duas fontes e para as fontes de variação experimental deve predominar. Apenas entre as proteínas que variam sistematicamente entre caso e controle deve encontramos concordância. As 17 proteínas que são sobre-reguladas em ambas as experiências (listados na Tabela 3 e mostrado em azul na Figura 3) são altamente enriquecida para os biomarcadores validados listados na Tabela 1. Todos os sete proteínas de referência observados medidos em ambos os experimentos foram encontrados sobre-regulada (p-valor = 2e-16). No entanto, o maior benefício observamos usando a sobreposição das duas experiências é um aumento substancial na percentagem de marcadores validados entre todos os marcadores supra-regulados. No soro, 15% das proteínas foram sobre-regulada e as proteínas de referência na lista de candidatos de fluido ascítico, 5% eram proteínas de referência. Se usarmos a sobreposição dessas duas experiências, a percentagem de proteínas candidatas a partir da lista de referência validados aumenta para 7 dos 17 (41%).

As proteínas regulado para cima em ambos os fluidos são de cor azul. * Marcador de Referência validado por ensaio de ELISA; ** Novo marcador validado por um ensaio ELISA.

Além de dados experimentais, a Tabela 3 também inclui a anotação para duas categorias GO, região extracelular e inflamatória ou resposta ao ferindo onde um “sim” indica que a proteína é anotada para esse termo, quer a folha ou um nó pai. A “região extracelular” termo indica que a proteína está localizada no exterior da membrana plasmática e poderia ser segregada para o sangue. Entre as 17 proteínas, 14 (82%) deles são anotados como extracelular em comparação com 17% de todas as proteínas observadas nas experiências. Esta desproporção suporta a hipótese de que através da combinação de dados de circulando e fluidos proximais poderíamos ser mais provável para descobrir biomarcadores de proteínas secretadas ou galpão do tumor em vez de derivar em outras partes do host. Incluímos também GO termos relacionados à inflamação nesta tabela para descartar proteínas que podem não ser específico para o cancro. Apenas duas das proteínas de sobreposição 17 são conhecidas por estarem envolvidas em inflamação.

validação ELISA de IGFBP1

O estado de validação de todas as proteínas de 17 candidatos é indicada na Tabela 3. Os ensaios de ELISA comercial estão disponíveis para 8 das 17 proteínas. Destes, seis foram validados em estudos anteriores (ver Tabela 1). As restantes duas proteínas derivadas a partir deste estudo, MMP9 e IGFBP1, foram testados neste estudo.

validação foi realizada em três fases. Na primeira etapa, os marcadores foram testados numa série de misturas de diferentes proporções de mistura de soros de pacientes OC e uma pool de soros a partir de controlos de HA a partir do conjunto de amostras de filtragem (50 ° C, 9 controlos HA) descrito em Métodos. Ambas as proteínas tinham concentrações elevadas no conjunto alto OC mas apenas IGFBP1 mostrou uma dependência da concentração com a proporção de soros do cancro do ovário de controlar. Ambas as proteínas foram então testados contra amostras individuais do conjunto de filtragem (12 OC, 12 controlos) HA descrito nos Métodos. IGFBP1 níveis eram significativamente mais elevados no soro do cancro (p-valor = 0,0097), enquanto que os níveis de MMP9 não foram (p-valor = 0,20). Um terceiro conjunto de amostras que foi restrito a casos de câncer de ovário seroso (44 SOC, 78 HA controles) foi usado para confirmar a elevação da IGFBP1. Neste conjunto de dados, o significado do processo para controlar a diferença aumentada para 5.0E-4 e a curva ROC tinha uma AUC de 0,860. A curva ROC para estas amostras mostrados na Figura 4 demonstra a capacidade de IGFBP1 para classificar OC versus controlos HA e BST, que mostra resultados consistentes com o comportamento nas experiências de proteómica.

SOC vs HA é mostrado em preto e SOC vs BST em azul

Discussão

profiling proteômica do soro ou plasma para descobrir biomarcadores de câncer ainda não se reuniu com sucesso amplamente demonstrado [19] -. [26] em que as proteínas eram validado em amostras independentes ou utilizando plataformas independentes. Uma exceção notável é um estudo de câncer pancreático utilizando um modelo de rato e fracionamento em profundidade de proteínas intactas [30]. Neste artigo nós usamos uma abordagem semelhante para o conjunto MS perfilamento proteomic de soro em combinação com perfis de líquido peritoneal como fluido de tumor proximal. Temos produzido uma pequena lista de 17 biomarcadores encontrados até regulamentada em ambos soro e fluido proximal – que incluem 7 proteínas que foram validados utilizando ensaios ELISA existentes, incluindo um novo biomarcador SOC (IGFBP1). Os restantes 10 marcadores neste grupo pode representar candidatos de alta qualidade.

O nosso sucesso na identificação de muitos marcadores validados pode ter resultado de uma série de características no design experimental. viés amostra foi eliminada pela coleta de amostras cuidadoso e casos firmemente correspondentes aos controles. Além de combinar com base na idade, raça e história familiar de OC, controles também foram pareados em uso de TRH e número de dias antes da cirurgia na coleta de sangue. HRT tem sido demonstrado que afectam drasticamente os níveis de muitas proteínas de soro [35], [36]. Thorpe

et al [37] demonstraram que o sangue colhido no dia da cirurgia está associado com a elevação das várias proteínas do soro. Esse viés foi evitada aqui por correspondência amostra de cuidado com base na condição coleção caso /controle. Outro aspecto importante desta análise foi o uso de grande fraccionamento da amostra antes da EM. Esta concepção, o que foi mostrado para se obter as sensibilidades de concentração de 10 ng /ml de [35], [36], permitiu uma maior profundidade de cobertura proteoma por MS em tandem para identificar alterações potencialmente significativos.

Um aspecto importante do desenho das experiências de soro foi a utilização de três tipos diferentes de temas: pacientes com câncer de ovário, voluntários assintomáticos saudáveis ​​e pacientes com tumores benignos. As proteínas sobre-regulada em SOC em relação ao HA, mas não em relação a BST não são susceptíveis de ser específico para o cancro e foram eliminados da consideração. O mesmo aconteceu com proteínas regulado para cima em relação à BST, mas não a HA. Usando apenas o SOC vs comparação BST, que teria encontrado em 5 de 7 marcadores validados quantificados em oposição a 7 de 7 (TIMP1 e SLPI seria removido).

Combinando os dados de soro com dados de perfis de proteômica de líquido ascítico peritoneal nos permitiu identificar um grupo de proteínas têm uma grande fração das nossas verdadeiras proteínas positivas; eliminando proteínas não encontradas também no líquido peritoneal reduzimos nossos potenciais candidatos 54-17, mantendo todas as sete proteínas de referência quantificados no soro. Este resultado suporta a hipótese de que as proteínas identificadas numa proximal fluido para o tumor e também num fluido circulante vai identificar biomarcadores eficazes. Kuk

et al

[34] mostrou que do líquido de ascite de pacientes com câncer de ovário continha um grande número de marcadores de alta qualidade, e nossos resultados são concordantes com os resultados. No entanto, porque o número de referência proteínas encontradas no fluido peritoneal é maior do que a encontrada no soro, não se pode fazer a alegação de que mais marcadores podem ser identificados por requerendo observações em ambos soro e fluido proximal. Na verdade os nossos dados e que a partir de Kuk

et ai.

Sugerem que o fluido ascítico de dados proteómica pode conter o maior número de marcadores de alta qualidade. Os nossos resultados sugerem que as proteínas que requerem única a ser observado em ambas as amostras poderia levar a uma maior proporção de marcadores de alta qualidade. Esta hipótese não pode ser confirmada, no entanto, sem também avaliar sistematicamente marcadores verdadeira negativos, bem como verdadeiros positivos. Além disso, não identificar todos os marcadores conhecidos não indica que o marcador não é de alta qualidade, nem que o processo é necessariamente em falta. Por exemplo, a nossa plataforma não foi capaz de identificar CA 125 ou três outros marcadores que inicialmente selecionados como proteínas de referência, possivelmente devido a limitações de sensibilidade em espectrometria de massa. No entanto, dado que a plataforma é capaz de quantificar marcadores validados existente, seria encontrar concordância entre as duas plataformas tranquilizadoras, que encontramos aqui.

Em seus dados combinados de quatro diferentes métodos de fraccionamento Kruk

et al .

identificou 445 proteínas totais, um número consideravelmente menor do que os milhares de grupos de proteínas que observamos em nossos experimentos. Esta diferença é em parte devido ao seu foco no subproteome de proteínas inferior a 100 kDa como nosso conjunto inclui 490 proteínas superior a 100 kDa. Mas a utilização de fraccionamento intensiva podem ser responsáveis ​​pela disparidade restante. Apesar destas diferenças, as conclusões do seu estudo são altamente consistentes com os nossos resultados; depois de aplicar algumas técnicas de mineração de dados, eles reduziram a sua lista de candidatos para 77 proteínas (incluindo 25 marcadores OC conhecidos), 73 das quais foram observadas em nosso estudo. Como é evidente na Figura 2, as abundâncias relativas das proteínas Kuk incluem alguns que estão acima, bem como para baixo; apenas metade delas estão-se por duas vezes em relação ao fluido peritoneal benigna. Dos 19 proteínas de referência observados em qualquer tanque de fluido peritoneal, 17 têm contagens espectrais duas vezes mais elevada do que em SOC BST. Isto sugere que, embora Kuk

et al

estavam corretos em sua afirmação de que o fluido ascítico é uma rica fonte de potenciais marcadores, nosso trabalho sugere que a inclusão de um material de controle pode ser útil na redução de falsos positivos. Um dos pontos fortes deste estudo é o uso de abundância relativa de SOC a BST para encontrar proteínas específicas para a doença maligna.

A questão de proteínas inflamatórias de confusão (recentemente abordado pelos Checlinska

et al

[38]) é minimizado de várias maneiras em nosso estudo. Em primeiro lugar, os nossos métodos de exaustão e de fracionamento permite-nos o acesso a proteínas além de apenas os altamente abundantes que muitas vezes incluem muitas proteínas relacionadas com a inflamação. Além disso, as nossas comparações entre o cancro e doença benigna filtrar muitas proteínas que aumentam devido à presença de um tumor benigno; proteínas inflamatórias partilhados por ambas as condições são eliminados. Além disso, uma vez que são proteínas segregadas por segmentação procura de sobreposição entre as proteínas no fluido proximal e aqueles elevadas no soro, que vai reduzir a possibilidade de observar proteínas séricas sintetizados no fígado como uma resposta inflamatória. Ainda assim, a Tabela 3 inclui duas proteínas (ORM1, SERPINA3) fora de candidatos 17 biomarcadores que têm papéis na inflamação. Embora tenhamos melhorado muito a proporção de biomarcadores relacionados com a inflamação sobre as experiências de perfis anteriores [39], [40], não podemos remover completamente todos os fatores de confusão e deve contar com a anotação quando disponível para promover a filtragem.

neste trabalho também descobriram e validado um biomarcador novo para o cancro do ovário seroso sintomática, proteína de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina 1. como IGFBP2, IGFBP1 é um membro da família de proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina e se liga a ambos os factores de crescimento semelhantes à insulina, IGF1 e IGF2. Tal como as outras IGFBP, IGFBP1 é expresso em tecidos locais, incluindo ovário, e está presente no plasma normal. Os níveis séricos de IGFBP1 são significativamente diminuída em mulheres pós-menopáusicas em terapêutica hormonal de substituição [35]. Embora os níveis séricos elevados de IGFBP2 foram demonstradas num certo número de cancros, incluindo os do ovário [10], esta é a primeira evidência de que os níveis de IGFBP1 aumentar no soro ou plasma de pacientes com cancro do ovário. Um outro estudo mostrou níveis elevados de IGFBP1 (e IGFBP2) no plasma de pacientes com câncer de cabeça e pescoço [41].

Finalmente, notamos também que entre os 17 marcadores mostrado ser regulada para cima no soro e do líquido de ascite de SOC, mas todos os três são secretadas proteínas. Embora seja rotineiramente alegou que as proteínas secretadas deve ser preferido como candidatos devido ao seu potencial para secretar no sangue, esta alegação não é muitas vezes suportado empiricamente. Nossos dados fornecem um forte apoio a esta hipótese geralmente aceite.

Conforme descrito na introdução deste manuscrito, embora vários marcadores biológicos para o câncer de ovário foram descobertos e validados, todos os marcadores têm mostrado um desempenho ruim no pré amostras -diagnostic. Neste estudo, partimos para estabelecer a capacidade de caracterização proteômica do soro para descobrir biomarcadores de câncer de ovário quando usado em conjunto com outros perfis de fluido proximal. Tendo demonstrado o sucesso desta abordagem, podemos agora aplicar estes métodos confiança para mais desafiador amostras de pré-sintomáticos.

Materiais e Métodos

Recrutamento e coleta de sangue humano e líquido peritoneal para a descoberta

Toda a pesquisa para este estudo foi especificamente realizado sob Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board aprovou protocolos, IR # 6045 e IR # 6094. Todas as amostras humanas foram obtidas de indivíduos que forneceram consentimento por escrito. Os dados foram analisados ​​de forma anónima.

O soro de mulheres com câncer de ovário seroso (SOC), tumores benignos serosos (BST), e dos controles saudáveis ​​e assintomáticos (HA) foi utilizado em nossa descoberta e validação de proteômica experimentos. protocolos de recolha de exemplo foram previamente descritos em detalhe noutro local, [37] [32]. Em resumo, soro e no líquido peritoneal de mulheres com SOC e BST foram coletadas antes da cirurgia e quimioterapia como parte de um Programa de cancro do ovário Especializada de Investigação Excellence (SPORE) financiado pelo National Cancer Institute. Diagnóstico de SOC e BST foram confirmadas por avaliação patologia central. Idade e terapia de reposição hormonal (TRH) controles pareados HA foram recrutados através de um programa de rastreio do cancro do ovário, onde todos os pacientes representam controles assintomáticos. Todas as amostras de soro, independentemente da fonte de recolha, foram tratados com o mesmo protocolo; o sangue foi recolhido em 10cc de soro Vacutainer separadoras tubos (SST) e deixada em repouso durante 30 minutos a 4 horas à temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 1200- × g durante 10 minutos, em seguida, dividida em várias alíquotas de 1 ml de soro e armazenadas à temperatura de -80 graus Celsius. Antes da utilização, cada 1 ml frasco de soro foi descongelado em gelo, dividida em várias subaliquots 110 microlitros, e armazenados de volta a -80 graus Celsius.

fluido peritoneal foi recolhido em um recipiente selado a vácuo estéril na sala de cirurgia pela equipe cirúrgica. Usando uma seringa de 1 cc estéreis, 20000 unidades de heparina (frascos contêm 10.000 unidades por cc) adicionou-se a cada litro de fluido para evitar a formação de coágulos sanguíneos. No laboratório, o líquido foi transferido para tubos de centrífuga cónicos de 50 cc ou (250cc, dependendo do volume de fluido) e centrifugou-se numa centrífuga a 2000 rpm equilibrada durante 5 minutos para sedimentar o componente celular. sobrenadante livre de células foi transferida para um tubo cônico de 50cc e cinco 1,5 ml microtubos para armazenamento a -80 graus Celsius congelador.

Seleção de amostras para experiências de descoberta

Apenas as mulheres na pós-menopausa com risco médio de câncer de ovário ou de mama foram incluídos (risco médio implica sem história familiar significativa de câncer de mama ou de ovário e sem diagnóstico de câncer anterior) nas experiências de descoberta. As mulheres primeiro experimento descoberta do soro em comparação com SOC fase tardia aos controles HA e o segundo em comparação com as mulheres com BST. Foram selecionados piscinas SOC de tamanho 4 (com controles saudáveis) e tamanho 5 (a BST) de ser bem combinado com controles com base na idade (+/- 2 anos), tempo de armazenamento da amostra (+/- 1 ano) e HRT [35 ]. Além disso, porque o ambiente coleção tem um efeito conhecido na proteoma do soro [37], casos e controles foram também combinava com base em se a coleta de sangue ocorreu no dia da cirurgia (para SOC versus controles BST) ou se eles foram recolhidos três ou mais dias antes à cirurgia (para SOC versus controles ha). Para as experiências de fluido peritoneal, de uma piscina de tamanho 10 amostras SOC foi comparada com uma piscina de tamanho 4 amostras BST. O tamanho da piscina para BST é menor, porque, enquanto uma grande parte dos pacientes SOC desenvolvem ascite, poucos pacientes BST produzir líquido ascítico comparáveis.

Seleção de amostras de soro para experimentos de validação

Experimentos para validar a proteínas foram realizadas por dois marcadores em três anteriormente descritos, [33] [32] conjuntos de amostras de soro. Estes conjuntos incluía dois conjuntos de filtragem. O primeiro conjunto foi composto por amostras reunidas de 50 pacientes OC (caso de piscina) serialmente diluídos com soro a partir de 9 HA controles (piscina de controle). O segundo conjunto foi composto de amostras individuais de 12 pacientes de OC e 12 controles HA. Um terceiro conjunto maior de amostras individuais foi utilizado para confirmar proteínas que mostraram elevação significativa no segundo set. A digestão foi realizada durante a noite a 37 ° C.