Abstract

A maioria dos homens diagnosticados com câncer de próstata terá uma doença indolente e curável, enquanto que cerca de 15% desses pacientes irá progredir rapidamente a um castrar-resistente e estágio metastático, com alta morbidade e mortalidade. Por conseguinte, a identificação da assinatura molecular (s) que detectam homens em risco de progressão da doença mantém-se uma necessidade premente e ainda não satisfeita para estes pacientes. Aqui, usamos uma plataforma de descoberta integrada que combina linhas celulares de cancro da próstata, um Transgénicos Adenocarcinoma do mouse próstata modelo (TRAMP) e amostras de tecidos humanos clinicamente anotados para identificar a perda de expressão de microRNA-34b como consistentemente associada a reincidência do câncer de próstata. Mecanisticamente, isto foi associado com epigenética silenciamento do locus MIR34B /C e um aumento da perda do número de cópias de ADN, selectivamente, no cancro da próstata dependentes de androgénios. Por sua vez, perda de miR-34b resultou na desregulação jusante e a sobre-expressão do marcador “stemness”, Sox2. Estes resultados identificam perda de miR-34b como um biomarcador robusto para a progressão do câncer de próstata em tumores andrógeno-sensíveis, e antecipar um potencial papel de progenitor /haste de sinalização celular neste estágio da doença

Citation:. Forno I, Ferrero S, Russo MV, Gazzano G, Giangiobbe S, Montanari E, et al. (2015) Desregulamentação de miR-34b /Sox2 prediz o cancro da próstata progressão. PLoS ONE 10 (6): e0130060. doi: 10.1371 /journal.pone.0130060

Editor do Academic: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 16 de fevereiro de 2015; Aceito: 15 de maio de 2015; Publicação: 24 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Forno et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes está contida no papel e em arquivos de suporte de informação. Além disso, os dados brutos de matriz TLDA foram incluídos na informação de apoio

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Cariplo com concessão n. 2010-0846 (para SB) (https://www.fondazionecariplo.it/it/index.html) e os Institutos Nacionais de Saúde concede CA140043 (LRL e DCA) e CA190027 (para DCA) (http: //subsídios .nih.gov /bolsas /oer.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a neoplasia maligna visceral mais comumente diagnosticado entre os homens em todo o mundo. Nos Estados Unidos, o PCA é responsável por 26% do total de novos casos de cancro e de 9% do total de mortes relacionadas ao câncer, segundo ranking ao câncer de pulmão. A probabilidade de desenvolver câncer de próstata do nascimento à morte é de 1 em 7, com maior incidência em homens acima de 70 anos de idade [1]. Embora a maioria dos homens diagnosticados com câncer de próstata terá um curso indolente e curável, cerca de 15% desses pacientes irá exibir uma doença rapidamente progressiva, resistente ao tratamento e metastático aos ossos e órgãos viscerais, com alta morbidade e mortalidade [2]. Como não há meio confiável de identificação de pacientes com risco de disseminação metastática estão actualmente disponíveis [3], a busca por assinatura molecular (s) da progressão da doença, especialmente transição para castrar resistência [4] é uma necessidade médica urgente e ainda em grande parte não atendida em gestão de um diagnóstico de câncer de próstata.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, não-codificação, RNAs endógenos com funções pleiotrópicas na expressão genética [5,6]. Esta via é dramaticamente explorado no cancro, e uma variedade de miARNs têm sido associados a vias supressores oncogénicos ou tumorais desregulados [7,8]. Reciprocamente, os condutores de malignidade, incluindo aberrações de DNA, desregulação transcricional e epigenética silenciamento contribuir para a expressão de miRNA aberrante [9,10]. Para a sua estabilidade em fluidos biológicos [11], ea relativa facilidade de detecção em amostras clínicas [12], os miRNAs foram perseguidos como biomarcadores tumorais [8], por seu potencial valor preditivo ou prognóstico em pacientes com câncer de mama [13], fígado [ ,,,0],14,15], ou de pulmão [16] câncer. miARN expressão desregulada também foi observada no cancro da próstata, em comparação com o epitélio normal [17-19], e em alguns casos ligado a disseminação metastática [20-22], mas assinatura definitiva (s) de progressão da doença, especialmente castrar-resistência, não foram identificados.

neste estudo, foi utilizada uma plataforma integrada descoberta combinando linhas celulares estabelecidas, um modelo genético do rato de progressão da doença, e amostras primárias do paciente ao perfil de expressão miRNA diferencial de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

espécimes clínicos

Os parâmetros clínicos e patológicos de pacientes CaP ou hiperplasia prostática benigna (BPH) examinados nestes estudos estão descritos na Tabela 1. Globalmente, recuperados de arquivo tecidos e prontuários de 192 pacientes submetidos à cirurgia 2004-2006 no Hospital San Paolo ou Hospitais Granda Fondazione IRCCS Ca ‘em Milão (Itália), ao abrigo de um protocolo aprovado pelo Institutional Review Boards (IRB) do Hospital San Paolo (código 10664 ) e Fondazione IRCCS Ca ‘Granda-Ospedale Maggiore Policlinico (código 1381-1311). Devido à natureza retrospectiva deste estudo eo uso de práticas de anonimato dos dados, a necessidade de consentimento livre e esclarecido foi dispensada. O acompanhamento consistiu na vigilância ativa dos pacientes pela medição consecutiva dos níveis séricos específicos da próstata antígeno (PSA). Para os pacientes APC, recorrência bioquímica foi definida como dois níveis de PSA consecutivas superiores a 0,2 ng /ml

Para molecular analisa casos devem teve conteúdo de RNA satisfatórios (260/280 Absorvância Rácio . 1,2 e 2,1 e 500 ng de RNA total) em pelo menos uma amostra normal e do tumor da próstata combinados por paciente. Sessenta e seis pacientes dos 192 avaliadas satisfeitos estes critérios e por cinqüenta desses neoplasia intra-epitelial também prostática (PIN) da lesão estava disponível. Por conseguinte, os pacientes foram distribuídos em um primeiro subconjunto com disponibilidade completa de, PIN e PCA tecidos normais (n = 50, série A; Tabela 1), e em um segundo subconjunto constituído pelos restantes doentes com amostras normais e tumorais apenas correspondentes (n = 16, série B, Tabela 1). tecidos epiteliais de próstata normal, PIN e PCA foram recuperados separadamente por perfurar blocos de arquivo com uma agulha de 1 mm de diâmetro, como descrito [23]. Cada amostra consistentemente superior a 80% de pureza no conteúdo da célula epitelial. amostras de tecido normal foi realizada a uma distância de, pelo menos, 2 cm de tecido neoplásico. O conjunto completo de pacientes incluídos neste estudo (n = 192, série C; Tabela 1). Foi usado para construir dezesseis tecido micro matrizes (TMA) blocos [24] para a avaliação de imuno-histoquímica

amostras BPH (n = 10) eram pacientes submetidos a ressecção transuretral da próstata (RTU) no Hospital Granda Fondazione IRCSS Ca ‘(Milão), para quem o mapeamento da próstata foi negativo para APC e acompanhados por pelo menos 3 anos (série BPH; Tabela 1). Esta série não foi incluído na plataforma TMA e cortes de tecidos completos foram usados ​​tanto para análises moleculares ou imuno-histoquímica.

As linhas celulares

linhas de células de próstata Humanos RWPE-1, BPH-1, LNCaP, células DU145 e PC3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A linha celular normal RWPE-1 foi cultivada em Meio de Soro Livre de queratinócitos suplementado com 5 ng /mL de EGF, 0,05 mg /ml de extracto de pituitária bovina, e 1% de Pen-Strep antibióticos coquetel. Todas as outras linhas celulares foram cultivadas em RPMI suplementado com 10% FBS e 1% de Pen-Strep. As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. Para miARN transfecção, as células foram semeadas a 5×10 por um

5 poço em placas de seis poços, e foram transfectadas, com 150 pmol de inibidor de miR-34b (A-miR-34b; HSTUD0511), ou o precursor de miR-34b (P- miR34b; HMI0511), ou sequências não segmentação correspondente (a-Ctrl ou p-Ctrl, respectivamente HMC0002 e NCSTUD001) na presença de Lipofectamine 2000 (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, EUA), como descrito [25]. Todas as moléculas miRNA foram da Sigma Aldrich, Milão, Itália.

microdissection assistida por laser de lesões da próstata de Transgénicos Adenocarcinoma do mouse próstata (TRAMP) ratos

blocos de tecido de arquivo do trato urogenital, incluindo bexiga, vesículas seminais e da próstata a partir de cinco ratinhos TRAMP foram utilizados [26,27]. Todos os ratinhos tinham desenvolvido tumores prostáticos e foram sacrificados às 24 semanas de idade. Todos os experimentos com animais foram revistos e aprovados por uma Comissão de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Thomas Jefferson. Desconforto e ferimentos aos animais têm sido limitados ao que é inevitável na condução da investigação científica valiosa. Todos os procedimentos experimentais efectuadas no âmbito deste estudo cumprir com protocolos aprovados para garantir os mais altos padrões de cuidado humano para os animais. Analgésicos, anestésicos e drogas tranquilizantes têm sido utilizados como determinado pelo pessoal veterinário. A eutanásia foi realizada por CO

2 anestesia. Este método é consistente com as recomendações do Painel de 1316 da eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana

amostras de próstata de ratinhos TRAMP foram enriquecidos em PIN ou da próstata tumores (S1 FIG) por microdissection assistida por laser (LMD.; Leica Microsystems, Milão, Itália) de lesões epiteliais, como descrito [28]. Para miARN perfis, CaP tecidos ou PIN de diferentes animais (n = 5 por grupo) foram reunidas.

purificação de ARN, retrotranscrição e Profiling MicroRNA

O ARN total foi isolado utilizando o Kit de Purificação de RNA MasterPure (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, EUA), como descrito [28], e retrotranscrito, utilizando os iniciadores de RT Megaplex humanos ou de roedores piscinas a e B v3.0 e kit Taqman MicroRNA Transcrição reversa. As amostras de ratinho foram pré-amplificado utilizando Megaplex PreaAmp piscinas iniciador Roedor A e B. humanos ou de roedores TaqMan matrizes de baixa densidade (TLDA) foram então realizados para miARN perfis em linhas celulares de cancro da próstata ou TRAMP tecidos prostáticos, respectivamente. TLDA humana inclui 754 miRNAs e 4 RNAs nucleolares endógenos (RNU44, RNU48 e U6snRNA), enquanto Rodent TLDA inclui 750 miRNAs e 6 RNAs de controle, dos quais 675 miRNAs e três controles endógenos (snoRNA135, snoRNA202 e U6snRNA) são específicos para mouse. Ambos plataforma Humana e Rodent inclui uma sonda de controlo negativo (ATH-miR-159a) por cartão. Para a validação, dezoito selecionados miRNAs além de transcrições de referência (U6snRNA, RNU48, RNU44 e RNU24) e dois controles negativos (ATH-miR-159a e uma sonda de detecção bem sem) foram analisados ​​em amostras humanas (séries A, B e BPH; Tabela 1) usando um personalizado RT e pré-amplificador de primers piscinas em conjunto com um costume plataforma TLDA com primers pré-pintadas e sondas Taqman. Todos os reagentes, kits e instrumentação utilizada para miRNA perfis eram da Life Technologies Inc. (agora parte da Thermo Scientific, Carlsbad, CA, EUA).

análise de metilação de MIR34B /C CpG ilha

o ADN genómico foi purificado a partir de 4 linhas de próstata de células (RWPE-1, HBP-1, LNCaP, DU145), 16 APC, de 12 tecidos prostáticos normais (da série B), e de 10 HBP (série BPH) amostras usando o DNA QIAamp Mini Kit (Qiagen, Waltham, MA, EUA). Conversão de sódio bissulfito de ADN (400 ng) foi realizada utilizando o kit de ADN-ouro EZ metilação (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). metilação específicas de reacção em cadeia da polimerase (MSP) de uma ilha CpG a montante do locus MIR34B /C foi realizada como descrito [29], utilizando os seguintes iniciadores para a detecção de não metilado (UM) ou metilado região (M): UM-forward 5? – TGTTTTTTGGTGAAATGGGGTTTGAGGT-3 ‘UM-reverso 5′- CCTACAAACCAAACACCAAACACCCACA3’; M-forward 5’CGGTGAAATGGGGTTCGAGGC-3 ‘M-reversa 5′- CCGAACACCGAACACCCGCG-3’. O perfil térmico era 95 ° durante 10 min seguido por 95 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 1 min e 72 ° C durante 1 min durante 45 ciclos e depois 72 ° C durante 7 min.

copiar a variação do número (CNV) análise

variações genómicas de aglomerado 11q23.1b e loci adjacentes foram analisados ​​por TaqMan número de cópias do ensaio relativamente ao gene de referência RNase P, como descrito [30]. Os números de identificação de ensaio foram como se segue: Hs00608392_cn (CNV # 1; localização exacta 111383042), Hs03049129_cn (CNV # 2; localização exacta 111368721) e Hs06336326_cn (CNV # 3; localização exacta 81902545). As variações no número de cópias de DNA foram quantificados usando software de cópia de chamadas. Todos os ensaios, reagentes e software eram da Life Technologies Inc.

alvos miR-34b expressão análise

Hyperplastic (BPH-1) ou tumor linhas celulares de próstata (LNCaP e DU145) foram transfectadas com miR -34b mímico /inibidor ou controlo durante 72 horas e o ARN total foi purificado como descrito acima. Em seguida, o RNA total livre de ADN foi transcrito de forma inversa com hexâmeros aleatórios e SOX2, CDKN1A, Met, c-myc, HES1 expressão de genes (gene TaqMan Ensaios de expressão) foi relativamente quantificada num transcrito de referência (beta-2-microglobulina) por Real- tempo de PCR (qPCR). Todos os reagentes e instrumentos eram de expressão alvo Life Technologies Inc. foi então calculada usando a 2 ^

-ΔCt fórmula, médio normalizado e LOG2 transformado para a geração de mapa de calor utilizando dChip softare (DNA-Chip Analyzer, www.dchip.org) como descrito [9].

imunotransferência

As células foram colhidas 72 h após a transfecção de miARN imita /inibidor e solubilizadas em tampão de lise de 100 ul suplementado com um cocktail inibidor de protease (Roche, Basileia, Suíça) , como descrito [25]. -Se alíquotas (50 ug) de cada lisado celular foram sondadas com 1 ug /ml dos seguintes anticorpos primários a c-Myc (clone D84C12; Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, EUA), Sox2 (clone D6D9; Cell Signaling Technologies), ou Notch1 (clone A-8; Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA). β-tubulina (Sigma Aldrich) foi usado como um controlo de carga. bandas reactivas foram visualizadas com ECL Plus (GE Healthcare, Milão, Itália).

construção de próstata tecidos microarrays (TMA) e imuno-histoquímica (IHQ)

De cada um dos 192 pacientes PCA (série C ; Tabela 1), quatro núcleos de tumor da próstata, um núcleo de PIN e um núcleo de parênquima normal se disponíveis foram utilizados para construir 22 blocos de TMA, tal como descrito [24], com modificações [23]. tecidos FFPE a partir de doentes com hiperplasia prostática benigna (BPH série; Tabela 1) foram utilizadas como secções completas e não foram incluídos no TMA. Quatro secções de um de espessura de cada bloco foram coradas com um anticorpo para Sox2 (1: 100; Cell Signaling), com diaminobenzidina (DAB) como um cromogénio. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando Referência Ultra imunohistoquímica Ventana Roche (Roche Group, Tucson, AZ, EUA). Todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Dois patologistas (GG e SF) cego aos dados clínicos avaliados e marcou todos os slides. Quando discrepâncias ocorreu, o caso foi novamente revista para chegar a um score acordo. Apenas reactividade para Sox2 nuclear em células epiteliais e não no compartimento mioepitelial basal foi registada e a percentagem de células imunorreactivas em amostras de CaP-se a média entre os quatro núcleos do mesmo paciente. De acordo com o relatório anterior [31], Sox2 imunorreatividade foi então classificados em quatro grupos e as pontuações foram então atribuídos da seguinte forma: escore 0 (coloração nuclear negativo), 1 (1-10% de Sox2 nuclear), 2 (11-50% de Sox2 nuclear), 3 (mais de 50% dos Sox2 nuclear).

Análise estatística

miRNAs quantidades relativas (RQ) foram obtidos a importação de arquivos de dados TLDA cru em software DataAssist (Life Technologies Inc .), utilizando um valor de 35 como limite para o máximo permitido Ct e normalização global para quantificação alvo. valores RQ foram então LOG2 transformados e importados em ArrayTools BRB (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html), onde Anova ou expressão diferencial análises foram realizadas, como descrito [15]. parâmetros de correlação entre a expressão de miRNA e as variáveis ​​clínico-patológicos foram obtidas usando Mann-Whitney U test, teste de Friedman ou teste do qui-quadrado para a variável contínua ou discreta, respectivamente, utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) ou MedCalc ( Mariakerke, Bélgica) pacote estatístico. Receptor método características de funcionamento (ROC) foi usado para testar a precisão dos miARNs para discriminar correctamente entre doença benigna, um pino ou cancro da próstata, e para identificar os pacientes que tiveram falha PSA (PSA 0,2 ng /ml durante pelo menos duas vezes consecutivas) durante o acompanhamento, como descrito [15]. software dChip foi utilizado para agrupamento hierárquico não supervisionado.

In vitro

experiências foram realizadas pelo menos três vezes e os dados são expressos como a média ± desvio padrão, a menos que especificado de outra forma. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

assinaturas de miRNA de modelos de cancro da próstata

Começamos este estudo de perfis de expressão de miRNA em um painel. tipos de células cancerígenas da próstata com potencial diferente tumorigênico (S1 Arquivo) e ratinhos TRAMP (S2 arquivo). Nestas experiências, miARNs expressão prontamente diferenciado de androgénio-insensível (DU145 e PC3) a partir de minúsculas tipos de células de cancro da próstata (Fig 1A). Consequentemente, as linhas celulares RWPE-1 e BPH-1 não tumorigénicas (Fig 1A) agrupados separadamente a partir de células LNCaP, mais agressivos. A seguir, seleccionado miARNs com base em dois critérios: uma diferença de 20 vezes entre os tipos de células andrógeno-sensível ou insensíveis e não-tumorigénico RWPE-1 ou LNCaP tumorigénicas (Fig 1B) (i), e uma variação significativa (p 0,05 por Anova) na expressão entre o normal, hiperplasia, sensível ao androgénio e insensíveis células (Fig 1C) (ii). Estas análises identificaram 18 miRNAs, e 16 dessas transcrições teve orthologs rato (Fig 1D).

A) Calor-map de perfis de miRNA globais (≈750 miRNAs) em não-tumorigénico (RWPE-1, Normal) , hiperplasia (BPH-1), andrógeno-dependentes (LNCaP, AR

sens-PCA) ou independentes (, DU145 e PC3 AR

ins-PCA) células cancerosas da próstata. Vermelho, a sobre-expressão; azul, sub-expressão, respectivamente. B) Scatterplots diagramas foram realizadas entre as células CaP independente e-andrógeno-dependentes e entre as células da próstata normais e AR

sens células CaP para selecionar miRNAs com expressão diferencial em qualquer direção (fold-change) de pelo menos 20 dobras. Uma lista de 41 miRNAs simultaneamente alterados em ambas as comparações foi gerado. C) Diagrama esquemático de critérios de seleção adotados para identificar miRNAs potencialmente relacionadas com a CaP. D) Os dezoito assinaturas de miARN identificados em C foram verificados por qPCR nas células da próstata indicados. Todos os miRNAs, exceto dois (miR-577 e miR-886-3p) tiveram orthologs do mouse. Vermelho, cores brancas e azuis no calor-map representam maior, igual ou menor expressão miRNA em amostras de respeitar a valor mediano miRNA.

A seguir, realizada profiling miRNA global das LMD PIN ou lesões tumorais de TRAMP ratinhos (Fig 2A), utilizando-se uma diferença de corte de 20 vezes na expressão de miARN entre as duas amostras (Fig 2B). Um centenas vinte e um miRNAs cumpriu esses critérios (Fig 2B e 2C), e 61 miRNAs teve orthologs humanos (S1 tabela). Nesta análise, apenas quatro miRNAs foram diferencialmente expressos em ambas as linhas celulares de cancro da próstata humana e amostras de tumores de ratinhos TRAMP, incluindo miR-34b-3p, miR-34c-5p, miR-138 e miR-224 (Fig 2C e 2D ). Por conseguinte, o perfil de expressão destes quatro microARNs demonstraram que as células DU145 ou PC3 independente de androgénios foram mais intimamente relacionado com tumores TRAMP, do que outras linhas de células humanas (Figura 2D).

A) global miARN perfis de cancro da próstata (PCA) ou neoplasia intraepitelial prostática (PIN) lesões isoladas de ratinhos TRAMP. B) Diagrama de Dispersão de miRNAs com expressão diferencial de pelo menos 20 dobras entre PIN e tecidos PCA do ratinhos TRAMP. Dos identificados 121 miRNAs desregulados (S1 Tabela) 61 teve orthologs humanos. C, D) Comparação das assinaturas de miARN significativas entre as linhas de células de próstata e lesões TRAMP. Apenas quatro miRNAs foram em comum entre os dois sistemas experimentais. Análise da expressão seguido de agrupamento sem supervisão hierárquica D) de miR-224, -34b-3p, -138 e miR-34c-5p revela que as células de cancro de próstata independente de androgénios são mais semelhantes aos tecidos TRAMP do que para androgénio-dependente ou não-tumorigénico células humanas da próstata.

modelo LNCaP CaP espelha desregulamentação miRNA na doença prostática humana

a seguir, examinou os miRNAs identificados acima (n = 18) em uma série de 50 pacientes (série a ; Tabela 1) com um espectro de lesões, incluindo APC, PIN e epitélio normal. MiR-31, o miR-34b-3p, miR-205, o miR-224 e miR-452 mostrou níveis de expressão diferencial entre o normal, PIN e CaP combinados amostras (p 0,01 pelo teste de Friedman; figura 3). Todos os miRNAs foram regulados negativamente em CaP em comparação com o epitélio normal, combinando os resultados obtidos com LNCaP, RWPE-1 ou 1 BPH-tipos de células (Fig 1D).

glândulas prostáticas normais correspondentes, neoplasia intraepitelial prostática (PIN lesões) e câncer de próstata (PCA) disponíveis a partir de 50 pacientes foram testados para níveis de dezoito miRNAs selecionados expressão. MiR-31, 34b-3p, 205, 224 e miR-452 indicado alterou significativamente os níveis de entre as três classes de tecido (p 0,01 pelo teste de Friedman). Bares, média ± SEM. RQ, quantidade miRNA relativa

A seguir, focada nesses cinco miRNAs, e examinou o seu potencial associação com parâmetros clínicos de progressão APC, incluindo recorrência bioquímica (dois valores de PSA consecutivos . 0,2 ng /ml durante follow-up), pontuação de Gleason (GS ≤7

vs

GS 7), o tamanho do tumor (T2

vs

T3-T4 PCA) e linfonodos metástases. Para mais de validação, foi utilizado um conjunto adicional, independente de dezesseis pacientes (série B na Tabela 1) para um número total de 66 analisadas CaP. Nesta análise, os níveis de miARN reduzidas correlacionados com a progressão clínico-patológicos de CaP (quadro 2), e a expressão diferencial de miR-31, o miR-34b-3p e miR-452 era capaz de discriminar significativamente pacientes de acordo com a recidiva bioquímica (Fig 4A). Em seguida, foi perguntado se o mesmo conjunto de cinco miRNAs poderia discriminar entre PIN e lesões APC, portanto, semelhante à relação entre as células LNCaP BPH-1 e. Para estas experiências, nós avaliamos dez pacientes submetidos a RTU da HBP (BPH série na Tabela 1), e foram acompanhados por pelo menos 3 anos no Hospital Granda Fondazione IRCCS Ca ‘. Ambos miR-31 e miR-34b-3p foram diferencialmente expressos entre o pino ou amostras APC e BPH (p 0,001 pelo teste de Mann-Whitney; Figura 4B). Diferentemente do perfil observado em linhas celulares, os níveis de miR-34b-3P aumentaram mais de dez dobras em amostras de HPB em comparação com PIN ou PCA. Finalmente, a expressão de miR-34b-3p discriminados com precisão amostras de PIN ou de PCA de HPB, por análise ROC (p 0,0001; Fig S2). nível de expressão de miR-205 foi menor em comparação com BPH PIN (p = 0,0027; Fig 4B). Por outro lado, miR-452 e miR-224 não foram diferencialmente expressos entre APC e BPH ou entre PIN e BPH, respectivamente (Fig 4B).

A) operating characteristic ROC) (receptor foram usadas para testar a precisão de miRNAs para identificar pacientes que tiveram falha de PSA durante o follow-up. AUC; A área sob a curva; CI, intervalo de confiança. B) miR-31, 34b-3p, 205, 224 e miR-452 de expressão foi avaliada por qPCR em glândulas pré-cancerosas desemparelhados (PIN, n = 50), lesões prostáticas neoplásicas (APC, n = 66), ou hiperplásica benigna tecidos (BPH, n = 10). **, P = 0,0027; ***, P 0,001, tudo pelo teste de Mann-Whitney. Bares, média ± SEM. RQ, quantidade miRNA relativa.

miR-34b repressão é um biomarcador de CaP

miR-34b e miR-34c são transcritas a partir do mesmo locus no cromossomo 11 ( banda citogenética 11q23.1; Fig 5A), e sua expressão é regulada por epigenética, como a ilha CpG metilação [29], ea função p53 [32]. Portanto, nós examinamos os doentes com HBP, um subconjunto de amostras de CaP (selecionados aleatoriamente da série B, Tabela 1), espécimes de próstata normais e linhas de células de próstata não tumorigénicas ou invasivas para cópia alélicas potencial de variação do número e status de metilação do CpG ilha do locus MIR34B /C (Fig 5B-5G).

a) diagrama esquemático do lócus MIR34B /C humana no cromossomo 11q. B, C) de miR-34b-3p e expressão de miR-34c-5p nas amostras indicadas de próstata normal (grupo de 10 amostras), hiperplasia benigna (BPH), cancro da próstata (CaP) ou não-neoplásicas (RWPE-1) , hiperplasia (BPH-1) ou linhas celulares de tumor da próstata (LNCaP, DU145). D, E) número de cópias de regiões de ADN genómico proximal para MIR34B /C lócus (CNV # 1; Hs00608392), ou para o gene BTG4 (CNV # 2, Hs03049129) foi avaliada por qPCR nas mesmas amostras descritas nos painéis B, C . valores de corte para perda ou ganho de metas de DNA em relação a um ensaio de referência (RNase P) significativa foram definidas como cópias 0,5 ou 4, respectivamente (sem alteração: CNV = 2). F, G) Análise de MIR34B /C CpG estatuto epigenética ilha foi realizada por metilação PCR específico em CaP parênquima combinado normal ou neoplásica () da próstata, amostras hiperplásicas benignas e linhas de células da próstata. Uma amostra foi considerada parcialmente metilado (M /UM) se amplificado por ambos os pares de iniciadores. M, metilado; UM, não metilado. Em branco, nenhum controle de modelo; NA, não amostra disponível.

Nestas experiências, o miR-34b-3p foi diminuída em APC, em comparação com amostras normais ou hiperplásicas da próstata, células BPH-1 ou LNCaP (Fig 5B). Em contraste, o miR-34c-5p tinha um padrão de expressão diferente nos tecidos humanos, o que sugere que os dois transcritos pode ser regulada de forma independente (figura 5C). análise genómico revelou que apenas a região proximal ao locus MIR34B /C (ensaio de CNV # 1; Figura 5D) exibiram a perda do número de cópias de ADN, como as sondas mais distantes (CNV # 2 e CNV # 3) não mostraram alterações no conteúdo genómico (Figura 5E e S2 Tabela). A perda do número de cópias de ADN era significativamente mais pronunciada em tecidos de APC, em comparação com glândulas hiperplásicas benignas (p = 0,01 pelo teste exacto de Fisher), e não foi detectável no conjunto de controlos normais (Figura 5D). Ambos CNV # 1 e # 2 foram perdidos em linhas de células BPH-1 e de células LNCaP, reflectindo potencialmente simultânea diminuição da regulação de miR-34b /c. Em contraste, as células DU145 não exibem a modulação de miR-34b /c expressão, ou cópia perda alélica número (Figura 5D e 5E).

Quando analisados ​​para verificação epigenética por metilação de PCR específica do, a ilha de CpG a montante do locus MIR34B /C (Figura 5F) foi significativamente mais metilado em cancros da próstata do que amostras normais ou hiperplásicas da próstata (50% versus 30% ou 0%, respectivamente, p = 0,026 por teste de qui-quadrado; Fig 5G). Um grau de metilação parcial podia ser detectado em todas as linhas celulares, mas BPH-1, no qual MIR34B /C lócus foi epigeneticamente silenciados (Fig 5F e 5G). Juntos, estes dados sugerem que a diminuição da expressão de miR-34b em CaP pode envolver uma combinação de silenciamento epigenético e DNA perda de número de cópia (S2 Tabela).

Um eixo miR-34b-3p-SOX2 é seletivamente desregulamentado em andrógeno-dependentes CaP

miR-34b-3p regula a expressão de factores relacionados com células-tronco, incluindo c-Myc, Sox2, Met e Notch1 [33,34], que também têm sido implicados no cancro da próstata [ ,,,0],35-37]. Consistente com estas observações, a expressão forçada de sequências precursoras miR-34B em diferentes linhas de células de próstata, mas não antagonista (painel A na S3 figura), de forma potente reprimido níveis Sox2 endógenos em células BPH-1 de células (Fig 6A) enquanto que não modular os níveis de expressão de c-Myc, Notch1 e Met (painéis B, C na Figura S3). Por outro lado, as células DU145 independente de androgénios não exibiram miR34b-modulação da expressão Sox2 (Fig 6A), e células LNCaP não tinham níveis detectáveis ​​de Sox2 (S4 figura). Finalmente, a proliferação de células não foi significativamente afectado, sob as diferentes condições testadas (Painel D na Fig S3).

expressão A) Sox2 foi analisada por imunotransf erência em células BPH-1 ou DU145 após transfecção imita com miR-34b ou sequência de controlo durante 72 h. Untr., Amostra não tratada. p-miR-34b ou a-miR-34b, precursor ou antagonista miR-34b; p-Ctrl ou a-Ctrl, não-selecção dos controlos de moléculas precursoras ou antagonistas. B) imunorreactividade Sox2 foi analisada num próstata TMA, que incluiu os tecidos normais, pré-neoplásico (PIN) e lesões tumorais (APC) a partir de 192 pacientes, e em doentes com hiperplasia prostática benigna (BPH) amostras. Sox2 é altamente expresso na camada de células basais a partir de tecidos não-neoplásicas e em células epiteliais no tecido do cancro. C, D) Sox2 expressão elevada caracteriza tecidos CaP de PIN ou lesões BPH e distingue pacientes APC com a recidiva bioquímica. O número de PIN, o PCA ou casos de hiperplasia prostática benigna (C) ou de grupo com CaP que foram submetidos ou não recidiva bioquímica durante o seguimento clínico (PSA sorológico 0,2; D) de acordo com graus de marcação Sox2 nucleares é ilustrada. p = 0,02 ou p = 0,0006, respectivamente pelo teste do qui-quadrado.

Quando analisados ​​em tecidos humanos (Fig 6B), Sox2 apresentaram níveis altamente heterogéneos de expressão, especialmente em tecidos CaP que variam de 0% a 70% de núcleos positivos (Fig 1C). Por outro lado, lesões de PIN ou BPH exibiram imunorreactividade alta Sox2 em células mioepiteliais basais (não marcado), enquanto seus compartimentos epiteliais exibido nível Sox2 baixo (≤10%; Sox2 pontuação = 1; Fig 1C). Conforme documentado anteriormente [31,36,38], imunorreatividade para Sox2 foi anatomicamente confinado a células mioepiteliais /basais nas glândulas não neoplásicas. Por outro lado, esse padrão foi progressivamente perdido em amostras de PIN e PCA. Na verdade Sox2 expressão em mais de 10% dos núcleos (escores Sox2 2 e 3) foi uma característica do CaP em comparação com PIN ou amostras de HPB (p = 0,02 pelo teste do qui-quadrado). Em linha com este resultado, as pontuações mais elevadas Sox2 foram mais frequentemente encontradas em tecidos PCA do pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (p = 0,0006 pelo teste do qui-quadrado; Fig 6D). Na verdade, a maioria dos CaP Sox2-negativo (59 de 68, 87%) não tiveram recidiva bioquímica oposta à APC com Sox2 em mais de 10% das células (1 de 6, 0,17%; Figura 6D)

Nenhuma outra variável clínica examinados significativamente correlacionada com a expressão Sox2.

Discussão

neste estudo, nós mostramos que a perda de miR-34b está associada com a progressão do câncer de próstata, e pode discriminar com precisão entre hiperplasia benigna e lesões de PIN ou infiltrando adenocarcinoma da próstata em seres humanos. Mecanicamente, esta via reflete epigenética silenciamento e cópia de DNA perda número do locus MIR34B /C no cromossomo 11, resultando na expressão desregulada do alvo stemness jusante, Sox2 em CaP. Importante, desregulado de sinalização miR-34b parece segregar seletivamente com células da próstata andrógeno-dependentes, o que sugere um potencial papel desta via em recidiva da doença e, potencialmente, na transição para castrar resistente palco.

A família miR-34 de RNAs tem sido relatada anteriormente para suprimir tumorigenese através de mecanismos diferentes, incluindo a modulação de transições do ciclo celular, EMT, metástase do cancro, ou stemness [33].