Abstract

fissão mitocondrial é um processo que envolve a clivagem de mitocôndrias em fragmentos menores e é regulado pela proteína relacionada com Dynamin GTPase 1 (Drp1). Níveis mais elevados de fissão mitocondrial está associada com a indução de apoptose em células cancerosas. No entanto, os métodos atuais de quantificar com precisão a fissão mitocondrial a fim de comparar terapias que alvejam este processo muitas vezes são ambíguas ou dependem de avaliação subjetiva. Mitocôndrias também são propensos a agregação, fazendo uma análise precisa difícil. Descrevemos aqui uma abordagem melhorada para a quantificação da fragmentação mitocondrial envolvendo várias diferenças de métodos actualmente existentes. As células são primeiro submetidos a centrifugação citológica, o que reduz a altura do eixo z celular e dispersa mitocôndrias individuais para observação mais fácil. Três ferramentas de análise de fluorescência comercialmente disponíveis são então aplicadas para disambiguate restantes grupamentos mitocondriais que exigem uma inspecção mais aprofundada. Finalmente, a pontuação de corte é aplicada, que pode ser adaptado ao tipo de célula individual. A abordagem resultante permite a avaliação eficiente e objetivo de fragmentação mitocondrial em resposta ao tratamento. Nós aplicamos esta técnica a uma pergunta experimental envolvendo células quimiossensíveis e quimiorresistentes câncer de ovário (OVCA). A cisplatina e o piperlongumine fitoquímicos foram encontrados para induzir tanto fissão mitocondrial e apoptose em células quimiossensíveis, enquanto apenas piperlongumine foi capaz de induzir essas respostas celulares em células quimiorresistentes. apoptose induzida por Piperlongumine pareceu ser mediada por fissão mitocondrial dependente de Drp1 uma vez que a resposta apoptótica foi atenuada pela presença do inibidor Drp1 mDivi-1. Nosso estudo fornece bases para uma abordagem mais objetiva para a quantificação da fragmentação mitocondrial, e lança mais luz sobre um mecanismo potencial de ação para piperlongumine no tratamento de OVCA resistente à quimioterapia

Citation:. Farrand L, Kim JY, Im -Aram a, Suh JY, Lee HJ, Tsang BK (2013) uma abordagem quantitativa melhorado para a Avaliação da mitocondrial a fragmentação em células resistente à quimioterapia do cancro do ovário. PLoS ONE 8 (9): e74008. doi: 10.1371 /journal.pone.0074008

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de maio de 2013; Aceito: 29 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Farrand et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do programa Universidade World Class (WCU) (R31-10056) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia e os Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-119381). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as mitocôndrias são organelos dinâmica encontrados na maioria das células eucariotas que são submetidos a processos de cisão (dividindo-se em estruturas separadas) e de fusão (fusão de duas ou mais estruturas adjacentes). Cisão é conhecida a preceder a apoptose em um número de tipos de células, e é pensado para facilitar uma rápida libertação de mais factores pró-apoptóticos mitocondriais, incluindo citocromo c e SMAC [1]. No entanto, a quantificação precisa da fissão mitocondrial é tecnicamente desafiador, devido ao grande número presente em muitos tipos de células, e as suas características morfológicas. As células apresentam tipicamente diferentes graus de fissão, dependendo do tipo de célula e o contexto ambiental [2]

A maioria das abordagens actuais para a avaliação quantitativa da fissão mitocondrial são variações de duas estratégias gerais [2] – [7]. . A primeira abordagem requer a medição dos comprimentos das mitocôndrias individuais para determinar o grau de fissão [3] – [5]. Verificou-se que a agregação das mitocôndrias [6], [7], especialmente de enrolamento e atar as estruturas de [8], bem como o grande número de fragmentos mitocondriais dentro de cada célula torna esta abordagem pouco prático para, pelo menos, alguns tipos de células. Ela também não tem em conta a estrutura 3-dimensional da mitocôndria dentro das células, o que não permite a medição ao longo do eixo z se uma imagem 2-dimensional único é usado. Outra abordagem exige que o julgamento subjetivo da morfologia mitocondrial, e exige que o operador para mostrar imagens que são considerados representativos de células com mitocôndrias tubulares ou fragmentados (outros termos usados ​​para descrever a morfologia incluem alongado, fundido, intermediário, pontuado e “granulada”) . Quantificação usando esta abordagem baseia-se essencialmente as opiniões do observador, e cada célula é categorizada de acordo com a qual a imagem representativa lo mais de perto se assemelha [9] – [11]. Uma das principais preocupações na aplicação desta técnica é a sua dependência de decisão subjetiva que introduz variabilidade entre observadores individuais. imunocitoquímica tradicional em vasos septadas também produz imagens que normalmente contêm pelo menos algumas mitocôndrias que estão fora de foco durante imagens de fluorescência e representação, portanto, incompleta de todo o espécime.

O objetivo do presente estudo foi desenvolver uma melhor método para quantificar o grau de fragmentação mitocondrial dentro das células, e aplicar esta abordagem em comparar a influência do piperlongumine fitoquímico sobre a fissão mitocondrial em células de cancro do ovário quimiossensíveis e quimiorresistentes

in vitro

. Enquanto a quantificação da fragmentação mitocondrial seria concebível representam pequenos fragmentos mitocondriais que aparecem devido à síntese de novas mitocôndrias e a fragmentação causada por mitophagy, quando combinado com uma validação adicional utilizando marcadores apropriados, avaliações mais precisas do ponto de fissão mitocondrial pode ser feito. Nosso método envolve centrifugação citológico que captura células em apoptose e saudáveis, utilizando imagens 3-dimensional (via a laser confocal microscopia z-empilhamento), e produz células achatadas com mitocôndrias dispersos que são mais fáceis de distinguir durante o exame. Em casos de agregação mitocondrial, três ferramentas de software disponíveis comercialmente (da intensidade da fluorescência de perfil, Orthogonal seccionamento, e mapeamento de calor) são utilizados para disambiguate os clusters e identificar o número de mitocôndrias individuais. Além disso, uma técnica de pontuação de corte é aplicada para avaliar de forma mais eficiente as células como sendo ou fragmentada ou tubular.

Nós procuramos demonstrar a aplicação prática da nossa nova abordagem, usando-o para investigar o papel da mitocôndria fissão no câncer de ovário resistente à quimioterapia (OVCA). Resistência a CDDP (cisplatina: cis-diaminodicloroplatina (II)) em câncer de ovário é um obstáculo significativo para o sucesso do tratamento [12]. Enquanto o envolvimento da mitocôndria em apoptose mediada por caspases tem sido extensivamente investigado, o papel da morfologia mitocondrial na quimiorresistência continua a ser totalmente compreendido. Piperlongumine é um constituinte natural do pimenta longa (

Piper longum L.

) e tem sido referido como exibindo um certo número de efeitos bioactivos incluindo a inibição da agregação das plaquetas [13], a regulação negativa de receptores de androgénio [14] e efeitos alargada contra uma variedade de tipos de células de cancro quimiorresistentes através da indução de espécies de oxigénio reactivas [15]. Nós aplicamos a abordagem quantitativa descrito acima para comparar os efeitos da CDDP e piperlongumine sobre a fissão mitocondrial e apoptose em linhas celulares OVCA quimiossensíveis e quimiorresistentes.

Materiais e Métodos

Reagentes

CDDP foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Piperlongumine foi adquirido a Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Anti-GAPDH, anti-Drp1 e anticorpos anti-fosfo-Drp1 (Ser637) foram de Cell Signaling Technology (Beverly, CA, EUA). O anticorpo anti-TOM20 era de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). Alexa 488 Fluor® anticorpo secundário, TEMED, RPMI 1640 meios de cultura, soro fetal de bovino e prolongar ouro Antifade Reagente com DAPI eram da Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA). Todos os anticorpos foram diluídos em diluente de anticorpo Dako (Dako # s0809) da Agilent Technologies (Glostrup, Dinamarca). Completas Mini protease comprimidos de cocktail inibidor e PhosStop inibidores de fosfatase comprimidos de cocktail foram obtidos a partir Roche Applied Sciences (Penzberg, Alemanha).

linhas celulares e Cultura

CDDP sensível linha de células OVCA humana (OV2008) [16] e sua contraparte resistente (C13 *) [17] foram presentes de Drs Rakesh Goel e Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Canadá), e cultivadas conforme relatado anteriormente [18]. Eles são de origem adenocarcinoma de ovário endometrioid com diferenciação escamosa.

células OVCA anexina V Ensaio de Apoptose

foram coradas com FITC conjugado anexina V (Bioline, London, UK) e iodeto de propídio para determinar a proporção das células que estavam nas fases precoces e tardios de apoptose [19]. As células marcadas foram então analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur BD (BD Biosciences) e o software CellQuest /ModFit.

imunotransferência e imunofluorescência Microscopia

imunotransferência foi realizada como previamente descrito [18]. densidades de bandas foram analisados ​​e quantificados utilizando um XRS ChemiDoc + e V3.0 Image Lab BioRad (Hercules, CA, EUA). células OV2008 foram fixadas com paraformaldeído a 4% em lâminas de câmara de 8 poços, incubadas com anticorpos secundários fluorescência conjugada apropriadas e corados com Prolongar ouro Antifade Reagente com DAPI (azul, mancha nuclear). Eles foram fotografadas imediatamente com um microscópio confocal Zeiss LSM700 equipado com uma câmera digital Zeiss T-PMT (Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

citológica centrifugação e Fixação de células

As células foram semeadas em 12 h em meio RPMI suplementado com FBS a 10% em placas de 6 poços. A seguir ao tratamento com agentes de ensaio apropriadas, foram colhidas após 2 minutos de incubação com tripsina a 0,025% (200 uL) a 37 ° C. A tripsinização foi realizada rapidamente para minimizar o dano mitocondrial e a reacção foi parada com a adição de 10% de FBS em meio RPMI 1640. As células foram lavadas suavemente com 1 ml de PBS (900 ×

g

, 1 min; todos PBS foi filtrada com um filtro de 0,45 micrómetro seringa; Sartorius Biotecnologia, Goettingen, Alemanha) e o sedimento celular foi cuidadosamente re-suspenso em 500 ul de PBS fresco. Cinquenta microlitros da suspensão foi centrifugada (900 ×

g

, 4 min) utilizando citológico funis em conjunto com as lâminas com revestimento de silano de vidro e papel de filtro Whatman (Hanil Ciência Cytospin centrífuga citológica; Daejeon, Coreia). As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 24 h. Eles foram, em seguida, lavou-se (3 x 5 min) em PBS, com agitação suave, permeabilizadas com 0,02% de Triton-X diluído em PBS (incubada durante 10 min a 4 ° C) e submetida a um outro ciclo de lavagem PBS (3 x 5 min). As células foram incubadas com TOM20 (subunidade de receptor de importação mitocondrial) anticorpo (1:250, 24 h, 4 ° C), lavadas com PBS e incubadas com Alexa 488 Fluor® anticorpo secundário (temperatura ambiente, 1 h). As células foram então lavadas em PBS antes da fixação com uma lamela usando Prolongar ouro Antifade Reagente com DAPI e imagem confocal iniciado imediatamente.

Quantificação de mitocondrial Cisão

Depois citológico centrifugação, fixação e imunocoramento as células, as imagens 3-dimensional de células individuais foram obtidos utilizando microscopia confocal por sobreposição de pelo menos 12 imagens em corte transversal feito em incrementos ao longo do eixo Z e que engloba o volume da célula inteira. configurações de exposição padrão envolveu uma permanência de pixel de 50 microssegundos e dimensões de campo de 300 × 300 micrômetros. Um mínimo de 100 células por grupo de tratamento foram avaliados para a fissão mitocondrial em cada repetição, com estatísticas derivadas de três repetições independentes. Cada célula individual analisada foi classificada como fragmentado ou não-fragmentada de acordo com se encontrou com o ponto de corte de 8. As células que cumpriu a definição de “fragmentados”, portanto, continha 8 ou mais fragmentos mitocondriais individuais que foram, cada um 3 micrometros de comprimento ao longo do eixo mais longo. Em caso de ambiguidade devido à agregação das mitocôndrias, três ferramentas de software disponíveis comercialmente incluído no pacote de software Zeiss LSM (Fluorescência Intensidade Profiling, Orthogonal Seccionamento e mapeamento de calor) foram utilizados para resolver as incertezas. A intensidade de fluorescência de perfil permite a detecção de limites mitocondriais marcadas com fluorescência (marcada com TOM20), tal como reflectido pelo aumento acentuado ou diminui a intensidade de fluorescência em [20]. O operador desenha uma linha reta através de qualquer região da imagem, e um gráfico automatizado da intensidade de fluorescência é construído. Orthogonal Seccionamento permite que qualquer região na imagem a ser inspeccionado a partir de um x ou ponto-de-vista do eixo y (POV). Isso cria uma perspectiva transversal virtual e fornece informações sobre limites mitocondriais que normalmente seriam obscurecidos se ver a partir do POV tradicional top-down. Mapeamento de calor códigos de cores fluorescentes todos os objectos numa imagem 3-dimensional de acordo com a posição do objecto ao longo do eixo z. Em mitocôndrias visualização, a ferramenta é mais útil para distinguir mitocôndrias separados que estão localizados em lados opostos do núcleo (e, caso contrário, aparecem as mitocôndrias como singular). Na maioria dos casos, essas ferramentas não eram necessários para reconhecer mitocôndrias fragmentado, como centrifugação citológico dispersa as organelas para facilitar a visualização. Determinou-se a morfologia mitocondrial de pelo menos 80 células por grupo de tratamento, com o observador cego para a identidade dos grupos de tratamento. Quantificações foram derivados a partir de três experiências independentes.

Análise estatística

Os resultados são expressos como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada por unidirecional, bidirecional ou três vias análise de variância, utilizando software SigmaPlot (versões 12; Systat Software, Chicago, IL, EUA). As diferenças entre os vários grupos experimentais foi determinada pelo teste post-hoc de Bonferroni. A significância estatística foi inferida a

p

. 0,05

Resultados

citológica Centrifugação Melhora a imagem mitocondrial, aumentando a distâncias de separação entre o indivíduo mitocôndrias

Em primeiro lugar, compararam os efeitos de centrifugação citológico na qualidade de imagem confocal de mitocôndrias. Optimization revelou que as configurações do rotor ideais da centrífuga citológica for Imaging células OV2008 inclui uma g rotação 900 × por 4 minutos. Todas as experiências subsequentes foram realizados utilizando estas definições. Na ausência do passo de centrifugação, as mitocôndrias foram observados de perto ao agregar ao núcleo e a enrolar para o ângulo da lente de visualização (Figura 1, Figura S1A). profiling lado de células sem centrifugação revelou uma grande altura do eixo z de pelo menos 8 micrômetros, fazendo distinção individual de mitocôndrias separados difícil. Com a inclusão de um passo de centrifugação, as mitocôndrias foram separadas ainda mais a partir do núcleo, e aumento da distância entre as mitocôndrias surgiu individuais. As células centrifugadas exibiu uma altura reduzida do eixo z de cerca de 3 micrómetros, resultando em uma observação mais fácil de estruturas mitocondriais individuais (Figura 1B, as Figuras S1B-C). Uma comparação da qualidade da imagem, com e sem centrifugação, utilizando as configurações de imagem idênticos, revelou que a centrifugação melhora a clareza geral de funções mitocondriais (Figura 1C). Isto deveu-se, em parte, ao facto de que, sem centrifugação, as imagens fluorescentes incluído um maior grau de fluorescência de fundo “fora de foco” (isto é. A partir de mitocôndrias que não eram claramente visíveis no interior do plano do eixo Z na qual o imagem foi tirada). Centrifugação melhora a focagem da imagem por achatamento características de células dentro do mesmo plano focal.

(A) em 3 dimensões vista superior e lateral perfis de células OV2008 não tratados, com e sem centrifugação citológico antes da fixação. Setas amarelas indicam áreas típicas de separação que aparecem entre as mitocôndrias após a centrifugação. (B) seções ortogonais das mesmas imagens vistas em (A) tiradas com as configurações de exposição da câmera idênticos. As células foram fixadas em 3,7% de paraformaldeído e coradas para nuclear (DAPI, azul) e mitocondrial sinal (TOM20, verde). (C) Comparação de qualidade de imagem mitocondrial entre imunocitoquímica convencional e abordagens de centrifugação citológicas. Imagens de tubular clássica e morfologia mitocondrial fragmentado torna-se visivelmente mais nítida após a centrifugação, devido à minimização da fluorescência proveniente de fontes fundo para além do plano focal. O alargamento do núcleo pós-centrifugação é devido ao achatamento das células por força centrípeta. Barras de escala = 5 mm.

Fluorescência Intensidade Profiling, Orthogonal corte e mapeamento de calor ferramentas permitem que para a distinção rápida de Individual mitocondrial fragmentos dentro Agregados

Notamos que, embora a etapa de centrifugação melhorado a nossa capacidade de distinguir mitocôndrias, em alguns casos, a agregação das mitocôndrias apareceu inevitável, apesar dos esforços para resolver o problema. Adotamos três ferramentas de análise de fluorescência (fluorescência Intensidade perfis, Orthogonal corte e calor mapeamento) para complementar a quantificação das mitocôndrias presentes dentro agregados. Essas ferramentas fornecem uma maior informação sobre a orientação espacial das membranas mitocondriais, permitindo disambiguation de sinal fluorescente que de outra forma parecer confuso. A intensidade de fluorescência de perfil (Zeiss pacote de software LSM) é um instrumento usado normalmente para determinar a relação sinal-para-fundo entre as regiões de uma imagem fluorescentes [20]. Esta ferramenta pode ser, alternativamente, usado para determinar o número de mitocôndrias individuais dentro de um agregado, tal como a intensidade de fluorescência é directamente proporcional ao número de membranas mitocondriais. Usando sobreposições transparentes, o número de mitocôndrias podem ser extrapolados em grandes grupos de simples divisão do sinal de pico com a intensidade de fluorescência obtidos a partir de uma única mitocôndria (Figura 2A). Mapeamento de calor fornece informações sobre o eixo z locais mitocondriais utilizando um espectro codificado por cor (Figura 2B, as Figuras S2A-C) [21]. As mitocôndrias que devem ser sobrepostos ou achatadas atrás ou à frente do núcleo podem ser facilmente identificados de acordo com a sua atribuição de cor. Finalmente, Orthogonal Seccionamento (Zeiss LSM) fornece vistas em corte transversal de toda a posição-x y de uma perspectiva perpendicular ao eixo z, permitindo a inspeção das fronteiras mitocondriais que seriam obscurecidos de um tradicional vista de cima para baixo (Figura 2C). Na resolução suficientemente alta, e com a expansão óptima do citoplasma através da etapa de centrifugação, descobrimos que essas ferramentas de fluorescência só foram necessários em 10% dos casos, quando uma decisão não poderia ser alcançado devido à agregação mitocondrial irregular. O uso eficaz destes instrumentos estão dependentes de vários pressupostos, por exemplo, que todas as mitocôndrias em um agregado são igualmente manchado, que o sinal fluorescente tem um sinal suficiente para relação de ruído e que as membranas mitocondriais podem ser distinguidos por alterações no sinal fluorescente correspondente.

(a) intensidade de fluorescência de perfis de uma única célula com mitocôndrias fragmentados. Intensidade de sinal mitocondrial ao longo de um perfil linear seleccionada pelo operador (seta azul claro) é representado quantitativamente. de pico (i) Emissão de uma única mitocôndria é indicado graficamente (seta amarela). (Ii) mitocôndrias separados são evidentes como picos independentes. (Iii) os picos mais altos (seta amarela) sugerem a presença de múltiplos mitocôndrias, sobreposta durante a centrifugação. os dados da imagem em 3D em camadas é transparente, com o número de mitocôndrias indivíduo sendo directamente proporcional à intensidade da fluorescência. mapeamento (B) de calor de uma única célula tratados com CDDP (10 uM, 12 H). As diferenças de valores do eixo z localização de fragmentos mitocondriais são representados como cores. (I) Ampliação (caixa amarela) revelando mitocôndrias distinta em diferentes alturas do eixo z (verde vs. laranja). (Ii) A vista inversa da mesma célula em (I), indicando os outros fragmentos individuais (ciano vs seta azul, amarela). ferramenta de secção (C) Orthogonal mostrando secções transversais de uma única célula ao longo do eixo y (inserção caixa amarela pontilhada, ampliado como caixa verde) e x-axis (ampliada como caixa vermelha). Y. (i) Ampliação (caixa verde) da secção ortogonal do eixo y. (Ii) Ampliação (caixa vermelha) da secção ortogonal eixo-x. Setas amarelas indicam espaços separando mitocôndrias individuais.

Aplicação de notas de corte Permite Distinção entre células que contêm diferentes graus de mitocondrial Cisão

Embora seja possível determinar com exactidão o número de mitocôndrias em qualquer dada célula, é demorado e pouco prático se avaliar um grande número de células. Nós próxima concebeu uma abordagem semi-quantitativa para uma avaliação intensiva de trabalho mais eficiente e menos das imagens. Procedeu-se avaliando o fenótipo mitocondrial (tubular ou fragmentado) com base num ponto de corte definido por um número mínimo de fragmentos mitocondriais de um comprimento definido presentes em cada célula. O rigor da classificação é determinada pelo ponto de corte escolhido (Figura 3). Se 8 ou mais mitocôndrias, que foram, cada um com menos de 3 micrômetros de comprimento foram encontrados em qualquer lugar na célula, a célula inteira se qualificar como “fragmentada”. Cumprimento dos critérios torna uma avaliação mais aprofundada das mitocôndrias restantes desnecessários (mostrado na Figura 3).

Figura mostra três células com diferentes graus de fissão. (I) A nota de corte de 2 (resultado é ‘Sim’, se forem detectados 2 ou mais fragmentos mitocondrial que são 3 micrômetros de comprimento ao longo do eixo mais longo) coloca todos os tipos de células 3 na mesma categoria. (Ii) A nota de corte elevado para 5 distingue celular Um tão diferentes a células B e C (a critério de classificação celular Um como “tubular”) (c) A nota de corte de 10 lugares Células A e B na mesma categoria, distinto do celular C. o uso de mais de um ponto de corte permite a distinção de diferentes graus de fissão mitocondrial.

Chemosensitivity a CDDP e Piperlongumine está associada com mitocondrial cisão

a seguir, aplicou esta técnica para investigar a influência da piperlongumine e CDDP (0 e 10 �, 12 h) sobre a fissão mitocondrial em quimiossensíveis (OV2008) e as células resistente à quimioterapia (C13) OVCA (Figura 4). Ambos os compostos causaram aumentos na fissão mitocondrial e apoptose de um modo dependente da concentração em OV2008. No entanto, apenas piperlongumine teve o mesmo efeito em C13, sugerindo que este último não só promove a apoptose, mas também induz a fissão mitocondrial em células OVCA quimiorresistentes. Um mínimo de 100 células por grupo de tratamento foram avaliados para a fissão mitocondrial em cada repetição, com estatísticas derivadas de três repetições independentes.

(A) Imagens representativas de tubulares e fragmentados mitocôndrias nas células quimiossensíveis (OV2008) e sua resistente homólogos (C13). Mitocôndrias e núcleos foram corados com TOM20 (verde) e DAPI (azul), respectivamente. (B) Efeito do piperlongumine e CDDP sobre a fissão mitocondrial em células OV2008 e C13, avaliada com um único ponto de corte de 8 (células que contêm 8 ou mais fragmentos mitocondriais 3 micrômetros de comprimento foram classificados como tendo mitocôndrias fragmentada). (C) Efeito de CDDP e piperlongumine na apoptose, tal como avaliado por ensaio de Anexina V (*,

P

0,05; **,

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0,01; ***,

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. 0,001 versus respectivo controlo sem tratamento)

CDDP e Piperlongumine induzida mitocondrial Cisão e apoptose são-Drp1 dependente quimiossensíveis OVCA

em resposta a vários tipos de estresse celular, Drp1 é ativado por desfosforilação em Ser637. Isto é seguido pelo seu recrutamento para as mitocôndrias onde oligomerizes para proporcionar a resistência mecânica necessária para ocorrer a fissão [22]. Nossa hipótese é que a cisão mitocondrial Drp1-dependente é um determinante da resposta quimiossensíveis, tanto o tratamento CDDP e piperlongumine deve resultar em desfosforilação de Drp1. Este foi certamente o caso em células OV2008 (Figura 5A). Mais importante ainda, o tratamento de células OV2008 com um inibidor de Drp1 farmacológica, mDivi-1, atenuou significativamente tanto fissão mitocondrial e apoptose induzida por os dois compostos (Figura 5B). Estes dados suporta uma ligação causal entre a fissão e apoptose. Um mínimo de 100 células por grupo de tratamento foram avaliados para a fissão mitocondrial em cada repetição, com estatísticas derivadas de três repetições independentes.

(A) CDDP (10 mM) e piperlongumine (10 M) regulada de fosfo -Drp1 conteúdo (Ser637) em células OV2008

in vitro

. (B) (i) Efeito da mDivi-1 (0-10