Abstract

O nucleofosmina acompanhante (NPM1) é sobre-expresso no compartimento epitelial dos tumores de próstata em comparação com o epitélio saudável adjacente e pode representar um dos atores-chave que suportam o fenótipo neoplásico de células de adenocarcinoma de próstata. No entanto, os mecanismos que estão por trás fenótipo NPM1 mediada ainda imperceptíveis na próstata. Para entender melhor as funções NPM1 em células de câncer de próstata, que procurou caracterizar seu impacto sobre o câncer de próstata comportamento das células e decifrar os mecanismos pelos quais poderá atuar. Aqui nós mostramos que NPM1 favorece a migração de células de tumor da próstata, invasão e formadoras de colônia. Além disso, knockdown de NPM1 leva a uma diminuição no crescimento de tumores derivado de LNCaP em ratinhos nus enxertados

in vivo

. Tais propriedades oncogénica semelhantes são encontrados em conjunto com uma regulação positiva da NPM1 na ERK1 /2 (sinal-regulada extracelular Quinases 1/2) a fosforilação da cinase em resposta a EGF (Factor de Crescimento Epidérmico) estímulo, o qual é crítico para a progressão do cancro da próstata após a criação de uma produção autónoma do fator de crescimento. NPM1 poderia, então, ser um alvo para desligar especificamente ERK1 /2 a activação da via, a fim de diminuir ou inibir o crescimento de células de cancro e migração

citação:. Loubeau L, Boudra R, S Maquaire, Lours-Calet C, Beaudoin C, Verrelle P, et al. (2014) NPM1 silenciador reduz o crescimento do tumor e MAPK Sinalização em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 9 (5): e96293. doi: 10.1371 /journal.pone.0096293

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de outubro de 2013; Aceito: 06 de abril de 2014; Publicado em: 05 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Loubeau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) e pela Região Auvergne. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a progressão do câncer de próstata está associada a alterações de genes-chave que controlam a homeostase celular, a sua desregulamentação e /ou amplificação levando ao aumento da proliferação celular e capacidades invasivas. Nós previamente identificado

NPM1

(nucleofosmina 1) como um dos genes cuja expressão é aumentada significativamente em células do tumor de próstata quando comparada com a não-tumor de tecido adjacente [1], o que indica que NPM1 poderia actuar como um intensificador de próstata progressão do câncer. NPM1 é um importante fosfoproteína multifuncional acumulado em níveis elevados na região granular do núcleo e é capaz de transporte entre o nucléolo, o nucleoplasma e do citoplasma [2]. Devido à sua localização nucleolar, a sua actividade RNase intrínseca e sua associação com vencimento ribonucleoproteínas pré-ribossomais, NPM1 foi proposto pela primeira vez para regular a transcrição do RNA ribossomal e processamento. No entanto, NPM1 mais recentemente tem sido demonstrado para exibir actividades chaperonas. Ele liga-se a histonas, favorece a montagem do DNA-histona, medeia a formação de nucleossomas e cromatina relaxa [3], assim, controlar a expressão do gene. NPM1 também interage com uma vasta gama de amadurecimento proteínas para induzir a sua dobragem adequada no estado activo. Entre as proteínas, existem reguladores do crescimento celular, tais como a oncoproteína de MDM2 (rato Duplo Minuto 2 homólogo). Além disso, NPM1 se liga a e inibe o tumor proteínas supressoras de p53 e Rb (retinoblastoma) [4] destacar que NPM1 poderia ter um papel em processos oncogénicos. Algumas das interacções específicas NPM1 com reguladores do ciclo celular já foi esclarecido, mas o seu papel no comportamento de células de tumores sólidos, bem como a sua integração na célula signalosome está ainda a ser determinado. Aqui nós abordar a questão de saber se NPM1 podem potenciar a proliferação, migração e invasão capacidades das células cancerosas da próstata. Neste estudo, que relatam que o nível de NPM1 em células de cancro da próstata regula especificamente a expressão de EGF e o (Proteína Activada por Mitogénio Quinases) via de sinalização MAPK. Mostramos também que altos níveis de NPM1 impactar positivamente a proliferação celular e migração celular, participando assim no controle do crescimento tumoral.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os animais foram mantidas em um cuidado ambiente e animal controlado foi conduzido em conformidade com as políticas nacionais de normalização (C 63 014.19). Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Auvergne Regional, França (CE09-08 protocolo).

cultura celular e estável transfecção

LNCaP células (Linfonodo carcinoma da próstata) foram cultivados em vermelho de fenol Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Life Technologies, Saint-Aubin, França) suplementado com 10% condições padrão de soro fetal de bovino (FBS) e incubado em inactivado pelo calor (37 ° C, 5% de CO

2).

As células foram infectadas acordo com as instruções do fabricante, com partículas de lentivírus contendo os três construções dirigidas a públicos específicos (shNPM1) ou sequências independentes (shScr, Srambled) (sc-29771-V, Santa Cruz, Heidelberg, Alemanha). Após a infecção, puromycine (1 ug /ml) foi adicionada ao meio de cultura, a fim de seleccionar as células transduzidas estavelmente e para efectuar a selecção monoclonal.

Wound healing ensaio de migração

células de controlo de LNCaP (shScr ) e bateu-as células LNCaP (NPM1 shNPM1) foram semeadas em placas de 24-poços e crescidas até à confluência durante 24 horas. A cultura em monocamada foi em seguida, raspar-feridos com uma ponta de micropipeta estéril, a fim de criar um espaço de largura constante. Os detritos celulares foram lavados com tampão fosfato 1 × (PBS) (Life Technologies). As células foram em seguida cultivadas em RPMI 1640 FBS a 10%, que foi substituído de 12 horas após o ferimento e, em seguida, a cada 24 horas. migração de células LNCaP foi fotografada para a região ferido em 24, 48 e 72 horas após a raspagem (100 vezes) e restantes áreas das feridas foram então quantificados com o software livre ImageJ.

ensaio de invasão Boyden Câmara

Para o ensaio de migração de células, 3 × 10

5 shScr e shNPM1 LNCaP células cultivadas em meio RPMI 1640 isento de soro foram semeadas no poço superior de um sistema de câmara de Transwell. Meio contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Após incubação durante 24 a 48 horas, as células que não migraram foram removidos com o bem superior. As células que migraram para a superfície de inserção inferior foram então fixadas com metanol e coradas com uma solução a 5% de Giemsa. Cinco campos aleatórios foram fotografados (200 × ampliação) e as células foram quantificados com o software livre ImageJ como a média ± SD das colónias contadas por campo.

ensaios de formação de colónias em agar mole

Six-poços placas foram preparadas com 2 ml /poço de uma solução quente de agarose 0,6% baixo ponto de fusão (produto Sea agarose Plaque FMS baixo ponto de fusão, 50101, Lonza, Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, França), em RPMI 1640, 10% FBS. Após a solidificação, 5 × 10

3 de células shScr ou shNPM1 LNCaP foram plaqueadas por cavidade de uma solução de 500 ul de 0,3% de agarose em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. As placas foram em seguida incubadas em meio RPMI 1640, FBS a 10% de meio que foi mudado cada 3-4 dias. Após 2 semanas, a formação de colónias foi quantificada usando o software livre ImageJ: colónias foram fotografados (100 vezes) em 5 campos diferentes e o número de colónias relativa foi calculada como a média ± SD das colónias contadas por campo

ensaio clonogênica

1 × 10

4 células shScr e shNPM1 LNCaP foram semeadas em 6-poços placas em RPMI 1640, meio FBS 10%. O meio foi trocado a cada 3 dias. Após 2 semanas, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS 1 × então fixadas com metanol e coradas com uma solução a 5% de Giemsa. formação de focos foi avaliado e formação de colónias foi quantificada usando o software livre ImageJ: colónias foram fotografados (100 vezes) em 5 campos diferentes e o número de colónias relativa foi calculada como a média ± SD das colónias contadas por campo

proliferação celular ensaio

a proliferação celular foi determinada utilizando a proliferação celular ELISA, BrdU (bromodesoxiuridina) kit colorimétrico (Roche) segundo as instruções do fabricante. Resumidamente 5 × 10

3 shScr ou shNPM1 LNCaP células por poço foram semeadas numa placa de 96-poços. Eles foram cultivadas durante 24 horas em meio RPMI 1640, FBS a 10% na presença de ausência de EGF (E9644, Sigma). Em seguida, a solução de marcação com BrdU foi adicionado a uma concentração final de 10 uM durante 2,5 horas. Após a fixação, as células foram incubadas com uma solução de anti BrdU-POD durante 1 hora, e a absorvância foi medida a 655 nm.

Western Blotting

As proteínas foram extraídas usando HEPES 20 mM, NaCl 0,42 M , MgCl

2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, e Nonidet P-40 a 1% suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM (Sigma), inibidores de protease (completo 1X; Roche), NaF 0,1 mM, e Na

3VO

4 0,1 mM (Sigma). Quarenta ug de proteína total foram então sujeitas à desnaturação de SDS-PAGE e transferidos para nitrocelulose membrana Hybond-ECL (GE Healthcare Life Sciences, Vélizy-Villacoublay, França). Detecções foram realizados usando anticorpos produzidos contra β-actina (A2066, Sigma), NPM1 (SC-6013-R, Santa Cruz, Heidelberg, França), EGFR (factor de crescimento epidérmico receptor, NB100596, Novus), fosfo-EGFR Tyr 1068 ( 2236S, sinalização celular, Ozyme), ERK1 /2 (M5670, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, França), fosfo-ERK1 /2 p42 /44 (9101S, sinalização celular, Ozyme) AKT (9272, sinalização celular, Ozyme), fosfo-AKT Sor 473 (2118-1 Epitomics) e revelada com IgG anti-coelho conjugado com peroxidase (imunoglobulina G, PARIS, Compiègne, França) utilizando um kit de sistema de Raios Ocidental (PerkinElmer, Villebon sur Yvette, França). quantificação de sinal foi realizado utilizando Quantity One Software (Bio-Rad). Os ensaios de

construção do promotor, e transfecção de luciferase

O fragmento do promotor de EGF humano (-392 /+ 123) foi gerado com o seguinte iniciadores: 5′-GATCAAGCTTGGGCTGAAGGTGAACTATCTTTAC-3 ‘(directo) e 5′-GATCCTCGAGGACAGAGCAAGGCAAAGGCTTAGA-3’ (reversa), em seguida clonado nos locais de restrição HindIII /Xhol de um vector pGL3-basic (Promega, Charbonnières, França). O plasmídeo de expressão constitutivamente ativa kinase1 MAP quinase quinase (caMEKK1) foi uma simpática oferta do Dr. Dirck Bohmann (University of Rochester Medical Center, Rochester, EUA). células shScr shNPM1 e LNCaP foram transfectadas 24 h após inoculação com os plasmídeos caMEKK1 pGL3-hEGF e /ou em OPTI-MEM usando Metafectene transfectante de acordo com as instruções do fabricante (Biontex, Martinsried-Planegg, Alemanha). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lisadas em tampão de lise repórter 1 × (Promega) e a actividade de luciferase foi medida utilizando o Genofax um kit de ensaio de luciferase (Yelen, resultar la Redonne, França).

Preparação de e ARN-PCR quantitativo em tempo real

O ARN celular total foi extraído usando o reagente TRIzol (Life Technologies) e o ADNc foi sintetizado com 200 L de Moloney da leucemia murina de transcriptase reversa do vírus (Promega), 5 pmol de iniciadores aleatórios ( C1181, Promega), 40 L de RNAsin (Promega), e 2,5 mM de trifosfato de desoxinucleótido. níveis de mRNA foram quantificados em um Mastercycler ep Realplex (MasterCycler2, Eppendorf, Le Pecq, França) com Mesagreen QPCR Mastermix Plus para SYBR (Promega). As sequências dos iniciadores são as seguintes: NPM1, 5′-ATGGAAGATTCGATGGACATGG-3 ‘(directo) e 5′-CGAGAAGAGACTTCCTCCACTGC -3′ (reversa); PCNA, 5’-TGCCTTCTGGTGAATTTGCACGT-3 ‘(Avançar) e 5′- ACCGTTGAAGAGAGTGGAGTGGC-3′ (reverso), actina, 5’-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ‘(Avançar) e 5’TCACCGGAGTCCATCACGA-3’ (reverso) (Eurogentec, Angers , França). Para EGF humano, primers foram adquiridos da Qiagen (PPH00137B-200, Qiagen, Courtaboeuf, França).

In vivo

Nude modelo de xenoenxerto de tumor de rato

ShScr e shNPM1 LNCaP As células foram cultivadas até à confluência, em seguida, novamente suspensas em Matrigel (BD Matrigel porão matriz da membrana livre de fenol vermelho, BD Biosciences, Le Pont de Claix, França) até uma concentração de 9 × 10

6 células /ml. Trezentos ul da suspensão de células (cerca de 3 × 10

6 células) foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus de 6 semanas de idade (Swiss nu /nu, Charles River, L’Arbresle, França). A progressão da doença foi monitorada diariamente, com base em um conjunto de critérios gerais de bem-estar definidos pela comissão de cuidados com os animais, e massa corporal foi registrada três vezes por semana até que um endpoint pré-determinado foi atingido. Endpoints incluídos: desidratação e /ou perda de peso de mais de 10%, qualquer evidência de insuficiência respiratória, aumento de peso corporal de mais de 5 g da média. Os tumores foram medidos três vezes por semana com um paquímetro eletrônico desde tumores palpáveis ​​eram detectáveis. Os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical, sob anestesia de gás. Xenoenxertos foram então removidas, pesadas e congeladas em nitrogênio líquido por RNA e proteína análises.

Análise Estatística

Todos os ensaios foram realizados em pelo menos 3 experiências independentes. Os erros padrão foram calculados para cada média, e as diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas por estudante do

t

teste ou o Mann Whitney U. utilizando software Prism. Para as análises longitudinais, foi considerado um modelo de efeito aleatório (modelo misto) para estudar o grupo de efeitos fixos (expressão NPM1), pontos de tempo e interação grupo × tempo tendo em conta entre e dentro variabilidade assunto (inclinação efeitos aleatórios e interceptar).

Resultados

NPM1 regula capacidades clonog�icas e proliferativa das células tumorais da próstata

a fim de analisar o impacto da NPM1 sobre a proliferação de células tumorais da próstata, optamos por uma estratégia de knockdown e gerados sublinhas celulares de LNCaP que expressam estavelmente controlo (shScr) ou NPM1 shRNA específica (shNPM1). Como mostrado na Figura 1A, o nível de ARNm NPM1 diminui em mais de 50% e a expressão da proteína NPM1 por mais de 30% em células shNPM1, mas este não está associado com alterações na morfologia celular. No entanto, NPM1 knockdown altera a capacidade das células LNCaP para formar colónias após a sementeira em baixo confluência (Figura 1B). Esta diminuição das capacidades clonogénicas coincide com uma diminuição na proliferação celular potencial (Figura 1C). Com efeito, a sub-regulação de NPM1 leva a uma diminuição de 30% na incorporação de BrdU e isto está associado com uma diminuição de 60% no nível de ARNm de PCNA (proliferação celular Nuclear Antigen), um marcador chave da proliferação das células (Figura 1D). Curiosamente, NPM1 knockdown não altera a sobrevivência da célula, conforme avaliado pela PARP (poli (ADP-ribose) polimerase) analisa clivagem por Western blotting (Figura S1), indicando assim que esta diminuição na taxa de proliferação celular não está associada com um aumento da apoptose. Estes resultados mostram que, por conseguinte, NPM1 está envolvida no aumento da proliferação e capacidades clonogénicos de células de tumor da próstata.

(a) NPM1 knockdown não altera a morfologia de células LNCaP. As células LNCaP foram estavelmente transfectadas com o controle shRNA (shScr) ou específica NPM1 shRNA (shNPM1). NPM1 ARNm e os níveis de proteína foram analisados ​​por RT-qPCR e Western blotting, respectivamente. Morfologia das células foi observada por microscopia invertida e fotografada. (B) NPM1 knockdown inibe as células LNCaP clonogenicidade. As células foram semeadas a baixo confluência ao longo de uma semana, em seguida, fixadas com metanol e coradas com Giemsa 5% azul antes da observação microscópica. As imagens são representativos de três experiências independentes com resultados consistentes. O gráfico representa o número de clones de células ( 50 células) na condição shNPM1, calculado como a média ± DP do número de clones contados por campo, em 5 campos aleatórios, utilizando o software livre ImageJ e expressa relativamente ao número de clones contados na condição de controle. (C, d) controla a proliferação NPM1 de células cancerosas da próstata. Cinco mil células foram semeadas por poço numa placa de 96 poços e cultivadas durante 48 horas. (C) As células foram então incubadas com uma solução de rotulagem BrdU durante 2,5 horas e a incorporação de BrdU foi medida por meio de análise densitométrica a 655 nm. (D) A proliferação foi analisada por ensaio de RT-qPCR avaliando PCNA acumulação nível de ARNm relativa normalizados utilizando nível de ARNm β-actina. Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências em triplicado independentes e a incorporação de BrdU como a média de experiências em triplicado de 96 pontos cada. Os dados são expressos como a média ± DP.

NPM1 impacto sobre a proliferação está associada com o controlo da migração, invasão, as capacidades de crescimento tridimensional de células de cancro da próstata e o crescimento do tumor

os resultados acima demonstram que NPM1 exerce um controlo sobre as capacidades clonogénicos de células de cancro da próstata e sugere que, para além do seu efeito na taxa de proliferação celular, mas também pode contribuir para o crescimento do tumor e agressividade. Para avaliar melhor o papel da NPM1, examinamos a invasão e migração capacidades das células shNPM1 LNCaP. O knockdown de NPM1 diminuiu significativamente a invasão de células LNCaP através de filtros revestidos com Matrigel em 40% (Figura 2A). Foram avaliados ainda mais a capacidade das células de migração LNCaP por células semeadas em placas de cultura de células ferindo fisicamente. Tal como mostrado na Figura 2B, às 72 horas após ter sido esfregado, as células não foram capazes de shNPM1 recolonizar zona desnudo quanto mais rápido assim como as células de controlo. Para testar se a diminuição das capacidades de migração e invasão é acompanhada por uma diminuição das capacidades de crescimento tridimensional de células LNCaP shNPM1,

in vitro

testes em agar mole foram realizados (figura 2c). Diminuição da NPM1 em células LNCaP quase elimina sua capacidade de formar colônias em 3-D. Estes resultados de

in vitro

ensaios sugerem fortemente que NPM1 regula as propriedades migratórias e invasivos de células cancerosas da próstata.

(a) NPM1 controla capacidades de migração de células LNCaP. As células foram semeadas a confluência, a fim de criar uma ferida 24 horas mais tarde. recolonização da ferida foi observada após 72 horas de cultura por microscopia invertida e fotografada. Os histogramas mostram a área da ferida quantificação utilizando o ImageJ e imagens são representativos de três experiências independentes com resultados consistentes. (B) NPM1 knockdown inibe o potencial invasivo de células de câncer de próstata. células shScr e shNPM1 LNCaP foram semeadas a confluência em meio RPMI livre 1.640 soro em matrigel revestido membrana microporosa. 48 horas mais tarde, as células migraram presente no lado oposto da membrana foram fixadas e coradas com Giemsa 5% e azul observada ao microscópio (200 x de ampliação). O gráfico representa o número de células na condição shNPM1, calculado como a média ± DP do número de células contadas por campo, em 5 campos aleatórios, utilizando o software livre ImageJ e expressa relativamente ao número de células contadas no estado controle . (C) impactos NPM1 crescimento tridimensional de células cancerosas da próstata. Controlo ou NPM1 derrubado células foram semeadas a partir de confluência em agarose /RPMI 1640 10% FBS durante 2 semanas. Número e tamanho dos clones emergentes foram então observadas ao microscópio invertido (X100) e fotografada. O gráfico representa o número de clones de células ( 50 células) na condição shNPM1, calculado como a média ± DP do número de clones contados por campo, em 5 campos aleatórios, utilizando o software livre ImageJ e expressa relativamente ao número de clones contados na condição de controle. (D, e, f, g) NPM1 knock-down ab-roga a tumorigenicidade de células LNCaP, quando injectado em pequenos ratos nús. shScr (n = 14) e shNPM1 (n = 14), as células LNCaP foram enxertados subcutaneamente em ratos pelados e o volume do tumor foi medida cada 2 dias após o enxerto (d). Gráfico em (e) é a quantificação do volume de tumores e shScr shNPM1-derivado no dia 24 pós-injecção. nível de expressão relativa NPM1 foi avaliada por transferência de Western em tumores quando os ratinhos foram sacrificados (F) e o peso do tumor foi medido (g). Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e estão expressos como a média ± DP.

Para determinar o papel da NPM1 no cancro da próstata, analisamos tumorigénese da shNPM1 LNCaP e shScr próstata LNCaP linhas celulares de cancro

in vivo

após a injecção subcutânea no flanco de ratos nus masculinos. células ShNPM1 produzir tumores menores (Figura 2D, e) e, ao contrário células shScr LNCaP, são mais propensos a produzir nenhum tumor em tudo quando enxertada (Figura 2E). Em detalhe, os tumores iniciados a partir de células LNCaP de controlo aparecem aos 22 dias pós-injecção ao passo que os tumores originários a partir de células LNCaP shNPM1 são visíveis apenas com 24 dias pós-injecção. Além disso, as curvas de crescimento nunca se em paralelo, mesmo depois de 29 dias (Figura 2D). Assim, os tumores iniciados a partir de células knocked-down NPM1 permaneceu menor do que tumores de controlo com 85% de diminuição do volume tumoral médio (Figura 2E). Esta diminuição importante dos resultados volume do tumor em um decréscimo de 95% do peso do tumor a partir de células LNCaP shNPM1 (figura 2g). Esta diminuição é pouco provável devido a uma perda de expressão do anti-NPM1 shRNA já que todos os tumores shNPM1 preservar uma diminuição de 90% no acúmulo NPM1 (figura 2f). Tomados em conjunto, estes dados demonstram claramente que NPM1 está envolvido no crescimento do tumor de próstata

in vitro

e

in vivo

.

NPM1 está envolvido no controle da expressão EGF

a fim de entender melhor como NPM1 pode promover um comportamento de células de câncer de próstata, foi realizada uma análise de matriz qPCR (array RT2 ProfilerTM, HAP-121A-2, Qiagen) e determinou a natureza dos genes cujos níveis de transcrição são modulados pela knockdown de NPM1 (dados não mostrados). Entre os 84 genes manchado na matriz, a acumulação de ARNm de Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) foi o mais significativamente diminuída em células LNCaP shNPM1. Esta modulação da expressão de EGF não resulta de um efeito inibidor global sobre a expressão do gene como a maioria dos genes não são afectados ou sobre-regulada quando NPM1 está diminuída (dados não apresentados). Este resultado foi confirmado por ensaios de RT-qPCR como acumulação de ARNm de EGF é diminuída em 40% em células LNCaP shNPM1 (Figura 3A). Além disso, para testar a actividade relativa da actividade do gene promotor do EGF em células de LNCaP e shSCR shNPM1, que estas células transfectadas com um plasmídeo repórter de luciferase-phEGF. Knockdown de NPM1 induz uma diminuição da actividade do promotor de EGF, que mostra que o efeito de NPM1 é susceptível de ser exercida ao nível da transcrição (figura 3b). Estes resultados sugerem que NPM1 controla direta ou indiretamente expressão EGF. Como o EGF é conhecida para activar especificamente o receptor de EGF (EGFR), nós investigamos se a activação do complexo de EGFR, bem como a activação dos seus efectores a jusante, a ERK1 /2 e AKT, é modulada pelo nível de expressão NPM1. Com base na análise do seu estado de fosforilação, mostra-se que a activação do EGFR (pEGFR) e de ERK1 /2 (pErk1 /2) é drasticamente reduzida ou quase suprimida quando a expressão de NPM1 é inibido (Figura 3C). Curiosamente, AKT fosforilação é menos sensível a uma tal inibição, sugerindo que NPM1 especificamente impactos via de MAPK (figura 3c). Estes efeitos do NPM1 na expressão EGF e ERK1 /2 via sugerem fortemente que NPM1 poderia ser envolvido na definição do loop EGF auto-regulação.

(a) NPM1 controla a expressão de EGF. Relativos níveis de ARNm de EGF em comparação com a p-actina foram analisadas por RT-qPCR em células LNCaP que expressam o controlo (shScr) ou NPM1 shRNA específica (shNPM1). (B) a atividade do promotor EGF controle NPM1. células shScr shNPM1 e LNCaP foram transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase-phEGF. actividade promotora de EGF foi avaliada por medição da actividade de luciferase 24 horas mais tarde. Os resultados do ensaio foram normalizados utilizando o promotor de CMV como o controlo e expressa como vezes de indução sobre células de controlo (shScr). (C) NPM1 controla a activação dos efectores a jusante da via de EGF /EGFR. Proteínas, extraídos a partir de células LNCaP shNPM1 shScr e cultivadas em RPMI 1640 10% FBS, foram sujeitas a electroforese através de SDS-PAGE. membranas transferidas foram coradas imunologicamente com anticorpos indicados. Os histogramas mostram a quantificação banda comunicados ao nível β-actina. Blots são representativos de três experiências independentes com resultados consistentes. Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e estão expressos como a média ± DP.

NPM1 potencia especificamente a actividade via MAPK para promover a proliferação e migração capacidades de células cancerosas da próstata

os dados acima demonstram que NPM1 está envolvida no controlo de expressão de EGF, um factor de crescimento que controla a via da MAPK e promove o comportamento tumorigénico de células de cancro da próstata. Então, a gente se perguntou se era a razão pela qual as células shNPM1 LNCaP foram mostrando diminuição comportamento tumorigénico. Nós investigamos se, assim, uma entrada de exógena de EGF pode resgatar a activação dos efectores da via EGFR /EGF e, subsequentemente, aumentar a proliferação de células LNCaP e migração. Control (shScr) ou NPM1 derrubado (shNPM1) células LNCaP foram privadas, a fim de desligar as vias de sinalização e, em seguida tratados com EGF.

análises de Western blot mostram que uma suplementação EGF exógena leva à fosforilação,

ie

, a activação de ambos o receptor de EGF e de um dos seus alvo a jusante, AKT, em ambas as células e shScr shNPM1. Pelo contrário, e o mais interessante, a fosforilação de ERK1 /2 é prejudicada especificamente em células shNPM1 (figura 4a). De acordo com este resultado, a adição de EGF exógeno não é capaz de restaurar a migração e invasão capacidades de células LNCaP shNPM1 nos ensaios correspondentes (Figura 4B, C). Estes resultados demonstram claramente que NPM1 é especificamente necessária para a activação da via de sinalização MAPK e que a potenciação da via de transdução está envolvido no controlo da proliferação e migração das capacidades de células de cancro da próstata.

(a) NPM1 a regulação negativa inibe EGF induzido atividade da via ERK1 /2. células shScr shNPM1 e LNCaP foram tratadas com 100 nM de EGF e a fosforilação dos efectores da via EGF /EGFR foi analisada utilizando a técnica Western Blot. Os histogramas mostram a quantificação banda comunicados ao nível β-actina. A mancha é representativa de três experiências independentes com resultados consistentes. (B) Apesar do tratamento EGF, capacidades de migração de LNCaP diminuiu para NPM1 não foram restaurados. o fechamento da ferida foi analisada 72 horas depois do tratamento contínuo com 100 nM de EGF. As células foram observadas ao microscópio invertido e fotografada. Os histogramas mostram feridas quantificação área usando ImageJ. (C) tratamento de EGF não resgatar proliferação de células LNCaP knockdown NPM1. ensaio de incorporação de BrdU foi realizada em shScr shNPM1 e LNCaP de 24 horas após tratamento 100 nM de EGF. A densitometria foi medida a 655 nm. Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e estão expressos como a média ± DP.

NPM1 actua a montante de MEK1 e a jusante de EGFR, para activar a via da MAPK, para o controlo de um auto EGF -regulação circuito em células de cancro da próstata

a fosforilação de ERK1 /2 é prejudicada especificamente em células shNPM1 mesmo na presença de EGF, sugere que, na via de MAPK, NPM1 actua a montante da ERK1 /2. Para identificar o efector (es) da via de sinalização induzida por EGFR em que NPM1 pode agir, e para determinar se a acção NPM1 é directa ou não sobre o promotor do gene EGF, foram realizados ensaios de transfecção com uma forma constitutivamente activa de MEKK1 (caMEKK1) : caMEKK1 fosforila ERK1 /2 cinase MEK1 /2, e, desse modo, constitutivamente activa de ERK1 /2, na ausência de MEK1 /2 inibição. Em células shScr LNCAP, caMEKK1 transfecção induz a fosforilação de ERK1 /2. Em células LNCaP shNPM1 caMEKK1 transfecção induz um efeito semelhante, salvando assim a via de sinalização de EGFR (Figura 5A). Este resultado sugere que o alvo NPM1 via de MAPK a jusante de EGFR, mas a montante de MEK1 /2, a fim de regular a ERK1 /2. Além disso, a co-transfecção do caMEKK1 construir com um plasmídeo repórter de luciferase phEGF-resgata também a actividade do promotor de EGF (Figura 5B) em células LNCaP knocked-down para NPM1. Estes resultados demonstram que a 1- é improvável que NPM1 directamente transactiva o promotor de EGF em células de cancro da próstata. 2- NPM1 pode em vez estimulam a via de sinalização MAPK para aumentar a transcrição do gene de EGF. 3- Fosforilação dados sobre AKT e ERK1 /2 sugerem fortemente que NPM1 actua ao nível de MEKK1 ou Ras /Raf nesta via.

(a) ERK1 /2 activação é resgatado por caMEKK1. shScr células LNCaP e shNPM1 são transfectadas com uma construção de constitutivamente activado de MEKK1 (caMEKK1) e o nível de fosforilação de ERK1 /2 foi analisado utilizando transferência de Western. (B) a activação ERK1 /2 via restaura a atividade do promotor EGF em células LNCaP subregulado para NPM1. LNCaP e células shSCR shNPM1 foram transientemente co-transfectadas com phEGF-Luc e caMEKK1. actividade promotora de EGF foi avaliada medindo a actividade de luciferase depois de 24 horas. Os resultados do ensaio foram normalizados contra a actividade repórter de controlo de CMV-Luc e expressa como vezes de indução sobre células de controlo (shScr). Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e estão expressos como a média ± DP.

Discussão

NPM1 desempenha um papel essencial no crescimento e proliferação celular. Entre outros, favorece a progressão do ciclo celular, biogênese do ribossomo e duplicação centrossoma [5] – [7]. Por conseguinte, uma correlação entre o aumento dos níveis de expressão NPM1 e a progressão do tumor foi estabelecida num vasto conjunto de tumores sólidos de origens diversas histológicos, tais como em gástrica [8], [9], do cólon [9], rim [10] ou do ovário cancros [11]. Apesar de inúmeros estudos revelaram que, paradoxalmente, NPM1 é capaz tanto de agir como um supressor de tumores e como um proto-oncogene durante a tumorigénese [12]. Por um lado, NPM1 participa na manutenção da estabilidade dos cromossomas e regula a actividade IRA [13] e, por outro lado, NPM1 promove a inibição de várias supressores tumorais, incluindo p53 ou Rb, e a activação de proto-oncogene c-Myc para melhorar a sua actividade de transformação [14]. Os nossos resultados anteriores mostraram que a NPM1 chaperona molecular é sobre-expressa em tecido de carcinoma da próstata, comparado com o controlo de tecido adjacente onde estimula a transcrição dependente de androgénio [1]. Agora queria investigar mais especificamente, se esta desregulação da expressão NPM1 pode atuar sobre as células tumorais da próstata invasivos e capacidades de migração.