Abstract
O tratamento do câncer, como oligonucleotídeos ou peptídeos requer sistemas de distribuição eficientes. Um peptídeo novela, TMTP1, anteriormente derivados e identificados em nosso laboratório mostraram notável capacidade para alvejar tumores altamente metastáticos tanto
in vitro e in vivo
, mesmo na fase inicial de focos de metástase oculta. TMTP1 moderadamente inibida viabilidade de células tumorais, embora não suficiente para considerarem um assassino eficiente das células tumorais. Neste estudo, procurou-se melhorar a actividade anti-tumoral de TMTP1. Para fazer isso, nós fundidos-lo para um peptídeo antimicrobiano,
D (KLAKLAK)
2, e denominou o péptido resultante TMTP1-DKK. Descobrimos que TMTP1-DKK poderia desencadear apoptose rápida na próstata humana e células cancerosas gástricas, tanto através da via de apoptose induzida por mitocondrial e da via de receptor de morte. Além disso, a injecção directa de TMTP1-DKK em ratinhos com cancros da próstata e xenoenxerto gástrico resultou na redução dos volumes tumorais e um atraso significativo na progressão do tumor e metástases
In vivo
. Estes resultados sugerem que TMTP1-DKK pode servir como um agente terapêutico eficaz para tumores metastáticos
citação:. Ma X, XI G, D Luo, Liu P, Li S, Liu Y, et al. (2012) efeitos antitumorais do peptídeo TMTP1-GG-
D (KLAKLAK)
2 em cancros altamente metastáticas. PLoS ONE 7 (9): e42685. doi: 10.1371 /journal.pone.0042685
editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de fevereiro de 2012; Aceito: 11 de julho de 2012; Publicado: September 11, 2012 |
Direitos de autor: © Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi fornecido pela National Science Foundation da China (No.30973472; 81001006; 30973148), programa de grande inovação Medicina (2009ZX09103-738; 2009ZX09103-739; 2009ZX09103-740), e os “973” programa da China (No. 2009CB521808). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a maioria da mortalidade associada a cancro é devido a metástase das células do tumor original para locais distantes do tumor inicial ou primária. Actualmente opções de tratamento disponíveis raramente são capazes de curar cancros metastáticos, tais como as arised a partir da próstata e cancro gástrico. Mundialmente, o câncer de próstata é a neoplasia maligna mais comum em homens ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer. O câncer gástrico continua sendo uma das neoplasias mais frequentes, fazendo com que 12% de todas as mortes relacionadas com o cancro a cada ano [1], [2], [3]. Além disso, o tratamento clínico destes tumores sólidos mantém-se relativamente ineficazes. Portanto, detecção e tratamento de metástases de tumores, metástases, especialmente ocultas, tem sido a principal abordagem de terapias contra o câncer recém-desenvolvidos. Os últimos anos de pesquisa sobre o câncer forneceu insights sobre os processos responsáveis pelo crescimento do câncer e identificou numerosos alvos moleculares para terapia do cancro possível [4], [5]. No entanto, o procedimento de aprovação para novas terapias contra o câncer é demorado. A esperança é que por segmentação alterações específicas em células de cancro na fase precoce de metástases, as terapias podem ser desenvolvidos para ser mais eficaz para matar células de tumor in
em
situ e focos de metástases, enquanto que menos prejudicial para as células normais. Como resultado, estas terapias inovadoras faria um grande impacto positivo na sobrevivência e qualidade de vida de pacientes com câncer.
Durante a última década, a área de desenvolvimento de medicamento contra o câncer foi transformado com a identificação de específico molecular alvos [6], [7], [8]. terapia de gene alvo pode ser conseguida através de uma variedade de técnicas, incluindo a terapia génica e a transcrição de genes. vantagens recentes na entrega direccionada incluem a utilização com sucesso de pequenos inibidores moleculares, anticorpos monoclonais e péptidos curtos de segmentação [9], [10]. O desenvolvimento de péptidos curtos de segmentação parece ser uma via promissora para a terapia de gene alvo bem sucedida. péptidos de segmentação curtas têm excelente penetração de tecido e o mínimo de toxicidade e imunogenicidade, tornando-os aptos para aceitação pelos pacientes e médicos.
Recentemente, identificou-se um péptido de ácido 5-amino, TMTP1, que se ligou a uma série de altamente metastático linhas celulares de cancro
in vitro
e
in vivo
, particularmente aqueles de micrometasteses fígado atípicos que continha um pequeno número de células neoplásicas [11]. No entanto, TMTP1 não reconheceu linhas de células normais e não-metastáticos. Nós também descobrimos que altas concentrações de TMTP1 poderia mediar a apoptose de células tumorais. Desde TMTP1 ligado a cancros metastáticos com alta especificidade, pode ser útil como uma ferramenta de diagnóstico e /ou têm função citotóxica. Especificamente, TMTP1 poderia ser usado na construção de personalização
de Novo
conjugados peptídicos. Estes péptidos podem ser personalizados para várias aplicações de diagnóstico e terapêuticas através de conjugação para uma ampla variedade de agentes, tais como vírus, proteínas e péptidos antimicrobianos de segmentação. Neste estudo, foram acoplados TMTP1 para um péptido antimicrobiano catiónico conhecido pela sua actividade citotóxica forte, a fim de aumentar os seus efeitos anti-tumorais.
Existem mais do que 100 péptidos antibióticos que ocorrem naturalmente e os seus
de novo
projeto tem recebido muita atenção [12], [13], [14], [15], [16]. Ellerby et
ai
[17] verificaram que quando um conjugado péptido antimicrobiano catiónico,
D (KLAKLAK)
2, para o domínio homing CNGRC, o péptido resultante tinha actividade anti-tumor através da sua capacidade de segmentar mitocôndrias e desencadear a apoptose. Estes e outros peptídeos antibióticos pró-apoptóticos estruturalmente semelhantes permanecem relativamente não-tóxicos fora das células eucarióticas. No entanto, uma vez absorvido pelas células tumorais, que induziu inchaço mitocondrial e mitocôndrias apoptose dependente [18], [19], [20]. No entanto, um grande problema com estes péptidos é assegurar a sua introdução nas células. Assim, estes péptidos devem ser acoplados a péptidos de direccionamento de tumor que permitem internalização mediada pelo receptor. Isto assegura que o péptido quimérico, vai entrar no citosol de células alvo, onde pode induzir a apoptose dependente de mitocondrial.
Neste estudo, foram fundidos
D (KLAKLAK)
2 a fase sólida por TMTP1 a síntese de péptidos em um modelo automatizado Applied Biosystems e chamado o péptido resultante TMTP1-DKK [11]. Nossa hipótese é que o peptídeo TMTP1 permitiria para a segmentação, enquanto
D (KLAKLAK)
2 promoveria mitocôndrias apoptose induzida. Neste estudo, avaliou-se a especificidade e anti-tumor notável capacidade de TMTP1-DKK em tumores metastáticos
in vitro
e
in vivo
.
Resultados
TMTP1-DKK lares para células de tumor altamente metastáticas in vitro e in vivo
Demonstrámos anteriormente que TMTP1 se liga especificamente a células tumorais metastáticas [11]. Para determinar se o péptido-TMTP1 DKK sintetizada de novo retém a especificidade de ligação do seu domínio de direccionamento, TMTP1, que conjugado TMTP1-DKK a FITC. Em seguida, examinaram a ligação do conjugado com FITC TMTP1-DKK a várias linhas de células cancerígenas e as células normais
in vitro
e
in vivo
. Conjugado com FITC TMTP1 DKK-ligada especificamente à linha celular de cancro da próstata altamente metastático PC-3M-1E8 e a linha celular de cancro gástrico MKN-45sci (Figura 1A, a e c,). No entanto, TMTP1-DKK não alvo as células da linha celular não metastática PC-3M-2B4, a linha celular de fibroblastos murinos NIH /3T3, o normal mammary epithelial cell MCF-10A, LO2 célula normal do fígado e células HEK293 (Figura 1a, b , d e B).
a imagens fluorescentes das células tumorais tratadas com TMTP1-DKK foram examinados com microscopia confocal de varredura a laser. (A) As células PC-3M-1E8 (b) células PC-3M-2B4 (c) células MKN-45sci (d) células NIH /3T3. FITC-TMTP1-DKK (verde) e peptídeo de controle foram examinados em tumores de xenoenxerto, incluindo PC-3M-1E8 (e) TMTP1-DKK, (f) svTMTP1-DKK, MKN-45sci (g) TMTP1-DKK, (h) svTMTP1 -DKK. Os núcleos foram co-coradas com DAPI (azul). imagens B fluorescentes das células nomal (células MCF-10A, LO2 normais mamárias epiteliais normais de células hepáticas e células HEK293) tratados com TMTP1-DKK foram examinados com microscopia confocal de varredura a laser. A mudança morfológica de células nomal foi visualizada usando microscópio invertido.
A seguir, procuraram determinar se TMTP1-DKK ligado a estas células tumorais altamente metastáticas
in vivo
. Para este fim, as células MKN-45sci PC-3M-1E8 e foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus BALB /c. Os ratinhos com tumores 1-1,5 cm de diâmetro foram injectados com 300 ug de péptidos de FITC-TMTP1-DKK através da veia da cauda. Após 24 horas, os tumores e os órgãos de controlo foram excisados e processados para seccionamento congelado. Detectamos a biodistribuição Dinâmica de conjugado com FITC TMTP1-DKK de pelo 1 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h nos modelos de ratinho de cancro gástrico ortotópico MKN-45sci e cancro da próstata subcutânea PC-3M-1E8 por confocal microscopia. TMTP1-DKK foi detectada em tecidos de tumor altamente metastática xenoenxerto MKN-45sci (Figura 1A, E e G) de PC-3M-1E8 e. Por microscopia confocal mostrou que TMTP1-DKK pode persistir em um nível superior por 48 h nos modelos de ratos com câncer gástrico ortotópico MKN-45sci e câncer de próstata subcutânea PC-3M-1E8 (Figura S1). O que pode indicaram que o péptido podia estável em tecido tumoral. No entanto, a fluorescência não foi detectada em órgãos e tecidos de controlo. O ensaio homing com o péptido de controlo, svTMTP1-DKK, não apresentaram coloração de fluorescência óbvio em PC-3M-1E8 e MKN-45sci tecido do tumor xenoenxerto ou tecidos normais (Figura 1A, F e H, Figura S2,).
TMTP1-DKK inibe a proliferação e induz a apoptose em células de cancro altamente metastáticas
próxima procuraram determinar se TMTP1-DKK pode inibir a proliferação de células de cancro altamente metastáticas. Para testar isto, o PC-3M-1E8, MKN-45sci, e células NIH /3T3 foram tratadas com várias concentrações (1-20 uM) de TMTP1-DKK e péptidos de controlo, durante 24 h. As taxas de crescimento de células foram medidas pelo ensaio de MTT. TMTP1-DKK inibiu a proliferação de células de PC-3M-1E8 e células MKN-45sci de um modo dependente da dose com a inibição máxima ocorrendo a uma dose de 15-20 uM de TMTP1-DKK (Figura 2A e B
P
. 0,01 Além disso, a taxa de inibição por TMTP1 foi muito mais baixa do que por TMTP1-DKK (Figura 2A e B,
P
0,01). a inibição sobre a proliferação de fibroblastos de murino células NIH /3T3 não foi detectada (Figura 2C). e-svTMTP1 DKK não mostrou qualquer efeito sobre a próstata e células de cancro gástrico (Figura 2D, F).
taxas de sobrevivência celular foi determinada por ensaios MTT realizadas em triplicado (
barras de erro
, ± DP). os dados apresentados representam a percentagem de células sobreviventes em comparação com células não tratadas. os resultados representativos são mostrados. as diferenças de taxas de sobrevivência entre 10 uM e 20 uM TMTP1-DKK são mais significativa em qualquer PC- 3M-1E8 ou células MKN-45sci (
P
0,01). no entanto, pouco ou nenhum efeito foi observado em fibroblastos de murino a proliferação de células NIH /3T3 quando eles foram tratados com TMTP1-DKK. D viabilidade das células de MKN-45 e células cancerosas PC-3M-1E8 tratada diferentes concentrações (0-20 uM) de svTMTP1-DKK durante 24 horas foi medida pelo ensaio de MTT. E quantificação morfológica de apoptose celular por microscópio invertido no PC-3M-1E8 e células MKN-45sci tratadas com 10 mM TMTP1-DKK. Depois de tratada com DKK, as células apresentaram encolhimento celular, a desintegração da membrana e nuclear condensado /fragmentação. F mudança pequeno morfológica foi observada por microscópio invertido no PC-3M-1E8 e MKN-45sci tratadas com 10? M svTMTP1-DKK para 24 horas.
É possível que TMTP1-DKK proliferação restringido por induzir apoptose em células de cancro altamente metastáticas. Para testar isto, o PC-3M-1E8, células MKN-45sci, normal, de células epiteliais mamárias MCF-10A, LO2 célula normal do fígado e células HEK293 que foram tratados com 10 ^ M-TMTP1 DKK e svTMTP1-DKK durante 24 h. Quaisquer alterações morfológicas nas células foram observadas ao microscópio de contraste de fase. Taxas de taxas de apoptose foi determinada por FACS utilizando FITC-anexina V e coloração com iodeto de propídio. células MKN-45sci tratados com TMTP1 DKK-PC-3M-1E8 e mostrou encolhimento da célula, desintegração da membrana, e a condensação nuclear /fragmentação (Figura 2E), que são todas alterações morfológicas características de células em apoptose. Enquanto TMTP1-DKK não afectou a viabilidade e morfologia destas células normais »sob microscópio de contraste de fase (Figura 1B). A análise de FACS indicaram também que TMTP1-DKK induzida apoptose celular de um modo dependente da dose em doses de 10 pM ou superior, em comparação com o controlo (Figura 3A e C).
As células foram tratadas durante a noite com 10 ^ M TMTP1- DKK péptido e, em seguida analisadas por citometria de fluxo após 12 h, 24 h e 48 h. Proliferação de células PC-3M-1E8 e células MKN-45sci tratadas com peptídeos TMTP1-DKK (barras cheias) mostraram uma diminuição na viabilidade através da apoptose ao longo do tempo (
P Art 0,01). No entanto, as células de fibroblastos murino NIH /3T3 não mostraram alterações significativas. B moléculas de sinalização envolvidos no efeito apoptótico de péptido TMTP1 DKK-tratada. As células em cultura tratados com 10 uM de péptidos TMTP1-DKK durante 24 horas, foram recolhidas e lisadas. proteínas celulares totais foram resolvidas por 12% elctrophoresis gel de SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Após o bloqueio com leite magro a 5%, as membranas foram incubadas durante 1 h com anticorpos de 1 ug /ml primárias (caspase 9 (35 kD, 17 kD), caspase 8 (20 kD) e caspase 3 (19 KD)) seguido de rábano anticorpos secundários anti-coelho conjugados com peroxidase. As manchas foram expostas a quimioluminescência do substrato e desenvolvido com Hyperfilm MP. C células PC-3M-1E8 e células MKN-45sci foram provocados com 10 uM TMTP1-DKK na presença (+) de 40 uM de Z-VAD-fmk, durante 24 h. Após 24 horas, analisou-se a viabilidade das células. A ampla gama inibidor da caspase Z-VAD-fmk diminuiu a taxa de apoptose de células PC-3 M-1E8 e MKN-45sci.
TMTP1-DKK ativa ambas as vias de apoptose mitocondrial e Fas-dependentes
D (KLAKLAK)
2 é um péptido de D-aminoácido anfipático que se liga selectivamente a bacteriana, mas não eucariótica, membranas celulares [9]. Em eucariotas, que inicia a apoptose através da ruptura das mitocôndrias, presumivelmente, uma vez que as membranas das mitocôndrias se assemelham aos de bactérias [10]. Existem duas grandes vias de sinalização para a apoptose: a via extracelular de receptor de morte Fas e a via mitocondrial intracelular. Para identificar o circuito apoptótico desencadeado por tratamento TMTP1-DKK no PC-3M-1E8 e células MKN-45sci, examinámos a expressão de caspase-3, 8, 9 e por western blotting. As bandas correspondentes a caspase 3 activa (19 kDa), caspase 8 (20 kDa), e caspase 9 (duas bandas: 17 kDa e 35 kDa) foram detectadas. Assim, em TMTP1 DKK-tratados células cancerosas, a clivagem de caspases 3, 8, e 9 foram todos detectado. Isto indicou que tanto a via do receptor de morte Fas e a via mitocondrial foram activadas por TMTP1-DKK (Figura 3B).
Para validar adicionalmente que TMTP1-DKK promoveu a apoptose, foi testado se os inibidores de caspases podia diminuir o TMTP1- DKK induzida taxa de apoptose em PC-3M-1E8 e células linhas MKN-45sci. A ampla inibidor gama caspase Z-VAD-FMK poderia diminuir a taxa apoptótica de tratados TMTP1-DKK PC-3 M-1E8 e células MKN-45sci de 45,2 ± 2,3% para 22,1 ± 1,3% e 53,7 ± 2,6% para 25 ± 0,8 %, respectivamente (Figura 3C). Estes resultados sugerem que TMTP1-DKK apoptose induzida tanto através da via mitocondrial intracelular e da via de receptor de morte Fas.
TMTP1-DKK inibe a invasão do tumor
in vitro
Para examinar se TMTP1-DKK células afectadas invasão, PC-3M-1E8 e células MKN-45sci foram tratados quer com TMTP1-DKK ou filtro de água estéril durante 12 h, depois que a invasão de células foi determinada por um ensaio de Matrigel invasão (Figura 4A) . A taxa de migração celular de células PC-3M-1E8 diminuiu 52,38 ± 3,3%, quando as células foram tratadas com 2 uM de péptido-TMTP1 DKK. Da mesma forma, a migração celular de MKN-45sci células diminuiu 46,16 ± 2,7%, nas mesmas condições (Figura 4B).
As células foram incubadas com 2 uM de péptido-TMTP1 DKK durante 12 h. foram realizados ensaios de Transwell de migração de células PC-3M-1E8 e células MKN-45sci. Após 24 h de incubação, as células a partir do lado superior do filtro foram removidas e as células a partir da superfície inferior do filtro foram fixadas e coradas. Os dados são a média ± DP de três experiências independentes; cada uma realizada em triplicado. migração celular B foi reduzida de 52,38 ± 3,3% em células PC-3M-1E8 e 46,16 ± 2,7% em células MKN-45sci em comparação com os controlos apropriados.
TMTP1-DKK inibe o crescimento e desenvolvimento do tumor
in vivo
a seguir, procurou explorar se peptídeo TMTP1-DKK pode representar uma possível estratégia terapêutica para suprimir o crescimento tumoral
in vivo
. Para testar isto, analisamos o efeito de TMTP1-DKK no crescimento do tumor por via subcutânea em ratos. MKN-45sci cancro gástrico ortotópico e células de cancro da próstata PC-3M-1E8 foram injectadas subcutaneamente em ratinhos que foram depois tratados com 50 ^ M-TMTP1 DKK, TMTP1 ou água-filtro estéril através de injecção intraperitoneal (IP) em dias alternados. camundongos portadores de tumor PC-3M-1E8 tratados com TMTP1-DKK mostrou um aumento na taxa de sobrevivência de 55 dias (intervalo de 49 a 58 dias) a 65 dias (intervalo de 60 a 69 dias), em comparação com grupos de controle. Enquanto isso, o tempo de sobrevivência de ratos portadores de tumores MKN-45sci aumentou de 35 dias (variando de 29 a 39 dias) para 42 dias (intervalo de 35 a 44 dias) quando tratados com TMTP1-DKK.
TMTP1 tratamento -DKK também o crescimento do tumor marcadamente inibida no cancro da próstata subcutânea PC-3M-1E8 e camundongos com câncer gástrico tendo ortotópicos MKN-45sci. O volume médio de ambos os tipos de tumores de xenoenxerto diminuído no grupo tratado em relação TMTP1-DKK ao controlo (Figura 5B, C). Quarenta dias após a injecção, o volume do tumor de xenoenxerto de cancro da próstata PC-3M subcutânea-1E8 foi, em média, 18% a do controlo em TMTP1-DKK ratinhos tratados (Figura 5D). Além disso, investigamos se peptídeo TMTP1-DKK apoptose induzida no xenoenxerto de tumores de próstata
in vivo
pelo ensaio de TUNEL. O número de células apoptóticas observados aumento em péptido tratado TMTP1-DKK grupo relativamente ao controlo. Assim, estes resultados mostram um efeito anti-tumoral vigorosa de peptídeo TMTP1-DKK
in vivo
.
A Ratos tratados com peptídeo TMTP1-DKK sobreviveram mais tempo do que os ratos controle tratados com uma mistura equimolar de peptídeo TMTP1 ou filtro de água estéril, como mostrado por uma trama de sobrevida de Kaplan-Meier. B, C o cancro da próstata PC-3M-1E8 e cancro gástrico ortotópico MKN-45sci tratados com péptido TMTP1-DKK foram menores do que os tratados com ptido de controlo. O crescimento do tumor em murganhos D portador de tumor PC-3M-1E8 submetida a terapia peptídica TMTP1-DKK. Os ratinhos foram tratados durante um período de 40 dias (
N
= 9). Durante o período de tratamento, os tumores foram medidos duas vezes por semana. Tumores volume, em ratinhos tratados com peptídeo TMTP1-DKK foi em média de 18% do tamanho do controlo. Os volumes tumorais foram avaliados no dia 1 (○) e dia 40 (•). P 0,05, teste-t. E Os animais foram sacrificados seis dias depois do tratamento TMTP1-DKK. O tumor foi recuperado e fotografada imediatamente após análise da morte celular por apoptose pelo ensaio de TUNEL. O número de células apoptóticas aumentou de forma notável em tumores tratados com péptido TMTP1-DKK. um, Ampliação: 100 x. b Ampliação:. × 200
TMTP1-DKK suprime a metástase do tumor e progressão de xenotransplantes ortotópicos MKN-45sci em ratinhos atímicos
Para testar se TMTP1-DKK pode diminuir a metástase
in vivo
, examinámos os efeitos do presente péptido num modelo de metástases. implante ortotópico de fragmentos de cancro gástrico MKN-45sci humanos para dentro do estômago de seis ratinhos nus causou um aumento significativo no número de tecidos metastáticos, incluindo quatro metástases do fígado, dois metástases do baço, três metástases parede abdominal, uma metástase do rim, e duas linfáticos mesentéricos metástase (uma ratinhos de controlo morreram no prazo de 16 dias de implantação). No entanto, a administração IP dos TMTP1-DKK a cada dois dias durante 20 dias provocou um decréscimo dramático e dependente da dose no número de tecidos metastáticos, sem metástases sendo observada em seis TMTP1 DKK-tratados ratinhos nus (Figura 6A, C). Além disso, a H E-safranina análises de metástases do fígado, metástases do baço, metástase parede abdominal, e metástase rim revelou que o desenvolvimento da fase de focos metastáticos (Figura 6B). Assim, podemos concluir que o tratamento TMTP1-DKK diminuiu significativamente o crescimento de tumores e metástases
in vivo
. Além disso, a apoptose de células do tumor gástrico ortotópico foi detectada por ensaio de TUNEL (Para a quantificação, ver Figura 6D).
péptido TMTP1-DKK causou uma diminuição dramática e dependente da dose no número de tumores metastáticos (amarelo setas) em câncer gástrico ortotópico MKN-45sci. amostras de tecido foram colhidas C metástase e patologicamente confirmada por H E de coloração. tumores gástricos ortotópico D foram recuperados e fotografada imediatamente após análise da morte celular por apoptose pelo ensaio de TUNEL. Colunas, número médio de células TUNEL-positivos contados em três campos selecionados aleatoriamente em três amostras de tumor de cada grupo; barras de erro, SD. *, P . 0,001 pelo teste t de Student em comparação com o grupo controle
TMTP1-DKK tratados ratos sobreviveram bem e não mostrou sinais de toxicidade ou perda de peso corporal ao longo dos experimentos. Colectivamente, estes resultados sugerem que TMTP1-DKK pode inibir a metástase do tumor e o crescimento do tumor
in vivo
.
Discussão
O tratamento do câncer utilizando terapêutica micromoleculares como oligonucleotídeos ou peptídeos exige sistemas de distribuição eficientes, capazes de penetração intracelular. Recentemente, uma série de novos péptidos foram identificados que se ligam especificamente à membrana plasmática de células endoteliais tanto associados a tumores e cancro. Os péptidos identificados foram promissores alternativas para biomoléculas usado actualmente para o direccionamento de células metastáticas, devido à sua rápida depuração no sangue, aumento de difusão e penetração do tecido, a natureza não imunogénico, e facilidade de síntese [21], [22], [23], [24], [25]. Temos anteriormente demonstrado que metástases ocultas ou micrometástases subclínicas foram distintamente detectado por TMTP1 [11]. No presente estudo, investigou também se TMTP1 poderia entregar agentes terapêuticos de forma eficiente. Foi examinada a capacidade de TMTP1 para entregar um péptido pró-apoptótica de células de cancro altamente metastáticas acoplando-o para o pró-apoptótica
D (KLAKLAK)
2 domínios. Nós escolhemos o péptido 14-amino-ácido sintético KLAKLAKKLAKLAK porque era inerte fora das células, mas tornou-se tóxicos quando internalizados causando ruptura da membrana mitocondrial, o que leva à morte celular programada.
Os nossos dados mostram que TMTP1-GG-
D (KLAKLAK)
2 vinculado especificamente para linhas de células tumorais altamente metastáticas, células cancerosas da próstata PC-3M-1E8 e células de câncer gástrico MKN-45sci
in vitro
e
in vivo
. No entanto, TMPT1-GG-
D (KLAKLAK)
2 não se ligam à célula nometastatic cancro da próstata PC-3M-2B4 e a linha celular de fibroblastos murinos NIH /3T3 normais das células epiteliais mamárias MCF-10A, células hepáticas normais células LO2 e HEK293 (Figura 1). Os resultados mostraram que TMTP1-DKK não afetou a viabilidade e morfologia destas células normais “. Uma vez que observamos FITC-TMTP1-GG-
D (KLAKLAK)
2 vinculativo para ambas as linhas de células e tumores de xenoenxerto em ratinhos nude, que argumentou que TMTP1 teria como alvo a entrega do peptídeo pró-apoptótica para tumores altamente metastáticos.
Examinámos ainda mais os efeitos anti-tumorais do péptido de fusão TMTP1-DKK. Nossos resultados mostram que TMTP1-DKK mediada actividades anti-tumorais notáveis tanto i
n vitro
e
in vivo
, em comparação com qualquer TMTP1 ou DKK sozinho. O péptido de fusão TMTP1-DKK apoptose induzida rápida e potente. Baixas concentrações de TMTP1-DKK poderia induzir a morte de células de cancro enquanto teve pouco efeito sobre as células de fibroblastos murinos NIH /3T3. TMTP1-DKK mostrou efeitos de alta anti-tumorais em células PC-3M-1E8 altamente metastático MKN-45sci e, em comparação com TMTP1. DKK por si só não pode desencadear a apoptose, uma vez que não podia ser transduzida para o citoplasma das células tumorais. Quando ligado ao péptido alvo TMTP1, níveis micromolares de DKK resultou em aumento de pelo menos 100 vezes de matar eficiência em células cancerosas. Curiosamente, o aumento da eficiência matando não foi observado na linha celular de fibroblastos murinos NIH /3T3. Além disso, TMTP1-DKK significativamente inibiu a capacidade de invasão das células tumorais
in vitro
em um ensaio Transwell. Estes dados também demonstram a natureza modular do domínio de direccionamento /transdução e o domínio pro-apoptose em TMTP1-DKK. Cada domínio confere as suas propriedades sobre o péptido acoplado para gerar um agente biologicamente activo.
D (KLAKLAK)
2 tem actividade antibacteriana, mas é relativamente não tóxica para as células eucarióticas. No entanto, tem sido demonstrado que se
D (KLAKLAK)
2 é fornecido para o citoplasma das células de mamífero, que perturba mitocôndrias, devido à semelhança das membranas mitochonrdrial e bacterianas, e inicia a apoptose [26]. Estudos anteriores mostraram que quando
D (KLAKLAK)
2 foi conjugado com um péptido homing através de um ligante GG que casas para a vasculatura do tumor e foi citotóxico selectivamente para células endoteliais angiogénicos e tinha actividade anti-tumoral
In vivo
[26]. Na sequência de internalização, o pró-apoptótica
D (KLAKLAK) peptídeo
2 agiu por quebrar membrana mitocondrial, o que faz com que o citocromo c efluxo para o citoplasma resultando em apoptose. No citoplasma, o citocromo c forma um complexo com Apaf-1 e pro-caspase-9. Interação com pro-caspase-9 resultados em sua clivagem e ativação, iniciando a clivagem de caspases efetoras a jusante. Em nosso estudo, observamos activado caspase 9 por western blot em células de tumor tratados TMTP1-DKK, sugerindo envolvimento da via mitocondrial (Figura 3). Também se observou a activação de caspase 8, o que sugeriu a via de morte celular extracelular de Fas-ligando foi envolvido em TMTP1-DKK apoptose induzida bem. A eficiência de TMTP1-DKK apoptose induzida foi inibido pelo inibidor de gama larga de caspases Z-VAD-FMK na PC-3M-1E8 e células MKN-45sci. Por isso, o nosso estudo mostrou que TMTP1-DKK apoptose desencadeada por meio de tanto a via mitocondrial e a via de receptor de morte.
TMTP1-DKK pareceu inibir selectivamente o crescimento do tumor e tem pouco efeito sobre outros tecidos no xenoenxerto subcutâneo e ortotópico modelos de ratos transplante. Ambos os tumores de xenoenxertos subcutâneos de PC-3M-1E8 e os tumores gástricos ortotópicos MKN-45sci murinos foram significativamente inibida por TMTP1-DKK. O tempo de sobrevivência de ratinhos nus portadores de tumor em ambos os modelos foi significativamente prolongado pelo tratamento TMTP1-DKK. Cessação da administração peptídeo terapêutico levou a um crescimento tumoral rápida e morte de animais experimentais. Além disso, fornecida evidência experimental directa em um modelo pré-clínico da eficácia de interferência de crescimento ortotópico de células de cancro gástrico humano em ratinhos nus, tanto no local primário e metástases. Observamos metástases tumorais em todos os animais não tratados, mas apenas uns poucos em TMTP1-DKK animais tratados. Assim, os resultados dos xenoenxertos ortotópicos MKN-45sci revelou que TMTP1-DKK eficientemente inibida metástase de tumores em ratinhos. Os efeitos terapêuticos de péptido-TMTP1 DKK
In vivo
foram também mostrado ser o resultado de células tumorais por apoptose, como demonstrado por um ensaio de TUNEL (Figura 5, 6).
Tomados em conjunto, estes dados sugerem que TMTP1-DKK é um agente anti-tumoral eficiente tanto
in vitro
e
in vivo
. É disparado apoptose numa série de células de cancro altamente metastáticos através de tanto a via mitocondrial e via de receptor de morte. Os nossos resultados sugerem que TMTP1-DKK pode ser um agente terapêutico candidato poderosa para tumores metastáticos com base na sua actividade de direccionamento específico e eficaz para matar tumores. Um estudo mais aprofundado de TMTP1-DKK e seus análogos podem levar à descoberta de novos agentes anti-tumorais e metástase.
Materiais e Métodos
projeto Peptide e síntese |
TMTP1- DKK (NVVRQ -GG-
D (KLAKLAK)
2) e svTMTP1-DKK (VNQRV -GG-
D (KLAKLAK)
2), que é o péptido de controlo TMTP1 (NVVRQ) , foram criados pelo acoplamento do domínio de direccionamento (TMTP1) eo pró-apoptótica
D (KLAKLAK)
2 domínios através de uma ponte glycinylglycine como descrito [11]. isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi acoplado ao péptido através de uma glicina adicional na extremidade N-terminal. péptidos de controlo (DKK, TMTP1 e svTMTP1-DKK) e DKK-TMTP1 foram sintetizados utilizando a química do Fmoc num sintetizador de fase sólida e purificou-se por HPLC de Xian Huachen Bio-Tech Ltd (Xian, China). A sequência e estrutura dos péptidos foi confirmada por espectrometria de massa. Os péptidos foram dissolvidos em água filtro estéril a uma concentração de 1 mM.
As linhas celulares e os reagentes
O altamente metastáticos e não metastáticos de células de cancro da próstata linhas humano PC-3M-1E8 e PC-3M -2B4 respectivamente, foram gentilmente cedidas pelo Dr. Jie Zheng (Universidade de Pequim, Pequim, China) [27], [28]. A célula cancerosa gástrica lineMKN-45sci humano, o fibroblasto murino células NIH /3T3, células epiteliais normais mamário MCF-10A, LO2 célula normal do fígado e células HEK293 foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Todas as células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) a 37 ° C com 5% de CO
2. Z-VAD-FMK foi obtido a partir de Bachem (Heidelberg, Alemanha).
Construção de modelos do rato
Quatro semanas de idade BALB /c
nu /nu
ratos foram obtido a partir da SLAC animais de Laboratório Co. Ltd (Xangai, China). Nos estudos de injecção directa intratecal (IT), 3 × 10
6 células PC3M-1E8 foram suspensos em 100 ul de solução salina normal e injectadas por via subcutânea (SC) nos flancos direitos de ratinhos (4-6 semanas de idade). Os tumores foram deixados crescer até 4-6 mm de diâmetro antes do tratamento. fragmentos de tumor frescas (2 mm
3) foram então implantadas SC no tronco posterior dos ratinhos anestesiados.
O modelo de ratinho de cancro gástrico ortotópico MKN-45sci, que tem o potencial para a metástase do fígado-específica , foi gentilmente cedido pelo Dr. Jinjun Li (Instituto do Câncer de Xangai, faculdade de Medicina de Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China) [29], [30], [31]. fragmentos de tumor frescas foram obtidos como descrito acima. Após anestesia do rato, o estômago foi exposto e a parte da membrana serosa raspada com uma pinça. Uma peça de um milímetro
3 de tumor foi então fixado no site raspadas da superfície serosa com uma sutura absorvente 5-0.