Abstract

Objectivo

A capacidade de prever as respostas à quimioterapia para o câncer epitelial de ovário seroso (EOC ) seria valioso desde que os pacientes EOC intrinsecamente quimiorresistentes (doença persistente ou recorrente no prazo de 6 meses) ganha pouco benefício da quimioterapia padrão. O objetivo deste estudo foi examinar e identificar biomarcadores distintos em ascite de EOC serosa associados com chemoresistance intrínseco.

Métodos

As amostras de proteína a partir de ascite de 12 quimiossensíveis e 7 pacientes EOC serosa intrinsecamente quimiorresistentes foram analisados ​​usando diferença de fluorescência de duas dimensões em gel de electroforese (2-D DIGE) acoplado com dessorção por laser assistida pela matriz /ionização por espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF /TOF MS). Além disso, as proteínas identificadas foram validados por ELISA em amostras de ascite de 19 quimiossensíveis e 9 pacientes EOC intrinsecamente quimiorresistentes.

Resultados

O número de pontos detectados em todos os géis 2-D DIGE variou de 1523 -1711 usando análise de software DeCyder. Trinta e quatro pontos foram diferencialmente expressos com base nos critérios de uma proporção média de mais de 1,5 e uma t-teste do estudante

P

valor 0,05. Após análise MALDI-TOF /TOF MS, 11 proteínas diferencialmente expressas, incluindo 3-regulada e 8 proteínas regulada para baixo, em ascite de tumores quimiorresistentes foram identificados com sucesso. Dos quatro proteínas selecionadas (ceruloplasmina, Apolipoproteína A-IV, transtirretina e haptoglobina) em ascite testados por ELISA, apenas a ceruloplasmina esteve presente em níveis significativamente diferentes entre o resistente à quimioterapia, e as amostras de ascite quimiossensíveis com concentrações médias de 192,2 mcg /mL e 157,5 mg /ml, respectivamente (

P

= 0,001).

Conclusão

o significativamente up-regulamentado nível de ceruloplasmina no fluido ascite de quimiorresistentes intrínseca pacientes EOC serosa sugere seu potencial como um biomarcador de prognóstico para respostas a quimioterapia. Este achado solicita uma investigação mais aprofundada com um estudo mais amplo, a fim de validar a utilidade clínica da ceruloplasmina

Citation:. Huang H, Li Y, Liu J, Zheng M, Feng Y, Hu K, et al. (2012) Triagem e identificação de biomarcadores em ascite relacionados a Intrínseca chemoresistance de cancros Serous epitelial de ovário. PLoS ONE 7 (12): e51256. doi: 10.1371 /journal.pone.0051256

editor: Alexander James Roy Bishop, Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de junho de 2012; Aceito: 30 de outubro de 2012; Publicação: 10 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Natural Science Foundation da província de Guangdong, China (No. 7.001.535). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

à base de platina quimioterapia combinada é o padrão de tratamento de primeira linha para o carcinoma de ovário estágio avançado epitelial (EOC). Os tumores são considerados “sensíveis platina”, se o intervalo clínico livre de progressão é mais do que 6 meses, mas cerca de 20% a 30% dos pacientes com o progresso ou os seus tumores tornam-se rapidamente resistente a este tratamento [1]. Estes pacientes com chemoresistance intrínseca que experimentam uma recorrência dentro de 6 meses ganha pouco benefício do tratamento padrão. Há também evidências que sugerem que quanto maior o intervalo até recorrência, melhor será a taxa de resposta à quimioterapia subsequente [2]. Portanto, chemoresistance para cancros do ovário podem estar presentes no início do tratamento (resistência intrínseca) ou pode se desenvolver durante o tratamento (resistência adquirida).

Atualmente, chemoresistance de EOC só pode ser determinado retrospectivamente após doentes tiveram a carga e toxicidade do tratamento ineficaz. Portanto, a identificação de biomarcadores moleculares característicos relacionadas com chemoresistance intrínseco no EOC pode levar a terapias personalizadas individualmente e melhoria dos resultados desde a quimioterapia padrão lhes oferece muito pouco benefício.

Vários estudos recentes têm utilizado microarrays de genes para identificar a expressão genética distinta em pacientes intrínsecas quimiorresistentes do cancro do ovário em diferentes plataformas, tais como arranjos de cDNA nylon, chips Affymetrix e microarrays Agilent oligonucleotídeos [3], [4]. Esses estudos identificaram genes diferentes prognósticos e de previsão que podem distinguir início da recaída tardia ou progressão da doença. No entanto, a transcrição de um gene alvo no tumor pode não ser um bom preditor da resistência à droga e prognóstico de cancro do ovário. Por exemplo, o ARNm abundância pode não se correlacionar com a expressão da proteína correspondente e função. Além disso, para alguns pacientes com câncer ovariano primário ou recorrente, amostras de tecidos nem sempre estão disponíveis para perfis gene.

Ao contrário com outra metástase maligna pélvica /abdominal, ascite maciças são uma manifestação clínica distintivo em EOC avançado, com mais de 80% desses pacientes com metástase generalizada às superfícies serosa e peritoneal associado e /ou derrames pleurais [5]. Os fluidos corporais têm sido mostrados para ser excelente meio para a descoberta de biomarcador no cancro, e fluido de ascites contém células epiteliais malignas e células mesoteliais activados, que podem produzir citocinas, factores de crescimento e componentes que promovem a invasão associados a invasão e metástase [6]. Este fluido contém, por conseguinte, o secretoma de células de cancro do ovário e reflecte outros factores micro-ambientais do tumor maligno.

Assim, a aplicação da técnica de proteómica sempre avançando para a análise de ascite podem facilitar a descoberta de novos biomarcadores que são mais sensíveis e específica do que aqueles atualmente disponíveis. O objetivo do nosso estudo foi rastrear e identificar biomarcadores distintos em ascite de câncer de ovário associado com chemoresistance intrínseca por diferença de fluorescência de duas dimensões em eletroforese em gel de tecnologia (2D DIGE), que iria ajudar a identificar esses pacientes com mau prognóstico e melhorar a sua clínica resultado com terapias alternativas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Sun Yat-sen University Cancer Center Institutional Review Board. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente.

Pacientes e Preparação de Amostras

No total, 19 amostras de ascite para 2D DIGE e 28 casos de ascite para validação de ELISA foram recolhidos durante o período de fevereiro . 1 de 2009 a 31 de dezembro de 2010 a partir de pacientes EOC serosa intactas que foram submetidos a cirurgia cytoreductive satisfatório. Foram excluídas mulheres com história de câncer anterior e aqueles que receberam quimioterapia neoadjuvante. cytoreductive cirurgia foi realizada através de uma incisão na linha média abdominal. Amostras de 5 ml de ascite foram obtidas e armazenadas a 80 ° C em azoto líquido antes da histerectomia total, salpingo-ooforectomia bilateral, omentectomia e ressecção de todo o tumor volumoso visível e palpável e linfadenectomia, de acordo com as diretrizes nacionais Comprehensive Cancer Network (NCCN) . Informações sobre o tratamento ea resposta foi obtida pela revisão do prontuário.

Depois de diminuição de volume, os pacientes receberam seis ciclos de quimioterapia de combinação à base de platina. Os medicamentos de quimioterapia incluídos paclitaxel (135-175 mg /m

2), carboplatina (área sob a curva [AUC] 5-6), doxepaclitaxel (70 mg /m

2) e cisplatina (65-75 mg /m

2). Com base nas diretrizes da NCCN, intrinsecamente tumores quimiorresistentes foram definidos como aqueles com doença persistente ou recorrente no prazo de 6 meses após o início da primeira linha à base de platina quimioterapia de combinação. quimiossensíveis tumores foram classificados como aqueles com uma resposta completa à quimioterapia e um intervalo livre de platina de . 6 meses

ascite foram centrifugadas a 2000 rpm durante 15 min a 4 ° C para separar o fluido a partir de componentes celulares . A suspensão foi brevemente sonicada, e os detritos foi centrifugado a 14000 rpm durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi ressuspenso e lavado três vezes em solução de sacarose tamponada com Tris arrefecido com gelo (Tris 10 mM, sacarose 250 mM, pH 7,0) e, em seguida raspadas e lisadas em tampão de lise gelado (30 mM Tris-HCl, ureia 7 M , 2 M tioureia, 4% w /v de CHAPS, pH 8,5).

amostras ascite foram processados ​​utilizando o azul ProteoPrep albumina Depleção Kit (Sigma, St. Louis, MO, EUA), que remove selectivamente a albumina e IgG de acordo com as instruções do fabricante. Para purificar a extração de proteínas e determinar a concentração de proteína final, o 2-D Clean-up Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) e 2-D Kit Quant (GE Healthcare) foram utilizados sequencialmente.

Desenho do Estudo e marcação de proteínas da amostra com CyDye

Doze amostras chemosensitve foram divididos igualmente em dois subgrupos com seis amostras de cada, e sete amostras chemoresistance também foram divididos em dois subgrupos, com quatro ou três amostras de cada um. Quantidades iguais de proteína em amostras do mesmo subgrupo foram misturadas e separadas em quatro aliquotas iguais (50 ug cada). Duas das alíquotas de amostra de proteína quimiossensíveis foram marcadas com Cy3, e duas das alíquotas de amostra quimiorresistentes foram marcados com Cy5. As duas amostras restantes foram então quimiossensíveis marcado com Cy5 e as outras duas amostras quimiorresistentes com Cy3. Uma amostra composta de quantidades iguais de todas as amostras foi usada como padrão interno reunidas (50 ug) e marcadas com 200 pmol de Cy2. Portanto, uma piscina quimiossensíveis paciente (Cy3 ou Cy5), uma associação resistente à quimioterapia do paciente (Cy5 ou Cy3) e um padrão interno (Cy2) foram executados em cada gel, com quatro géis no total com base na nossa concepção. Esta estratégia trocando corante foi adotado para evitar viés de corante e permitiu a distribuição equitativa de corantes Cy em ambos os grupos de pacientes.

rotulagem de proteínas foi realizada com CyDye DIGE Fluors (GE Healthcare), conforme descrito no manual do usuário Ettan DIGE. Resumidamente, após a incubação em gelo durante 30 min no escuro, 1 mL de 10 mM de lisina foi adicionado para parar a reacção. proteínas para cada gel, Cy2-, Cy3- e marcada com Cy5 (50 ug cada) foram misturadas e ajustadas para 450 ul com tampão de reidratação [7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% (p /v) de CHAPS, DTT 40 mM , 1% de tampão IPG (pH 4-7), 0,002% (w /v) de azul de bromofenol].

2D DIGE

. Depois de re-hidratação, a mistura de proteína marcada para cada gel foi aplicado a uma Immobiline DryStrip (24 cm, pH 4-7; GE Healthcare). Focagem isoeléctrica (IEF) foi realizada com um aparelho de Ettan IPGphor II (GE Healthcare) como se segue: 30 V durante 12 horas, a 500 V durante 1 hora, 1000 V durante 1 hora e 10.000 V para até um total de 85.000 volts-hora . Depois de IEF, as proteínas foram reduzidas e alquiladas por sucessivos tratamentos de 15 min com tampão de equilíbrio contendo 2% (w /v), DTT, seguido por 2,5% (w /v) de iodoacetamida. As proteínas foram então resolvidos em geles a 12,5% de SDS-PAGE utilizando um instrumento Ettan DALTsix (GE Healthcare). A fim de facilitar a análise MS, uma amostra não marcada proteína piscina (500 ug) foi executado em paralelo em um gel preparativa e corado com Deep Purple total da mancha de proteína (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante.

Gel Imagem aquisição e Análise de

As imagens do gel foram adquiridos em um scanner Typhoon 9400 (Amersham Biosciences) e analisados ​​utilizando DeCyder Software (V6.0, GE Healthcare), como descrito anteriormente [7]. Os sinais Cy2, Cy3 e Cy5 foram fotografadas individualmente com comprimentos de onda de excitação /emissão de 488/520, 532/580 e 633/670 nm, respectivamente. géis preparativa (Deep Purple proteína total Stain) foram escaneados com comprimentos de onda de excitação /emissão de 532/560 nm de acordo com o manual do usuário. As proteínas em amostras de ascites quimiossensíveis foram comparados com aqueles em uns quimiorresistentes. Aumentos ou diminuições de abundância de proteínas superior a 1,5 vezes (t-teste e ANOVA,

P Art 0,01) foram consideradas mudanças significativas. Os spots de proteínas correspondentes foram selecionados no gel preparativa manchado para a colheita local.

Protein ponto Handling

Os spots de proteínas seleccionadas nos géis preparativos foram automaticamente detectados e tratados de uma Workstation Handling Ettan Mancha ( GE Healthcare). As manchas de proteínas seleccionadas foram lavados com bicarbonato de amónio 15 mM e 50% de metanol e, em seguida, digerido em 0,02 ug /mL de solução de tripsina de grau de sequenciação (Promega, Madison, WI, EUA) a 37 ° C durante 2 h. Os péptidos trípticos foram extraídas com 50% (v /v) de acetonitrilo (ACN) e 0,5% (v /v) de ácido trifluoroacético (TFA), dissolvida em 5 mg /ml de r-ciano-4-hidroxicinâmico (Amersham Bioscience) na 50% (v /v) e ACN 0,1% (v /v) de TFA e, em seguida, colocado na placa de amostra MS.

laser assistida por matriz de Dessorção /ionização de tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF /TOF MS) Análise

identificação da proteína foi realizada com o ABI 4800 Proteomics MALDI-TOF /TOF Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) no modo ião positivo reflector. massas de pico monoisotópico foram adquiridos numa variedade de 900-4,000 Da com uma relação sinal-para-ruído (S /N) 200. Tripsina autoliticas péptidos de massas 842.5 2211,1 e foram usadas como padrões internos. Cinco dos sinais de íon mais intensas foram selecionados automaticamente como precursores de aquisição MS /MS, excluindo os picos de tripsina autólise e sinais de íons matriz. A impressão digital de massa de péptido (FMP) combinado espectros MS /MS foram pesquisados ​​contra a base de dados utilizando o software de GPS NCBInr Explorador ™ (Versão 3.6, Applied Biosystems) e MASCOT versão 2.1 (Matrix Science). Os parâmetros da pesquisa foram definidos da seguinte maneira:

Homo sapiens

, a clivagem de tripsina (um perdeu clivagem permitido), carbamidomethylation como a modificação fixa, oxidação da metionina como a modificação variável, a tolerância da massa dos péptidos a 75 ppm e fragmento de tolerância fixado em 0,2 da. Uma pontuação MASCOT significativamente elevada que resultou num intervalo de confiança (IC) de 95% maior do que para PMF ou dados MS /MS para um local foi considerada como uma proteína de credibilidade identificado. Os outros critérios incluíram um mínimo de quatro peptídeos bate no PMF identificação baseada em dados e pelo menos dois péptidos com sequências distintas identificadas na análise MS /MS.

ELISA Validação

amostras Ascite (5 mL ) foram centrifugadas a 2000 rpm durante 15 min a 4 ° C para separar o fluido a partir de componentes celulares. A suspensão foi brevemente sonicada, e os detritos foi centrifugado a 14000 rpm durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi ressuspenso e armazenado a -80 ° C.

kits de ensaio de ELISA para cada um dos analitos seleccionados para posterior análise foram adquiridos a Abcam. Estes analitos foram como se segue: apolipoproteína A-IV (Apo-AIV), ceruloplasmina, haptoglobina e transtirretina. Os ensaios foram realizados seguindo as instruções do kit. Em resumo, a mudança de cor devido à reacção enzima-substrato de cada poço na placa de microtítulo foi medida espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 450 nm. A concentração de cada proteína testada na amostra foi então determinada por comparação da densidade óptica (DO) a de que a curva padrão.

teste t de Student foi realizado para comparar as diferenças entre os valores de proteína de soro. O pacote de software SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para conduzir as análises estatísticas, e uma bicaudal

valor P

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

resultados

Informações do paciente clínico

Dezenove amostras de ascite de pacientes EOC serosa foram analisados ​​utilizando 2D DIGE para rastrear biomarcadores potenciais associados com respostas diferenciadas à quimioterapia. Amostras de uma coorte separada de 28 pacientes com EOC serosa foram utilizados para validação dos resultados 2D DIGE por ELISA. Todos os pacientes tinham recebido cirurgia cytoreductive satisfatório. Não houve diferenças significativas na idade no momento do diagnóstico, a diferenciação do tumor e Federação Internacional de Ginecologia e estadiamento Obstetrícia (FIGO) entre os pacientes nos grupos quimiossensíveis e quimiorresistentes. características demográficas e clínicas dos casos são apresentados na Tabela 1.

Além disso, as taxas de sobrevivência dos 28 pacientes testados por ELISA foram comparadas de acordo com suas diferentes respostas à quimioterapia. Em março de 2012, quatro dos nove pacientes (44,4%) no grupo resistente à quimioterapia, e três de dezenove pacientes (15,8%) morreram no grupo quimio-sensibilidade. O tempo médio de sobrevivência dos nove pacientes com câncer ovariano quimiorresistentes em nosso estudo foi de 18,9 meses. No entanto, foi necessário um longo período de follow-up para determinar uma sobrevida média exata de pacientes quimiossensíveis, que foi mais de 18,9 meses. Com base no período de observação neste estudo, a diferença na sobrevivência entre os dois grupos, utilizando estimativas de Kaplan-Meier observados era significativa (

P

= 0,007), favorecendo aqueles com uma melhor resposta à quimioterapia (Fig. 1) .

Uma diferença significativa (

P

= 0,007) foi observada na sobrevivência, o que favoreceu os pacientes com tumores quimiossensíveis.

2D DIGE Análise e MS /MS identificação

de acordo com nosso projeto experimental descrito em Materiais e métodos, quatro géis 2D DIGE no total foram criados para análise proteômica de resistente à quimioterapia contra ascite quimiorresistentes paciente. Para cada um gel de imagem resultante da fusão foi gerado a partir de três imagens do quimiossensíveis, resistente à quimioterapia, e as amostras correspondentes ao padrão interno. Um gel DIGE representante mostrando a sobreposição do Cy2, Cy3 e Cy5 marcado imagens é mostrado na Figura 2.

Uma imagem 2D DIGE representante (imagem mesclada) que mostra o perfil protéico de ascite de câncer de ovário quimiossensíveis e resistente à quimioterapia pacientes marcadas com Cy5 (manchas vermelhas) e Cy3 (manchas verdes), respectivamente, com um padrão interno marcado com Cy2. tiras de IPG (24 cm, pH 4-7) foram usadas para IEF previamente a SDS-PAGE padrão (12,5% de poliacrilamida) para a segunda dimensão. A gama de peso molecular na dimensão vertical é de cerca de 150 a 10 kD. As proteínas identificadas como diferencialmente expressos são indicados com setas amarelas com números atribuídos a partir da análise DeCyder. Os números na figura correspondem aos apresentados na Tabela 2; (Inferior) Espectro de massa MALDI-TOF-MS de ponto 1543 identificado como ceruloplasmina de acordo com os picos combinados.

Um total de 1.523 a 1.711 pontos foram detectados em diferentes diferencial em gel de Análise (DIA) espaços de trabalho em todos os géis usando software DeCyder. No módulo Biológica Análise de Variância (BVA), a imagem a partir do número de gel de Cy3 quatro foi escolhido como o gel de mestre, que tinha o número máximo de pontos. Trinta e quatro manchas foram encontrados para ser expressos diferencialmente com base nos critérios de ter uma proporção média de mais do que 1,5 ou menos do que -1,5 e um teste t de Student

P

valor 0,05. Entre eles, 14 pontos foram encontrados para ser regulada para baixo nas ascite quimiorresistentes, e 27 foram regulados positivamente em comparação com os pacientes quimiossensíveis.

Alguns dos pontos diferenciais detectados pelo software DeCyder não podia ser visualizado na gel preparativa corado com coomassie coloidal provavelmente devido à baixa abundância. Após a revisão visual, foram selecionados 20 pontos de proteína com elevada abundância e expressão significativamente alterada em resistente à quimioterapia contra pacientes quimiossensíveis para análise MALDI-TOF /TOF MS. Um total de 11 proteínas expressas diferencialmente, incluindo 3-regulada e oito proteínas sub-regulada, em ascites de tumores quimiorresistentes em comparação com tumores quimiossensíveis foram identificados com sucesso. A contagem de péptidos das proteínas identificadas variaram de 4 a 33. A modificação da prega de níveis das 11 proteínas identificadas nos dois grupos, juntamente com os resultados detalhados de busca Mascot são dadas na Tabela 2.

várias proteínas foram identificadas em vários pontos. Por exemplo, po 1421, 1593, e 1598 foram cada um identificado como a proteína de transtirretina, o qual é um transporte e proteína de fase aguda, ou suas variantes. Do mesmo modo, os pontos 1614 e 1626 foram identificadas como haptoglobina, enquanto os pontos 1536 e 1543 foram determinados como sendo a ceruloplasmina e o seu fragmento proteolítico. As proteínas identificadas estão envolvidos em quatro diferentes aspectos da função celular e estão relacionados com a progressão do tumor e metástases (uma proteína do citoesqueleto, proteínas do metabolismo /lipídicas três energia, três proteínas transportadoras e quatro proteínas de fase aguda).

ELISA validação de Apo-AIV, ceruloplasmina, transtirretina e haptoglobina

Para validar os resultados da análise proteômica, determinou-se os níveis de quatro proteínas, incluindo Apo-AIV, ceruloplasmina, transtirretina e haptoglobina em amostras de ascite de 19 quimiossensíveis e 9 pacientes EOC intrinsecamente quimiorresistentes por ELISA. Com base em perfis proteômicos anteriores e considerando o nosso propósito de triagem biomarcadores únicos nas ascite, proteína do citoesqueleto (ACTB) foi excluído desta análise.

Os resultados de ELISA confirmou nossas descobertas MALDI-TOF /TOF MS em que o nível de ceruloplasmina foi significativamente maior do que em resistente à quimioterapia em ascites quimiossensíveis. A concentração média de ceruloplasmina foi 157,5 pg /ml no grupo quimiossensíveis e 192,2 ng /ml no grupo resistente à quimioterapia (

P

= 0,001), enquanto que os níveis de apo-AIV, transtiretina e haptoglobina não foram significativamente diferentes entre os dois grupos. Estes resultados estão resumidos na Tabela 3.

Discussão

O prognóstico de cancro do ovário é conhecido por ser fortemente associada com o comprimento do intervalo livre de platina a partir da primeira linha primária tratamento de combinação de quimioterapia à base de platina para a recaída. Quanto mais este intervalo dura, melhor será a taxa de resposta à quimioterapia subsequente [8]. Assim, a quimioterapia padrão é em grande parte não-benéfica para pacientes com câncer ovariano intrinsecamente quimiorresistentes (com doença persistente ou recorrente no prazo de 6 meses). A capacidade de prever a resposta à quimioterapia padrão nesses pacientes seria extremamente valiosa para permitir o uso precoce da terapêutica individualizada para ajudar a prolongar a sobrevivência e evitar efeitos colaterais desnecessários de tratamentos ineficazes.

Temos notado que muitos estágio avançado pacientes com cancro do ovário apresentam rápido crescimento dos tumores intraperitoneais, juntamente com distensão abdominal, como resultado da acumulação de fluido ascítico da cavidade peritoneal. Mecanisticamente, a formação de ascite ocorre como células malignas segregam proteínas, factores de crescimento e citocinas que causam a neovascularização, a angiogénese, o aumento da filtração de fluidos e /ou obstrução linfática, resultando na acumulação de fluido de soro como no abdómen [9], [10]. O meio rico fornece suporte para as células malignas a proliferar e mais metástase apesar da falta de substratos de matriz, permitindo que estas células para superar a apoptose associada com perda de inserção. Isto implica que as células malignas e as células mesoteliais em ascite-regulam sinais de sobrevivência, a fim de persistir no hipóxico mas meio líquido de outra forma rica [11]. Assim, ascite é uma excelente reservatório para a identificação de biomarcadores de cancro útil, especialmente em pacientes EOC [12].

Num estudo de grupo de Kislinger, ascite foram separados em fracções celulares e fluidos, seguido por análise de espectrometria de massa de cada fracção [13]. Enquanto foram identificados mais de 2500 proteínas dentro de ascite, apenas 229 proteínas foram encontrados na fracção de fluido. Após análise computacional integrada do proteoma ascite combinados com dados de proteômica do plasma humano e urina conjuntos de dados de microarrays e proteína-proteína I2D interação com o banco, foram selecionados 80 candidatos serológicos biomarcadores do cancro do ovário para posterior validação. Kuk e seus colegas também realizaram análise proteômica de fluido ascite com base em várias técnicas de separação e de fraccionamento [14]. Um total de 52 proteínas foram selecionados entre 445 proteínas específicas nas ascite fluido como bons candidatos para biomarcadores de câncer de ovário em futuras investigações. Estes autores toda a análise proteômica encontrado para ser um recurso significativo para a investigação do cancro do ovário e um quadro de descoberta de biomarcadores.

Para o nosso conhecimento, estudos proteômicos de ascite de cancro do ovário são limitados, e um estudo comparativo entre resistente à quimioterapia intrínseca e quimiossensíveis ascite cancro do ovário da tecnologia DIGE não foi previamente relatado. Os resultados do nosso estudo pode ajudar na previsão da resposta terapêutica e prognóstico da doença para pacientes com câncer ovariano. O nosso primeiro objectivo era encontrar biomarcadores exclusivos apenas no fluido de ascites e não na fracção de células como no estudo de Kislinger [13]. Assim, nós separamos a fracção de fluido de componentes celulares para 2D DIGE por centrifugação. Como biomarcadores podem estar presentes em baixas concentrações em fluidos corporais, tais como soro e ascite, um grande desafio para a realização de análises em profundidade de proteomas por espectrometria de massa é a presença de proteínas altamente abundantes, como albumina e imunoglobulinas, que constituem 65-97% de proteínas de soro [15]. Estas proteínas abundantes limitar a eficiência de ionização durante a análise MS, impedindo a identificação de proteínas de baixa abundância. Portanto, esgotando as proteínas altamente abundantes usando um 2D limpar kit era necessário antes de nossa análise, a fim de detectar os biomarcadores humildes abundantes.

Em nosso estudo, foram identificados um total de 11 proteínas diferencialmente entre quimiossensíveis e resistente à quimioterapia ascite câncer de ovário. Não foi inesperado que algumas proteínas foram identificadas em vários pontos, uma vez que muitas proteínas são conhecidas em ascite de existir como isoformas. Por exemplo, a haptoglobina e transtirretina foram representados por dois e três pontos, respectivamente, e em ambos os casos, as manchas individuais foram igualmente regulada para baixo. Além disso, a mesma proteína estar presente em vários pontos diferentes poderia ter representado biologicamente relevantes modificações ou fragmentos proteolíticas (por exemplo, ceruloplasmina).

A alteração na concentração de soro de ceruloplasmina, juntamente com muitas outras proteínas de fase aguda identificado entre o proteínas expressas diferencialmente, implicada a presença de respostas imunitárias e inflamatórias causadas o tumor. Os resultados não foram inesperados uma vez que diferentes mediadores inflamatórios, que desempenham diversos papéis, tais como indução de angiogénese, invasão e os lacetes de crescimento autócrinos e resistência à apoptose, são elevados no carcinoma do ovário [16]. Muitas proteínas de fase aguda, tais como a haptoglobina e transtirretina foram também recentemente caracterizada como biomarcadores de cancro do ovário para a detecção precoce [17]. Além disso, em um estudo de genes de perfil anterior, Bachvarov e colegas descobriram que regulada negativamente genes em tumores EOC serosas quimiossensíveis incluídos numerosos genes envolvidos no metabolismo de lípidos e de transporte, inflamação, bem como genes conhecidos para melhorar progressão tumoral e invasão [18]. Estes resultados implicado proteínas de fase aguda como candidatos a biomarcadores de interesse para uma investigação mais aprofundada.

ceruloplasmina, uma glicoproteína de plasma que transporta cobre todo o corpo, foi a única proteína confirmada por ELISA no estudo corrente a ser expresso diferencialmente no ascite entre os pacientes quimiorresistentes e quimiossensíveis neste estudo. Curiosamente, níveis séricos elevados de ceruloplasmina ter sido demonstrada em vários cancros, tais como da tiróide, da próstata e o cancro do cólon [19], e análise de microarray tem este gene ligado à invasão tumoral e metástases no cancro da mama [20]. níveis de ceruloplasmina soro alteradas após tratamento (quimioterapia ou radioterapia) têm sido observados em muitos pacientes com tumores malignos, tais como os cancros da laringe, do colo do útero e da mama. Evidentemente, uma diminuição mais significativa do nível de ceruloplasmina sérica após o tratamento está relacionada com uma melhor resposta à terapêutica, uma vez que estas alterações podem influenciar a evolução da doença [21], [22]. Estas observações anteriores apoiar a nossa constatação de que a concentração de ceruloplasmina foi significativamente menor nos fluidos de ascite de pacientes com câncer ovariano quimiossensíveis.

Funções para ceruloplasmina foram sugeridas em processos relacionados com o cancro, incluindo angiogênese e neovascularização. A proteína também serve como um marcador substituto para o cobre total do corpo. Portanto, o nível ceruloplasmina sérica menor em nosso estudo pode ser secundária à deficiência de cobre total do corpo associada à supressão do tumor. Em um estudo realizado por Cox et al., Tetratiomolibdato (TM), um quelante de cobre foi utilizado para reduzir lojas do corpo de cobre em um modelo murino de cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (SCC), criada usando a linha altamente agressivo SCC VII /SF celular [23]. Os autores descobriram que, como o cobre corporal total foi reduzida em TM, o nível de ceruloplasmina soro foi proporcionalmente reduzida, com o nível basal caindo de by28%. Foram identificados níveis tão significativamente suprimida de ambos o crescimento do tumor e vascularização SCC, os seus resultados sugerem uma eficácia potencial de TM no tratamento de cancros através dos seus efeitos sobre a angiogénese e neovascularização. Resultados similares foram observados em um estudo de fase II em pacientes com câncer avançado de rim em que os efeitos anti-tumorais de TM (diminuição da vascularização e da massa do tumor) foram associados com menor cobre sérico e os níveis de ceruloplasmina [24].

Assim , a mudança na concentração sérica de ceruloplasmina pode indicar que é uma proteína de fase aguda secretada em resposta ao stress oxidativo na inflamação associada com o tumor e /ou que é secundária à deficiência de cobre total do corpo. Nossa análise foi baseada em tumores EOC serosa primária sem histotipos mistos de tumores de ovário, ou recorrentes e tumores metastáticos. Para nosso conhecimento, esta é a primeira análise proteômica relatado por análise 2D DIGE de ascite de pacientes com resistente à quimioterapia intrínseca e câncer de ovário quimiossensíveis. Além disso, os resultados podem ajudar a prever as respostas terapêuticas e fornecer o prognóstico da doença, bem como novas pistas para o mecanismo de quimioresistência para o cancro do ovário. No entanto, existem possíveis vieses em nosso estudo. Como mencionado anteriormente, a expressão de ceruloplasmina pode estar associada com a progressão do tumor. Portanto, o alto nível de ceruloplasmina em ascite em nosso estudo pode ser causada por metástase de tumor relativamente avançada associada com pior prognóstico. Para além disso, desvios pode ser causado por componentes do soro no fluido de ascites, ou mesmo a partir de nosso exclusão das amostras de ascites misturadas com sangue devido a hemorragia do tumor.

Neste estudo, o número de pacientes foi limitado pelo comprimento de