Abstract

activação da cinase aberrante resultante da mutação, amplificação, ou translocação pode impulsionar o crescimento e sobrevivência em um subconjunto de câncer humano.

FGFR2

é amplificado na mama e câncer gástrico, e nós relatamos aqui o primeiro caracterização de

FGFR2

amplificação do gene no câncer colorretal na linha celular de cancro colorectal NCI-H716.

FGFR2

é altamente expressa e ativados nas células NCI-H716, e inibidores de pequenas moléculas FGFR seletiva ou a viabilidade celular fortemente inibida FGFR2 shRNA

in vitro

, indicando “vício” de células NCI-H716 para FGFR2. NCI-H716 crescimento num modelo de xenoenxerto também foi inibida por um inibidor de molécula pequena de FGFR. FGFR2 foi necessária para a activação das várias proteínas de sinalização a jusante, incluindo Akt, ERK, S6RP e NFKB. A inibição de quinases a jusante, tais como AKT ou de ERK sozinho teve um efeito modesto sobre a proliferação, enquanto que a inibição combinada da AKT e sinalização ERK resultou em uma perda de viabilidade semelhante à inibição FGFR2. Foram identificados elevados

expressão FGFR2

em um pequeno subconjunto de câncer colorretal primário, no entanto

não foi observado FGFR2

amplificação. Embora

FGFR2

amplificação não é comum no câncer primário de cólon ou de linfonodos e metástases hepáticas, outros subconjuntos de cancro colo-rectal, tais como ascite, a partir do qual a linha celular NCI-H716 foi derivado, têm ainda de ser testado. Estes resultados sugerem que a terapêutica de inibidor de FGFR emergente pode ter eficácia em um subconjunto de cancro do cólon impulsionado pela

FGFR2

amplificação

Citation:. Mathur A, Ware C, Davis L, Gazdar A, Pan BS , Lutterbach B (2014)

FGFR2

é amplificado na linha celular NCI-H716 câncer colorretal e é necessário para crescimento e sobrevivência. PLoS ONE 9 (6): e98515. doi: 10.1371 /journal.pone.0098515

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de fevereiro de 2014; Aceito: 02 de maio de 2014; Publicação: 26 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mathur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi suportada por Merck Research Labs. O financiador forneceu apoio sob a forma de salários para os autores (AM, CW, LD, BP, BL), mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: Autores exceto AG são funcionários da Merck Research Labs. AM, CW, LD, BP, e BL têm interesses concorrentes como empregados de Merck, mas declarar que essa filiação não altera a sua adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento. Não há restrições sobre a partilha de dados e /ou materiais.

Introdução

Avançado, o cancro colorectal fase tardia está associada com mortalidade significativa e continua a ser uma necessidade médica não atendida. Primeiros resultados do diagnóstico em um prognóstico muito favorável, de modo que a doença fase 1 e fase 2 têm uma sobrevida de 80-90% de cinco anos. Em contraste fase três e quatro fases doença metastática estão associadas com a sobrevivência de cinco anos de 60% e 8%, respectivamente [1]. aberrações genéticas que surgem em estágios iniciais da doença incluem

APC

mutações, enquanto

KRAS, BRAF, p53

, e

PIK3CA

mutações são encontradas em fases posteriores do desenvolvimento do tumor [2] – [4]. No entanto, estas mutações genéticas não têm impactado tratamento do cancro colorectal, porque eles são ou mutações de perda de função (

APC, p53

) ou não são sensíveis aos inibidores de MEK ou PI3K (

BRAF, KRAS, PIK3CA

). Embora amplificação tirosina quinase, translocação, ou mutações não são comuns em cancro colorrectal,

EGFR

amplificação pode ser encontrado num subconjunto de cancros colo-rectais, [5], [6]. anticorpos inibidores de EGFR, tais como Cetuximab pode levar a respostas e benefício de sobrevivência em

KRAS tipo selvagem

cancros, mas o papel da

EGFR

amplificação não é clara [7].

ErbB2

amplificação também tem sido relatada [6], [8], e pode ser associada a uma resposta ao trastuzumab [9].

FGFR2

amplificação foi descrito em 5% dos cancros gástricos [10] e 1-4% dos cânceres de mama [11], [12], mas não tem sido relatada em câncer de cólon. Mama e de células de câncer gástrico linhas abrigar

FGFR2

amplificação são altamente sensíveis a

FGFR2

inibidores em modelos pré-clínicos [13] – [15], e amplificação, tanto de mama e câncer gástrico é fortemente associada com pouco diferenciados, tumores fase tardia [11], [16]. No cancro gástrico

FGFR2

amplificação pode ocorrer em um tumor metastático, mas não no tumor primário associado, também consistente com um papel no cancro metastático e de fase tardia [16], [17].

aqui nós definimos um romance

FGFR2

amplificação na linha de células de cancro colo-rectal NCI-H716, que foi derivada de ascite de um adenocarcinoma de cólon pouco diferenciado.

FGFR2

resultados de amplificação do gene FGFR2 em superexpressão e ativação constitutiva. É importante ressaltar que o crescimento de células NCI-H716 e sobrevivência

in vitro

e num modelo de xenotransplante murino eram dependentes de FGFR2. Imuno-histoquímica revelou

FGFR2

superexpressão em um subconjunto de câncer de cólon primário, mas não observamos amplificação. No entanto, estas matrizes não contêm amostras derivadas de ascites representante da origem das células NCI-H716. Embora

FGFR2

amplificação e superexpressão são raros no cancro colorectal, o nosso

in vitro

e

in vivo

modelos sugerem que os inibidores de FGFR emergentes poderiam ter eficácia em um subconjunto de câncer colorretal abrigando esta amplificação.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

As linhas celulares eram da American Type Culture Collection (ATCC) e foram mantidas em RPMI mais 10% de vitelo fetal de soro e 100 ug /ml Pennicillin /estreptavidina (Sigma). PD173074 era da Sigma (St. Louis, MO). MK2461 foi da Merck [18].

análise FISH

FISH O ADN foi realizada em células NCI-H716 tratadas com colcemida (0,02 ug /ml, durante 3 horas) e em núcleos de microsséries de tecido como descrito anteriormente [19], [20] usando bacteriana clones de cromossomos artificiais RP11-62L18 para

FGFR2

sondas. Esta sonda de peixe contém a sequência genómica de Chr10: 123,224,100-123,398,498, que abrange a totalidade do gene FGFR2 em Chr10: 123,237,844-123,353,481. As sondas foram marcadas directamente utilizando Spectrum Laranja dUTP e Spectrum Verde dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL).

Imunohistoquímica

H80 anticorpo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi usado a uma diluição de 1:50 em NCI-H716 e secções de xenoenxerto de cancro gástrico Asterand e a uma diluição de 1:20 em núcleos de matriz de US Biomax Inc. (Rockville, MD): CO802 (78 tumores primários, dois normais), CO702 ( 69 amostras-30 tumores primários, 25 gânglios linfáticos, 8 metástases hepáticas, 9 normal), CO992 (33 tumores primários e 33 metástases linfáticas), BCO5115 (total de 69, 60 tumores primários, 7 metástases hepáticas), nestas matrizes, 20 pacientes tinham menos de 35 anos de idade. A coloração foi realizada em um Ventana Descoberta XT utilizando ultra-coelho HRP. A detecção foi com kit ChromoMap (Ventana Molecular sistemas de descoberta, Tucson, AZ)

produção e infecção shRNA

sequências shRNA foram:.

F1: GCCAACCTCTCGAACAGTATTCAAGAGATACTGTTCGAGAGGTTGGC,

F2: GGACTTGGTGTCATGCACCTTCAAGAGAGGTGCATGACACCAAGTCC

F3: GGACTGTAGACAGTGAAACTTCAAGAGAGTTTCACTGTCTACAGTCC

F4: GAGATTGAGGTTCTCTATATTCAAGAGATATAGAGAACCTCAATCTC

luciferase: CACCGGTGTTGTAACAATATCGACGAATCGATATTGTTACAACACC

AAA. Mexidos: CACCGTCTCCACGCGCAGTACATTTCGAAAAATGTACTGCGCGTG

GAGACAAAA Oligos foram emparelhados e 5’BbsI e 3 ‘Spel usado para clonar em um plasmídeo ENTR proprietária seguido de conversão para Plenti6 /Bloco-IT-DEST (Invitrogen, Grand Island NY) usando Gateway ( Invitrogen, Grand Island NY). A produção de vírus e determinação do título foram conforme indicado pela Invitrogen. Para a análise do crescimento, as células foram semeadas a 4000 células /poço em placas de 96 poços, enquanto que para análise de Western células foram semeadas a 40000 células em placas de 12 poços. Os sobrenadantes virais foram adicionados durante 20 horas na presença de 8 ug /ml de polibreno, em que os sobrenadantes virais pontuais foram removidos e substituídos com meio de crescimento contendo soro fetal bovino a 10%. Os lisados ​​foram preparados para análise de Western 48 horas mais tarde.

ensaios de tratamento com composto e de crescimento

PD173074 (Sigma, St Louis MO) e MK2461 foram diluídas em DMSO para criar uma série de titulação como descrito anteriormente [ ,,,0],14]. Gleevec, Lapatinib, PHS665753 e PD168393 eram de ChemieTek (Indianapolis IN) Anti IGF1R anticorpo AF305 era de sistemas R /D. As células foram tratadas em poços em triplicado, e depois de 3 dias o número de células foram quantificados usando o reagente de Vialight (kit de ensaio Vialight, Cambrex, Rockland ME). A luminescência foi quantificada com um Topcount NXT HTS (Perkin Elmer, Waltham, MA) e as determinações de IC50 feitas usando curva logística de 4 parâmetros de ajuste. Para quantificação de fosfotirosina em FGFR2 e blots foram digitalizados e quantificados usando software ImageQuant. Os valores correspondentes para a banda de intensidade foram representadas graficamente contra a concentração do fármaco para estabelecer um valor de IC50 de inibição de droga. ScanMAX perfis de 442 cinases estava em Âmbito Biosciences (San Diego, CA).

Factores

Western blotting, imunoprecipitação, anticorpos, e crescimento

Os lisados ​​foram preparados em 30 mmol /L Tris-HCl, pH 7,5, 50 mmole /L de NaCl, 5 mmol /L de EDTA, 50 mmol /L, NaF, 30 mmol /L NAPPI, 1% Triton, 0,5% de IGEPAL, 10% de glicerol, 1 mmol /L de vanadato, 1 mmol /L bpPhen (Calbiochem), e inibidor de protease (Roche) e transferência de western e a imunoprecipitação foram como descrito [21], [22]. Os anticorpos contra FGFR2 incluídos terminal N MAB6841 (R D Systems, Minneapolis, MN) e H80 (Santa Cruz), C-terminal, C-20 (Santa Cruz) e Y653 /654 específica 3471 ((Cell Signaling Technology, (CST) , Danvers MA.)). anticorpos adicionais de CST foram: pAKT S473 (4060), AKT (9272), vantagens (4370), ERK (9102), pS6RP S235 /236 (2217), S6RP (2211), PARP clivada (9542), beta actina (4967 ), p105 NFKB S933, NFKB P105, Gab1 Y672, FRS2 Y436, SHC Y317 CRKII Y221, PRAS40 T246, PDK1 S241, GSKIII S9, PKC S660, RSK S227 (local PDK1), S359 /363 (local de ERK RSK), T172 AMPK (local LKB) e GAPDH. anticorpo antifosfotirosina 4G10 era da Upstate (, Charlottesville, VA). FGF2 recombinante era de R . D Systems (Minneapolis MN)

A citometria de fluxo

A Becton Dickinson FACS Calibur foi utilizada para citometria de fluxo em células NCI-H716. As células foram fixadas durante a noite em 1 ml de gelo etanol frio a 70% e depois lavadas em PBS e coradas com PI /ARNase (BD Pharmingen, San Diego) durante 3 horas. software ModFit foi utilizado para determinar a distribuição relativa no G1, S, G2 /M, e gating manual para determinar o conteúdo subG1.

Xenoenxerto

Os estudos em animais foram realizados de acordo com IACUC (Institutional Animal Care e Use Committee) diretrizes e experiências foram aprovadas pela Merck laboratórios de pesquisa ética comissão de revisão. monitoramento e gravação de bem-estar dos ratos sistemática foi de acordo com a chegar diretrizes para a aparência, tamanho, condição de pelagem, postura, marcha, níveis de atividade, a interação com o meio ambiente e os sinais clínicos. A eutanásia foi coducted por expor de animais de CO

2 até se observar a cessação completa da respiração durante um período mínimo de 2 minutos (um total de aproximadamente 5 a 10 minutos). Os animais foram inspeccionados visualmente para a ausência de movimento e respiração. A morte também foi assegurada por remoção de tecido de tumor ou vários órgãos.

5 × 10

6 células NCI-H716 foram implantados subcutaneamente em ratinhos nus BALB /c. Depois de atingir 200 mm

3, os tumores foram tratados com veículo, de 300 mg /kg ou 800 mg /kg, uma vez por dia durante 24 dias. 10 ratinhos foram em cada grupo, e o tamanho do tumor foi determinado por medição de compasso de calibre. Nenhum animal experimentou maior do que 5% de perda de peso durante os tratamentos. FGFR2, AKT e ERK inibição

in vivo

foi medido por dosagem animais e tumores coleta em 4 e 24 horas após o tratamento. Os tumores foram colocados em azoto líquido e transformadas por ruptura em 600 ul de tampão de lise num tecido Lyzer (Qiagen). Os lisados ​​foram quantificados e processados ​​para SDS-PAGE e western blot como descrito para lisados ​​celulares.

Resultados

FGFR2

é amplificado, e ativados nas células NCI-H716

Como

FGFR2

amplificação pode impulsionar o crescimento de células de estômago e câncer de mama, buscamos linhas celulares adicionais que abrigam semelhante

FGFR2

ganho de copiar. microarrays de DNA confirmaram conhecido

FGFR2

amplificação na KATOIII e SNU16 linhas celulares de cancro gástrico [23], [24] e identificou uma nova amplificação altamente focal na linha colorectal NCI-H716 célula cancerosa (Figura S1A em S1 Arquivo. o banco de dados Oncomine [25] também revelou alta

FGFR2

expressão do RNA messager em células NCI-H716. fluorescente de hibridização in situ (FISH) revelou impressionante

FGFR2

copiar ganho e duplicação de genes em regiões coloração homogeneamente (Figura 1A). a sonda centrômero verde não revelou ganho de cópia, de acordo com o amplicon altamente focal no

FGFR2

loco (Figura S1A em S1 Arquivo). a sonda FISH para

Met

revelou nenhum ganho cópia no NCI-H716 neste cromossoma 7 lócus, eo ganho

FGFR2

sonda não apresentam amplificação em células cancerígenas do cólon DLD1 falta

FGFR2

copiar (dados não mostrados). Nós em seguida, em comparação

FGFR2

expressão e ativação em células NCI-H716 em relação a um painel de nove linhas celulares de cancro colorectal, sem

FGFR2

amplificação, e encontramos impressionante FGFR2 superexpressão e fosforilação apenas em NCI-H716 células (Figura 1B). FGF2 não activar mais FGFR2 em células NCI-H716, revelando que o receptor é maximamente fosforilada (dados não mostrados). O nível de ativação FGFR2 em células NCI-H716 foi semelhante aos níveis observados no

FGFR2

amplificado SNU16 linha de células de câncer gástrico (Figura S2 em S1 Arquivo). Concluímos que, em nosso painel de linhas celulares de cancro do cólon que

FGFR2

é altamente overexpressed e ativado apenas em células NCI-H716.

A. as células NCI-H716 foram tratados com colcemida (0,02 ug /ml durante 3 horas), fixadas com metanol /ácido acético, e cair sobre uma lâmina de microscópio, de acordo com os materiais e métodos. Bacteriano RP11-62L18 clone de cromossoma artificial foi rotulado com alaranjada Espectro de dUTP e uma sonda centromérica foi marcado com verde Espectro de dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) e hibridadas com células fixadas. O vermelho indica

FGFR2

e verde indica Centromere. B. FGFR2 é sobre-expressa e contém elevados níveis de fosforilação de tirosina na linha celular NCI-H716. A, os lisados ​​celulares (preparados de acordo com a Materiais e Métodos) a partir de não tratada ou tratada de FGF2 (30 ng /ml, 5 minutos), as células foram lisadas e a concentração de proteína foi determinada com o kit BCA (Pierce Rockford III Thermo Fisher). quantidades iguais de lisados ​​(50 ug) foram submetidos a SDS-PAGE e western blot com anticorpos FGFR2 feitas contra o terminal N (H80. MAB6841), C terminal (C20) e ativação de loop fosforilação Y653 /654 (3471, p-FGFR2) e actina.

FGFR2 é necessário para o crescimento de células NCI-H716

pode ser necessária FGFR2

amplificação e ativação em células NCI-H716 sugeridas esta quinase para celular crescimento. Foram tratados células NCI-H716 com dois inibidores de molécula pequena de FGFR para testar um papel para FGFR2 no crescimento celular NCI-H716. Em um grande painel de kinses, encontramos PD173074 ser um inibidor altamente selectivo de FGFR-1, -2, -3 [14], e que confirmaram ainda a selectividade notável aqui com um grande painel de quinases separados (Figura S3 no ficheiro S1). Também células tratadas com MK2461, um inibidor de cinase Met pequena molécula que também inibe a fosforilação e FGFR2 crescimento de

FGFR2

linhas de células gástricas e cancro da mama [13] amplificado. PD173074 e MK2461 fosforilação FGFR2 potentemente inibida em células NCI-H716 (figura 2A) com uma IC50 de 18 nM (PD173074) e 165 nM (MK2461, Figura S4A no ficheiro S1). Ambos os compostos inibiu potencialmente o crescimento NCI-H716 com valores de IC50 de 25 nM para o PD173074 e 130 nM para o MK2461 (Figura 2B). Importante, a IC50 para a inibição do crescimento e a inibição de fosforilação FGFR2 foram semelhantes, e ambos os valores também foram semelhantes aos valores anteriormente obtidos para SNU16 e KATOIII linhas de células [13], [14]. Tendo observado inibição potente do crescimento celular NCI-H716, que ambos os compostos testados próxima para a inibição de um painel de linhas celulares de cancro do cólon. Ambos os compostos inibidores de FGFR exibida uma selectividade surpreendente para a inibição de células NCI-H716, com mais do que 80 vezes (MK2461) ou 400 vezes (PD173074) inferior de IC50 em relação ao não-

FGFR2

amplificados linhas de células do cólon ( Figura 2C). O inibidor de FGFR AZD4547 também inibiu selectivamente o crescimento em células NCI-H716 (dados não mostrados). Por fim, o crescimento NCI-H716 não foi inibida por tratamento com inibidor da quinase compostos faltando inibição FGFR, incluindo Tarceva, lapatinib, Gleevec, PHA665752 (um inibidor da Met) PD168393 (um inibidor de EGFR irreversível) e um anticorpo inibidor do IGF1R (Figura S4B no ficheiro S1 ).

A. PD173074 e MK2461 inibir a fosforilação FGFR2. As células foram tratadas durante 1 hora com uma titulação de PD173074, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os lisados ​​foram preparados e proteína de 50 ug foi submetida a SDS-PAGE e Western blotting com fosfo Y653 /654 FGFR e MAB6841 anticorpo total de FGFR2. B. PD173074 e MK2461 inibir o crescimento celular NCI-H716. As linhas de células foram colocadas em placas a 4000 células /poço e incubadas durante a noite. as células NCI-H716 foram tratados com uma titulação de PD173074, tal como descrito em Materiais e Métodos. O crescimento celular foi medida com o reagente Vialight, e o crescimento foi apresentada em relação às células não tratadas. C. PD173074 e MK2461 inibir selectivamente o crescimento de células NCI-H716. linhas celulares de cancro do cólon listadas foram colocadas em placas a 4000 células /poço e 24 horas depois foram tratadas com uma titulação de compostos. 4 dias mais tarde, o crescimento celular foi medida com vialight e IC50 foram calculados a partir do prisma Graph Pad. D.

FGFR2

shRNA diminui proteína FGFR2 em células NCI-H716.

FGFR2

shRNA foi preparado e as células NCI-H716 foram infectadas tal como descrito nos métodos. Esquerda, expressão FGFR2 foi analisada com fosfo Y653 /654 e proteína total com MAB6841. E. O crescimento foi analisada 5 dias após a infecção com o reagente Vialight.

Nós confirmou ainda um papel crítico para FGFR2 no crescimento celular NCI-H716 utilizando

FGFR2

shRNA. Nós identificado pela primeira vez dois grampos (F2 e F4, Figura 2D) com eficiente

FGFR2

knockdown. Estes grampos shRNA causou inibição do crescimento potente em células NCI-H716 (Figura 2E). Em contraste, o controle e shRNA shRNA que não diminuiu os níveis de proteína FGFR2 (V e F1) não inibiu o crescimento de células NCI-H716 (Figura 2D, E).

Várias proteínas de sinalização, incluindo Akt, ERK e NFKB são ativados por FGFR2

Nós relatado anteriormente que

FGFR2

activado AKT e ERK vias de sinalização em FGFR2 amplificado linhas celulares de cancro gástrico [14]. Por conseguinte, a rede de sinalização definido FGFR2 em células NCI-H716 através da análise da fosforilação de várias proteínas adaptadoras e vias de sinalização depois de inibição FGFR2. Depois de duas horas de tratamento com uma titulação de MK2461 e PD173074 observou-se perda de fosforilação de proteínas adaptadoras quinase Gab1 /2, FRS1 /2 e SHC. Também se observou perda de ERK e fosforilação de AKT (Figura 3A). Curiosamente, os alvos a jusante de Akt e ERK tal como PRAS40 e S235 /236 em S6RP (S9 e em GSKIII, dados não mostrados) manteve-se fosforilada na presente 2 horas em pontos de tempo. Nós próxima anlayzed inibição de alvos AKT e ERK em momentos posteriores após o tratamento com 100 nM PD173074. Também examinamos várias outras vias para determinar se a cinética atraso de inibição foi ocorrendo também. Em contraste com o ponto de tempo de 2 horas, tanto S6RP e fosforilação PRAS40 foram fortemente inibidos 12 horas após a adição do composto (Figura 3B). Encontramos também uma inibição atraso similar de serina-933 fosforilação em p105 NFKB, sugerindo que a sinalização de NFkB é parte do crescimento NCI-H716 (Figura 3B). P50 NFKB e os níveis de proteína P105 foram diminuiu apenas em 72 horas. Enquanto que a inibição de 12 horas após o tratamento podem resultar de uma semi-vida prolongada das proteínas de sinalização, a inibição em pontos de tempo mais tardios, tais como de 72 horas pode ser secundária à inibição do crescimento (e morte celular, como descrito abaixo na Figura 4). CRKII Y221, AMPK T172, e PDK1 S241 foram inibidas apenas com 48-72 horas pós tratamento, sugerindo novamente que a perda desses sites pode ser secundária à inibição do crescimento. CRKII, os níveis de proteína AMPK, PDK e não diminuiu durante o decurso do tempo (dados não mostrados). Finalmente, outros sites como o GSKIII S9 (um sítio de fosforilação de AKT), PKC S660, S227 RSK (um local de fosforilação PDK1) manteve-se fosforilada, mesmo depois de 72 horas (Figura 3B). Este resultado revela que PDK1 permanece activa e capaz de fosforilar locais alvo apesar da inibição do crescimento celular. Embora o local de fosforilação de RSK em S227 PDK1 não foi inibido, o local de fosforilação de ERK serina-359 /363was inibida dentro de 2 horas de tratamento PD173074 (Figura S5 no ficheiro S1). GSKSIII Serina-9 também permaneceu fosforilada em pontos de tempo posteriores, e que pode ser possível que outras cinases AKT Além de manter a fosforilação neste local. Por fim, porque a inibição de MEK impactado crescimento NCI-H716, que ainda definida a rede de sinalização MEK usando 100 nM do inibidor alostérico MEK PD0325901 [26]. Serina-933 em NFKB p105 e serina-265 em FRA1 são descritos como locais de fosforilação ERK e confirmada perda desses sites. Serina-235/236 em S6RP é também um alvo de MEK em células NCI-H716 (Figura 3C). Conclui-se que a inibição FGFR2 resultou num padrão bifásico da inibição da via, com ERK e AKT inibida em pontos de tempo iniciais, enquanto PRAS40, S6RP, e factores de transcrição tais como NFKB P105 mostrou uma inibição retardada. Outras proteínas de sinalização, tais como as isoformas de PKC PDK1 e manteve-se fosforilada, mesmo em pontos de tempo posteriores. No entanto, continua a ser possível que, apesar de fosforilação de proteínas, tais como isoformas de PKC pode ser inativo devido a outros fatores, como mislocalization celular. Em geral estes resultados advertem que a análise de uma rede de sinalização somente em instantes iniciais após o tratamento inibidor pode não definir completamente a gama de effectors de sinalização.

A. Os lisados ​​utilizado na Fig. 2A foram analisadas por western blotting de proteínas fosforiladas ou totais após um tratamento de 2 horas com indicada composto de titulação. “P” indica fosfoproteína, e os sítios de fosforilação são listados em Métodos. Naturalmente B. Tempo de inibição para múltiplas proteínas de sinalização. as células NCI-H716 foram tratados com 100 nM PD173074 durante os tempos indicados e as vias de sinalização foram analisadas por SDS-PAGE e Western blotting. 100 nM PD173074 foi seleccionada porque esta quantidade causou a inibição completa de pERK no ponto de tempo de 2 horas. “P” indica fosfoproteína, e os sítios de fosforilação são listados em Métodos. Terminologia no lado direito de proteínas grupos figura de acordo com o momento em que a inibição ou proteína perda ocorra. células C. NCI-H716 foram tratados com 100 nM PD0325901 durante o tempo indicado. Os lisados ​​foram preparados para SDS-PAGE e Western blotting com os anticorpos indicados. D. células NCI-H716 plaqueadas a 4000 células /poço foram tratadas 24 horas mais tarde com 1 uM de L-547 (Akti), 100 nM PD0325901 (Meki), 5 nM de Rapamicina (rapamicina), 100 nM de PD173074, ou 1,5 uM de MK2461, ou a combinações indicadas. Após 5 dias composto e meios foram removidos e substituídos com o composto fresco e mídia. Após um adicional de 5 dias o crescimento celular relativa (total de ensaio 10 dias) foi determinada usando o reagente Vialight.

A. Os lisados ​​da Figura 3B revelam um aumento de clivagem de PARP. Phospho S6RP é incluído como referência e GAPDH foi usada como um controlo de carga. B. perfil do ciclo celular das células tratadas. 1 × 10exp6 células NCI-H716 foram tratados com 100 nM de PD173074, inibidor de MEK (100 nM) ou MEK + AKT inibidor (G-547, 1 uM) ou DMSO (não tratada) foram isolados nos pontos de tempo indicados e processados ​​para iodeto de propídio coloração e análise de FACS como descrito em Materiais e métodos. B. indica uma representação tabular de perfis do ciclo celular como determinado por gating manual para G1, S, G2 /M e subG1 áreas. C é o perfil do ciclo celular.

inibição combinada de AKT e ERK é necessária para inibir totalmente NCI-H716 crescimento

Nas células NCI-H716 ERK, AKT e S6RP fosforilação requer FGFR2 , e nós próxima utilizado inibidores alostéricos seletivos da MEK, AKT e mTOR para definir o papel destas vias no crescimento NCI-H716. Embora MEK PD0325901 inibidor de crescimento diminuiu NCI-H716 com uma IC50 de 60 nM 14 +/-, um curso de tempo indicado que as células NCI-H716 manteve-se em crescimento progressivo (Figura 3D, linha turquesa). Nós descobrimos que 1 uM inibidor AKT L-547 ou 5 nM rapamicina isoladamente ou em combinação teve apenas efeitos mínimos sobre o crescimento, apesar da forte inibição da AKT e S6RP fosforilação (Figura S6 no arquivo S1). Por outro lado, uma combinação de inibidor de AKT e MEK inibidor bloqueou o crescimento e provocou uma diminuição no número de células semelhantes a FGFR inibição (Figura 3D). Portanto, tanto a AKT e ERK são efectores críticos de FGFR2 em células NCI-H716. Por outro lado, uma combinação de inibição de MEK e rapamicina não foi superior à inibição de MEK sozinho. Isto é consistente com os nossos resultados bioquímicos (Figura 3C), que está a jusante da S6RP MEK nesta linha de células, de modo que a inibição de ERK já conduz à inibição da S6RP. Além disso, a falta de um fenótipo com rapamicina sugere que vários efectores de ERK deve ser inibido em combinação para imitar a inibição do crescimento observada com o inibidor de MEK.

A apoptose é o mecanismo para inibição de crescimento

o número de células de partida foi reduzida nas células tratadas com PD173074 e com a combinação de AKT e inibidor de MEK, sugerindo que estes inibidores causou a morte celular. PARP clivada, um marcador de apoptose, foi fortemente induzida após tratamento com PD173074 (Figura 4A) e com MK2461 (não mostrado). A citometria de fluxo e o conteúdo do ciclo celular revelaram a paragem do crescimento após 24 horas de tratamento com inibidores de FGFR ou combinações de inibidores de MEK /AKT como visto na perda de população fase S (Figura 4B, C) durante 48 horas e pontos de tempo mais tardios da paragem do crescimento foi seguido por indução de uma população de destaque subG1. Na verdade a 4 dias após o tratamento da fracção subG1 representada metade da população de células. Por outro lado, a inibição de MEK diminuição das células na fase S após 24 horas, mas não eliminou as células em fase S em pontos de tempo posteriores nem causou morte celular semelhante proeminente (Figura 4B, C). Finalmente, as imagens das células NCI-H716 revela fragmentação celular generalizada após 72 horas de tratamento com PD173074 ou 1 uM de MK2461, consistente com a morte celular (Figura S7 no ficheiro S1). Estes resultados revelam que a sobrevivência das células NCI-H716 é dependente de FGFR2, e também o apoio evidência anterior que tanto AKT e ERK actividade são necessárias para a sobrevivência.

FGFR2 é necessário para o crescimento do tumor xenoenxerto NCI-H716

Potent sensibilidade NCI-H716 para FGFR inibidores

in vitro

sugeriu que o crescimento do tumor xenoenxerto também pode ser inibida

in vivo

. NCI-H716 foi derivado de uma ascite, e consistente com a adaptação a este ambiente, a linha de células prolifera solto em suspensão. Portanto, uma tentativa para criar um modelo de ascites utilizando células que expressam a luciferase NCI-H716 injectados na cavidade peritoneal. No entanto imagiologia de luciferase revelou uma falta de expansão de células tumorais (dados não apresentados). Por isso, para determinar a inibição do crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto subcutâneo padrão. Porque PD173074 tem propriedades farmacocinéticas pobres, nós ratinhos tratados com MK2461. Quando os tumores atingiram 200 mm

3 em tamanho, MK2461 foi doseado uma vez por dia (QD) em cada 300 ou 800 mg /kg. Durante o estudo de 21 dias, a 800 mg /kg de tratamento causou a inibição completa do crescimento do tumor, enquanto que 300 mg /kg resultou em inibição parcial, que não era estatisticamente significativa (Figura 5A). Nem a dose resultou na perda de peso corporal superior a 5% (dados não mostrados). Ambas as doses altas e baixas de MK2461 causou a inibição completa de FGFR2, ERK, e fosforilação de AKT em tumores de 2 horas após a dosagem (Figura 5B). No entanto, às 23 horas após a administração, somente a dose de 800 mg /kg apresentaram uma inibição significativa de FGFR2 e ERK fosforilação. A incapacidade de a dose de 300 mg /kg para causar inibição contínua de sinalização de ERK FGFR2 e pode explicar a falta de eficácia associado. Apesar de 800 mg /kg, causou a inibição completa de crescimento, não se observou qualquer PARP clivada

In vivo

, em contraste com

In vitro

tratamento com MK2461 (dados não mostrados). A falta de PARP clivada

In vivo

também é consistente com a ausência de regressão no modelo de xenoenxerto, e pode resultar de uma falta de inibição potente da fosforilação de AKT. Por exemplo, quando apenas ERK foi robustamente inibida

in vitro

(com PD0325901 inibidor MEK), houve diminuição do crescimento, mas não morte celular. Portanto, a falta de inibição de AKT potente pode explicar por regressão não foi observado no modelo de xenoenxerto. A razão para a falta de AKT inibição

in vivo

não é clara, mas poderia potencialmente resultar da ativação da via compensatória por fatores de crescimento murinos endógenos ou citocinas que não estão presentes em meios de cultura de tecidos.

A. 5 × 10exp6 células NCI-H716 foram implantados subcutaneamente em ratinhos Balb /c nus e tratados com MK2461 em cada 300 mg /kg ou 800 mg /kg num horário de dosagem QD. crescimento relativo do tumor é indicado no eixo Y. B. ratinhos portadores de tumores foram tratados com uma dose única de MK2461 em cada 300 mg /kg ou 800 mg /kg. Os tumores foram isolados a 4 ou 24 horas após o tratamento, e colocado em azoto líquido. Os tumores foram processados ​​utilizando o tecido Lyzer (Qiagen) tal como descrito em materiais e métodos e analisadas por SDS-PAGE e Western blotting com a fosfo indicado e anticorpos totais.

superexpressão FGFR2, mas não é encontrado em amplificação um subconjunto de câncer de cólon primário e metástases linfáticas

Nós definimos a prevalência de FGFR2 superexpressão e amplificação no câncer de cólon primário, utilizando imuno-histoquímica (IHQ) para a expressão FGFR2 e FISH para

FGFR2

amplificação. Porque não há precedente para seletiva

FGFR2

amplificação em uma metástase, mas não no tumor primário também analisadas as metástases do fígado 15 e 58 nódulos linfáticos junto com seus tumores primários associados. Como os anticorpos C-terminal anteriormente descritos não detectar as isoformas FGFR2 em células NCI-H716 por Western blotting ou IHC (dados não mostrados), que otimizada coloração IHC com o anticorpo H80 N-terminal. Confirmámos a reactividade IHC forte no xenoenxerto NCI-H716 e com um

FGFR2

tumor câncer gástrico amplificado (Figura 6). Figura S1.