Abstract

O processo de transformação celular envolve uma cascata de alterações moleculares que são moduladas através epigenética alteradas, transcrição, pós-translacional e redes reguladoras de proteínas. Assim, a identificação de alterações de proteínas associadas à transformação pode fornecer uma visão sobre as principais vias regulatórias ativadas durante a progressão da doença. Na abordagem de expressão da proteína de perfis presente, foram identificados conjuntos diferencial de proteínas em uma tela de electroforese em gel bidimensional de um modelo de progressão adenocarcinoma de ovário seroso. categorização baseado em função das proteínas exclusivamente associada com as células pré-transformado identificados quatro processos celulares, dos quais o RXR-γ é conhecida por modular a diferenciação celular e apoptose. Temos, assim sondado a relevância funcional de expressão RXR-γ e sinalização nestes dois percursos durante a progressão tumoral. expressão de RXR-γ foi observada para modular a diferenciação celular e a apoptose em células pré-transformadas de estado estacionário. Curiosamente, o tratamento retinóide foi encontrada para melhorar a expressão de RXR-γ em células transformadas e sensibilizar os para apoptose

In vitro

, e também reduzir o crescimento de xenoenxertos de derivados a partir de células transformadas. Os nossos achados enfatizam que a perda de níveis de RXR-y parece fornecer vantagens mecânicas para células transformadas para a aquisição de resistência a apoptose indicação de cancro, enquanto que o tratamento eficaz retinóide pode apresentar uma abordagem viável no sentido de sensibilização de células tumorais à apoptose através da indução de RXR- γ expressão

Citation:. Kalra RS, Bapat SA (2013) expressão Proteomics Prevê Perda de RXR-γ durante a progressão da epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 8 (8): e70398. doi: 10.1371 /journal.pone.0070398

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de fevereiro de 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 06 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kalra, Bapat. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia, Nova Deli para ORS [Grant não. BT /PR7186 /MED /14/965/2006]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

uma visão contemporânea de tumorigênese é que os resultados da transformação como um processo de várias etapas que envolvem mudanças genética, epigenética, celular e tecidual associados [1], [2], [3]. Estas alterações sentido em várias redes reguladoras e funcionais dentro da célula que levam a uma aquisição progressiva de capacidades de auto-suficiência em sinais de crescimento, insensibilidade aos sinais anti-crescimento, potencial replicativo ilimitado, evasão de sinais apoptóticos, a invasão de tecidos e metástases, e angiogénese sustentada [4]. Mais recentemente, a reprogramação metabolismo energético e evadir destruição imunológico receberam reconhecimento como características adicionais de transformação [5].

epitelial do ovário (EOC) é reconhecido como o quinto câncer mais comum ea maior causa de câncer relacionado mortes entre mulher [6], [7]. Uma limitação em estudos EOC é a falta de identificação de lesões pré-neoplásicas que levam a metástases rápida e agressiva, fase em que a doença é mais frequentemente diagnosticado. Isto é feito ainda mais complexo de recentes descobertas que sugerem EOC-alto grau de origem no epitélio das trompas de Falópio, em contraste com a opinião clássica dos epitélios da superfície do ovário sendo a célula de origem [8], [9]. Embora proteoma contemporânea análises fornecem uma fonte dinâmica e eficiente de identificação de supressores de tumor, oncogenes, diagnósticos de câncer e terapêutica [10], [11], [12], [13], uma compreensão ampliada do multi-passo eventos de transformação em EOC vis-a-vis expressões moleculares alterados entre transformada e células pré-transformado continua a ser resolvido

.

O presente estudo é baseado em perfis de proteômica de um

in vitro

modelo de adenocarcinoma de ovário seroso ( SeOvCa) estabelecido anteriormente em nosso laboratório [14]. Portanto, nós tinha estabelecido várias culturas derivadas de clones de uma única célula de ascite maligna de uma Grau IV serosa paciente adenocarcinoma de ovário. Dezenove delas foram submetidos a imortalização espontânea e foram estabelecidas como linhas contínuas. O clone A4 era um destes clones. Em suas passagens iniciais, foi visto como sendo lenta ciclismo e não tumorigénica; no entanto, em torno de passagem 20-25 transformou em um clone de forma agressiva tumorigênico com capacidades metastáticos. Estes dados sugerem que as células A4 primeiros, apesar de faltar tumorigenecity tinha já adquirido algumas das características de transformação. Daí que se refere a estes como sendo pré-transformado (A4-P), enquanto as células transformadas derivadas de células A4-P foram denominados como A4-T. Isto proporcionou um modelo nos progressão apropriada de dois grupos celulares funcionalmente distintos derivados de um único clone em que o tumor. perfis proteoma de este modelo progressão A4 resolvidos através de 2 Dimension Gel Eletroforese (2DE) seguido por MS (MALDI-TOF /TOF) levou à derivação de grupos de proteínas específicas com base em seus padrões de expressão exclusivos e diferenciais.

caracterização das redes funcionais definidas por essas proteínas forneceu uma visão clara funcionalidade celular alterado e principais vias envolvidas na transformação de células de ovário. Destes, RXR-γ modulado diferenciação celular e apoptose foram exclusivos para as células pré-transformado. A modulação do metabolismo do retinol foi sugerido em associação com a progressão de EOC [15], [16] em que a diminuição dos níveis de CRBP1 (celular proteína-1 de ligação ao retinol) são considerados um passo crucial na progressão do processo de transformação [17]. No entanto, a relevância precisa de sinalização RXR-γ permanece largamente não caracterizados. Nós resolvido o seu papel funcional nas células transformadas do nosso modelo de progressão através da indução da expressão, por tratamento com retinóides selectivos, incluindo 9

ácido cis-retinóico

(PCR), Adapalane (ADA) e 4 – [(E) – 2- (5,6,7,8-tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) -1-propenil] benzóico (TTNPB). Essa modulação de diferenciação celular e apoptose por RXR-γ em SeOvCa amplia ainda mais nossa compreensão atual da transformação celular.

Resultados

análise de expressão de proteína comparativo de A4-P e A4-T câncer epitelial de ovário modelo progressão

as células cancerosas funcionalmente diferentes A4-A4-P e T epiteliais do ovário exibem um fenótipo distinto, com o primeiro sendo enquanto o último aparecer epitelial, como em morfologia fusiforme (Fig. 1A). 2-DE géis foram preparados utilizando amostras proteoma de células A4-P e A4-T. Dois conjuntos de técnicas de 2-DE géis analíticos foram preparados a partir de cada um fenótipo em cada experiência, que foi realizada em triplicado (total de 6 repetições) e corado com prata. As imagens digitalizadas foram processadas utilizando PDQuest e proteínas com expressão diferencial foram anotados. Uma média, 400-500 spots de proteínas diferenciais foram assim demarcadas. Anotação de manchas levou à derivação dos conjuntos de proteínas com base nos seus padrões de expressão em cada tipo de célula. Para a identificação da expressão diferencial de proteínas, manchas de proteínas seleccionadas foram digeridos e espectros de massa foi gerado no MS /MS análises. software GPS Explorer (v.3.6) foi usado para enviar os dados do MS e MS /MS combinados de MALDI-TOF /TOF para Mascot contra o banco de dados SwissProt. Para todas as proteínas, assim, analisados, cobertura sequência razoável, baixo índice de erros em massa e intervalo de confiança elevado (CI ≥95%) foram obtidos.

A. diferenças morfológicas entre as células A4 pré-transformados (A4-P) e A4 transformados (A4-T) (Bar 100μ). B, encanamento Analítica; imagens de gel Painel-Representante inferiores mostrando proteínas expressas exclusivamente em células A4-P (esquerda – EEx) e células A4-T (direita – Lex). C, diagrama de Venn, mostrando proteínas categorizadas de acordo com todos os 4 sub-grupos. D.i-ii, diagrama Pie mostrando funcionalidade molecular e caminhos associados com identificaram proteínas A4-T A4-P e, respectivamente. E, a expressão da proteína quantitativa de vimentina, citoqueratina-8 e Cytokeratin-18; os dados apresentados são representativos de 3 experiências separadas representadas como média ± SEM *

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0.00.

derivação dos grupos de proteínas com base no padrão de expressão

MS /MS identificação de proteínas com base levou à derivação de dois grupos de proteínas diferencialmente expressos (Fig. 1B).

Grupo I

composto de proteínas que foram expressas qualitativamente (exclusivamente) em qualquer A4-P ou A4-T (denominado como EEx e Lex proteínas respectivamente), enquanto

Grupo II

inclui proteínas expressas em quantitativamente diferentes níveis (expressão diferencial mínimo de duas vezes entre os dois tipos de células). Ambos os grupos foram ainda divididos em dois sub-grupos com base na sua expressão em tipos de células respectivos. Anotação de expressões qualitativas e quantitativas foi realizada dentro de cada conjunto de replicação de células A4-P e A4-T. Um total de 10 e 34

Grupo I

proteínas e, 31 e 48

Grupo II

proteínas foram identificados como sendo expressos em células A4 A4-T-P e, respectivamente (Fig 1C;. Tabela S1). Tabelas 1 2 lista o identificou

Grupo I

e

proteínas Grupo II

com números ponto específico, descrição molecular e funcional, juntamente com os detalhes de peptídeos jogo, pontuação proteína, cobertura sequência (%) e expressão relativa dobrá-mudança.

Categorização de vias funcionais com base em ontologias relatados e validação de expressão

Gene ontologia analisa funcionalidades moleculares distintos ainda identificados e caminhos associados com os perfis de proteínas identificadas em os dois tipos de células (Fig. 1D.i). Assim, vários mecanismos reguladores celulares, incluindo a biossíntese de proteínas, organização do citoesqueleto, transdução de sinal, a regulação da apoptose e a degradação da proteína foram largamente enriquecido no e contribuíram para a funcionalidade de células A4-P. Estes foram sugeridos para ter uma conversa cruzada com outras vias, tais como proteínas e energia de metabolismo, metabolismo de RNA, diferenciação celular e reacções redox.

vias Inversamente, agrupamento funcional de proteínas em células A4-t compreendidos associada com as características clássicas de células cancerosas

viz

. resistência à apoptose, metabolismo energético, a proliferação celular, angiogénese e invasão e metástases (Fig. 1D.ii). Assim, as moléculas envolvidas na biossíntese de proteínas associado com, e dobrar o transporte de controlar a dinâmica do processo do metabolismo das proteínas em células transformadas em relação correspondentes suas actividades proliferativas.

Para confirmar os níveis de algumas das proteínas identificadas, as suas expressões eram validado entre células A4 e A4-P-T através de imunotransferência (Figura 1E;. A Fig. 2A, B, C, D). SeOvCa é único na medida em que, a transformação está associada com a expressão de marcadores epiteliais [21]. A expressão de vimentina reforçada em células A4-P sugerem mesenquimais, enquanto níveis elevados de Cytokeratin 8 e 18 nas células A4-T correlacionam com características epiteliais, respectivamente (Fig. 1e), além de estar em concordância com sua morfologia celular e a hipótese prevalente.

validação quantitativa da expressão e dobre a mudança de algumas proteínas, identificados em ambos os grupos; proteínas Grupo I, a, expressas exclusivamente na A4-P e B, na célula A4-T, respectivamente; Considerando que D, proteínas do grupo II quantitativamente regulados positivamente em células A4-P e E, em A4-T. E. Expressão relativa de RXR-γ e β-actina em CRA, Ada ou TTNPB retinóides tratada células A4-T (T) e validados por imunotransferência A4-P (P) e. F. quantificação de expressão RXR-γ relativa na A4-P e A4-T células. A análise estatística mostra teste de significância (* -control A4-P e retinóides células tratadas; $ – controlo A4-P e retinóides células tratadas) .Os dados apresentados são representativos de três experiências separadas e representado como média ± SEM *

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. 0,001

caracterização funcional de RXR-y um exclusivos Grupo I proteína

Dez proteínas do Grupo I foram expressos exclusivamente nas células A4-P (proteínas EEx). anotação funcional baseada em literatura levou à sua categorizat ion em quatro grupos funcionais

viz

diferenciação celular e apoptose –

RXR-γ, PRDX4;.

A proliferação celular viajantes – GNA11, PIBF-1, ANXA5, Catepsina D (CTSD);

A mitose e citocinese viajantes – KLH9;

transição epitelial-mesenquimal (EMT).

– TPM1, ANXA5

Enquanto todas as funções acima são relevantes no processo de transformação, nós nos concentramos em estudar a funcionalidade de diferenciação celular e apoptose que é crítico na manutenção da homeostase do tecido e se sabe serem reguladas por RXR-γ ao nível transcricional pela dimerização com ácido retinóico ou receptores de ácido X retinóico (RAR ou RXR, respectivamente) ou de outros parceiros do heterodímero permissiva como PPAR-γ [22], [23 ], [24]. Nós, portanto, decidiu investigar o papel de RXR-γ em nosso modelo de progressão do câncer epitelial de ovário.

interações RXR-gama com receptores nucleares e modulação da diferenciação celular em células A4-P por tratamento retinóides

tratamento de Retinóide aumentar os níveis de RXR-y em células A4-P; e curiosamente, retomou expressão significativa nas células A4-T, bem como (Fig. 2E, F). CRA e ADA tratamento individual elevados níveis de RXR-y em ambos os tipos celulares, embora esta indução foi menos eficaz em combinação com TTNPB. No sentido de validação de interacções RXR-y com outros receptores nucleares, co-imunoprecipitação e imunotransf erência com interacções afirmados PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α e RAR-α em células pré-transformadas (Fig. 3A, B). Avaliação do envolvimento de RXR-γ na diferenciação celular foi conseguida através de perfis de marcadores epiteliais de E-caderina (E-cad), citoqueratina 18 (CK-18) e mucina-1 (MUC-1) em níveis de expressão de genes e de proteínas, em estado estacionário e sobre a exposição ao natural,

viz

. CRA e a retinóides sintéticos (ADA e TTNPB) (Fig. 3C). No estado estacionário, foi observada menor expressão de E-Cad nas células A4-P. A expressão de E-Cad aumentou ainda mais com o CRA e também com ADA; CRA foi administrado isoladamente ou em combinação com ADA e TTNPB. Níveis de E-Cad, CK18 e Muc-1 foram endogenamente maior nas células A4-T. Sintético ADA retinóide sozinho ou em combinação com ANR upregulated expressão CK18 em ambos os tipos de células. Embora, o papel específico de TTNPB, na diferenciação celular é desconhecida, o tratamento TTNPB resultou em menor regulação positiva de marcadores de diferenciação. Todos os três marcadores foram aumentadas em resposta ao retinóide exposição em células A4-P afirmando desse modo o envolvimento de RXR-γ na modulação da diferenciação celular. tratamento retinóide nas células A4-T resultou na indução de RXR-γ, sem quaisquer alterações significativas nos níveis destes marcador de diferenciação epitelial na expressão gênica e níveis de proteína (Fig. 3D, 3E).

A. Co-imunoprecipitação (Co-IP) com exibição RXR-γ eluída imunocomplexo por coloração de prata. B. Validação de RXR-γ indicando interacção em Co-IP com o RXR-γ com PPAR-γ, RAR-γ, RXR-α e RAR-α em células A4-P e validados por imunotransferência. C. Expressão de perfis de CK-18, Muc-1 e E-caderina na transcrição (Tr) e proteína (Pr) realizada por semi-quantitativo de RT-PCR e PCR em imunotransferência, Ada ou TTNPB retinóides tratada A4-P (P) e A4-T (T) células. D. Quantificação da expressão de mRNA de E-Cad, CK18 e MUC1 marcadores de diferenciação epitelial na A4-P (P; line) e as células A4-T (T; linha tracejada) após tratamento retinóides validada através de RT-PCR. E. A quantificação da expressão da proteína da E-Cad, CK18 e fabricantes de MUC1 na A4-P (P; line) e as células A4-T (T; linha tracejada) após tratamento retinóides validado através immunoblotting. Os dados apresentados são representativos de três experiências separadas representadas como média ± SEM *

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retinóide induzida níveis RXR-y sensibilizar células transformadas em direção a apoptose via via intrínseca

Papel do RXR-γ na mediação da apoptose em resposta a retinóides naturais e sintéticos foram avaliados (Fig . 4A). No estado estacionário, a apoptose foi significativamente mais baixa em células A4-T, em comparação com células A4-P indicando aquisição de resistência à apoptose durante o processo de transformação. A apoptose foi aumentada em ambos os tipos de células para a exposição a ANR e ADA – quer isoladamente ou em combinação (Fig.4B). Enquanto TTNPB por si só não conseguiu induzir a morte celular, em combinação com a ADA e CRA sensibilizou as células A4-T a apoptose. Retinóide activação mediada por RXR-expressão γ também foi encontrada uma correlação directa com os níveis mais elevados de apoptose (Fig. 2E, F). Nós perfilado expressão do factor de transcrição Snail (que antagoniza mediada por p53 pró-sobrevivência de sinalização através da repressão activa de moléculas pro-apoptóticas PUMA /BBC3, ATM e PTEN em células de cancro do ovário sob tensão; [19]) para avaliar o efeito de RXR-γ conduziu apoptose nele. Caspase 9, um marcador de apoptose via intrínseca, regulada positivamente durante o RXR-γ e indução de PPAR-γ e Bcl-2 como marcadores de apoptose [25]. Snail e a expressão de Bcl-2 foram reduzidos, enquanto que a expressão significativamente elevada dos RXR-γ, PPAR-γ e caspase 9 eram evidentes no tratamento retinóide (Fig. 4C, 4D, 4E). A expressão destas moléculas foi ainda reforçada no tratamento retinóide combinatória. Nós sondado ainda mais os efeitos dos retinóides sobre os perfis do ciclo celular (Fig. S1A, 1B). Como esperado, as células estado estacionário A4-T possuem maior amp S G2 /M populações do que as células A4-P, indicando proliferação activa. tratamento CRA intensifica a apoptose, juntamente com G2 /M detenção nas células A4-P, enquanto ADA e TTNPB induzir a única G2 /M detenção. Nos tratamentos combinatórias, CRA com ADA ou a presença de todos os três retinóides induziram uma /S paragem em G1 em células transformadas.

. Os dados do ensaio de anexina V-FITC mostrando a apoptose em células A4-A4-P e T em diferentes regimes de tratamento retinóides; onde eu. Tendo em nenhum tratamento retinóide, ii. tratadas com CRA, iii. com ADA e iv. ambos com tratamento alternativo de outro retinóide sintético ou seja TTNPB. B. A análise estatística de ensaio de apoptose, mostrando a apoptose significativa entre ambos os tipos de células em diferentes conjuntos de tratamento retinóide. C. Expressão análises de RXR-γ, PPAR-γ, Bcl-2, caspase 9 e caracol na transcrição (Tr.) E o nível de proteína (Pr.) Através de RT-PCR e immunoblotting respectivamente. D. Quantificação da expressão de mRNA, i. expressão de RXR-γ, PPAR-γ, a caspase 9, Bcl-2 e caracol mediante tratamento retinóides em células A4-P que, ii. mostra os níveis em células T-A4 sobre a validação por meio de RT-PCR. E. A quantificação da expressão da proteína, i. expressões de RXR-γ, PPAR-γ, a caspase 9, Bcl-2 e Snail em células A4-P que, ii. mostra os seus níveis em células A4-T sobre o tratamento retinóides validado através immunoblotting.

In vivo tratamento retinóide significativamente reduzir o crescimento de xenotransplante em ratinhos NOD-SCID através de RXR-γ sensibilização mediada de células transformadas em direção a apoptose

Nós ainda alargada a re-sensibilização acima dos níveis de RXR-gama em A4-T efeitos células obtidas

in vitro

de tumores experimentais (Fig. 5A). A média de volume do tumor (Fig. 5B, 5C) em cada ponto de tratamento, juntamente com média de volume do tumor e peso a 7ª semana (Fig. S1C, S1D) mostrou redução significativa no retinóides tumores tratados ratos versus aqueles em DMSO tratados controles. No geral, o tratamento retinóide combinatória foi mais eficaz. As expressões RXR-y distintamente regulados positivamente em tumores tratados com retinóides sugerem fortemente sensibilização de células A4 transformado para a apoptose. foi encontrado efeito combinado de retinóides para ser mais letal para o crescimento tumoral através retomou RXR-γ apoptose mediada das células tumorais

in vivo

. níveis RXR-gama foram encontrados significativamente maior em todos os 5 conjuntos incluindo CRA, CRA TTNPB, ADA, ADA TTNPB e CRA, ADA TTNPB; em comparação com o controlo de veículo de DMSO. Esta é uma correlação definitiva com estimulação RXR-γ e indução de apoptose nestas células

in vitro

(Fig.5D).

A. Procedimento experimental que ilustra retinóides regime de tratamento em murganhos NOD-SCID. Os ratos foram observados até três semanas até que o tamanho do tumor cresce 25-30 mm

3, o tratamento de DMSO, CRA, CRA + TTNPB, ADA, ADA + TTNBP e CRA + ADA + TTNBP começou no dia 4

th semana e procedeu até 7

th semana. B. representação gráfica que mostra os volumes dos tumores de controlo e retinóides tratados ratinhos NOD-SCID em diferentes pontos de tempo. C. tamanhos de tumor comparativa de controlo e tratados tumores retinóides. D. expressão quantitativa de RXR-γ em tumores de controlo e tratados retinóides e validados por imunotransferência. Os dados apresentados são representativos de três experiências separadas (n = 6 para

In vivo

experimentos) e descrito como média ± SEM *

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Discussão

A existência de vários subtipos histológicos que se correlacionam com célula diferente (s) -de-origem no cancro do ovário [26] continua a ser um obstáculo para o estabelecimento de modelos de progressão representativos nesta doença. Isto está em contraste com outras doenças malignas como o cancro da próstata, em que esses modelos têm sido aplicados ao longo das últimas duas décadas em elucidar os mecanismos moleculares da doença [1], [27], [28], [29]. No presente estudo, a caracterização de proteínas exclusivo e diferenciado detalhada de um modelo de progressão estabelecido anteriormente em nosso laboratório proporciona novos insights sobre padrões moleculares alterados durante a progressão SeOvCa. células A4-P com a imortalidade replicativo representar uma fase de pré-neoplásica, enquanto as células A4-T com características agressivas e metastáticos são representativos da transformação e progressão da doença.

Nossos dados afirma que os dois estados funcionais do modelo estão associados com perfis de proteínas distintas. Dentro do grupo de proteínas exclusivos para as células A4-P, a caracterização do papel da RXR-γ revelou uma sensibilidade das células pré-transformado para a apoptose e diferenciação tal como descrito anteriormente [30]. níveis de RXR-y comprometidos são também relatados em várias condições malignas, incluindo o cancro do pulmão de células não pequenas [31]; onde também tem sido relatado que o silenciamento epigenético de RXR-γ correlacionada com a diminuição da sobrevivência global dos pacientes [32]. Nos nossos células pré-transformado, RXR-γ coopera com PPAR-γ, RAR-γ, RAR-α e RXR-α para formar complexos heterodiméricos funcionais, em que o RXR-γ com PPAR-γ coordena apoptose celular através da via intrínseca confirmada com elevados níveis de caspase-9. Além disso, observou-se que a activação RXRy em células transformadas re-sensibiliza-los a apoptose como um efeito sinérgico dos agonistas que medeiam efeitos citotóxicos

In vitro

, bem como em tumores experimentais (Fig. 6). Esta é uma identificação importante para a aplicação de terapias à base de retinóides. Neste estudo, caracteriza a natureza pleotropic da sinalização RXR-γ em nosso sistema modelo SeOvCa de progressão. Perda de níveis de RXR-y indicados para facilitar benefícios mecanísticos para células transformadas em relação aquisição de resistência à apoptose; consequentemente, as células tumorais sensibilizadas com retinóides upregulate níveis RXR-gama, levando à morte celular significativa.

A. modulação de RXR-γ no estado estacionário em células pré-transformado; tratamento retinóides RXR-y aumenta os níveis e intensificar a apoptose (por interacção com o RXR-γ PPAR-γ) e expressão de marcadores de diferenciação epitelial específicas (interacções sobre o RXR-y com o RAR-γ, RXR-α e RAR-α). B. A deficiência de RXR-γ proporcionar benefícios de resistência à apoptose de células transformadas; tratamento retinóide induzida níveis RXR-y sensibilizar estas células no sentido de apoptose significativa.

A abordagem presentes proteômica é um primeiro conta a evolução SeOvCa que refletem sobre várias vias funcionais associadas à transformação. Significativamente, a sinalização de RXR-γ pode ser uma porta potencial na prevenção da progressão da doença. A elucidação da sinalização RXR-γ estende abordagens contemporâneas de transformação celular em SeOvCa que agora podem ser exploradas ainda mais no desenvolvimento e avaliação de novas modalidades terapêuticas.

Material e Métodos

declaração Ética

Todo o trabalho animal foi realizado com o Centro Nacional de Cell Science aprovação da Comissão de Ética (NCCS) Institucional animal (AICE) de experimentos na instalação NCCS Experimental animal House (EAH), e foi realizada de acordo com as normas, leis e políticas previsto pela comissão.

cultura de células, tratamentos e transfections

Derivação do modelo de progressão A4 de células SeOvCa pré-transformados e transformados (células A4-P e A4-T) é descrita anteriormente [14], [18]. Retinóide tratamento (ligando de RXR-γ) foi levada a cabo usando qualquer retinóide naturais

viz. 9

Cis

ácido retinóico (PCR; 10? M) ou retinóides sintéticos Adapalene (ADA; 2 uM; RAR agonista) ou 4 – [(E) -2- (5,6,7,8 -Tetra – 5,5,8,8-tetrametil – 2 naftalenil) – 1 -propenil] ácido benzóico Arotinoid (TTBPB; 10 �; RXR e RAR agonista) por 48h

a preparação das amostras, eletroforese em gel de 2-Dimensional (. 2DE) e análise de imagem

Os sedimentos celulares (10

7) de A4 e A4-P-T foram suspensas em 500 ul ml de tampão de lise contendo ureia 8 M de ureia, 2 M tioureia, DTT 100 mM , CHAPS a 2% e 0,2% de anfólitos com o cocktail inibidor de protease (Amersham orientação USB). extracto celular foi deixado ser misturado durante pelo menos 15 minutos e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente, para facilitar solublisation proteína adequada. As amostras de proteína foram adicionalmente centrifugado (110,000g durante 1 hora a 4 ° C) e a suspensão foi recolhido. A concentração de proteína foi estimada com kit quant 2DE (GE Healthcare) a 480 nm (Bekman Coulter). As amostras preparadas foram executados em primeira dimensão (pi), seguido por de segunda dimensão em SDS-PAGE desnaturante (Mw). Um total de 350 ug de proteína de lisado de células inteiras foi tomado em 18 cm de pH imobilizadas gradiente (IPG) tira (pH 4-7) e re-hidratados durante a noite. Um programa de tensão de IEF de três passos foi preparada para as tiras sobre uma célula Protean IEF (Bio-Rad): 50 V durante 20 minutos, 10.000 V durante 2 horas minutos e 10.000 V para 45.000 V-h. As tiras foram ainda mais reduzidos por incubação em tampão de equilíbrio /redução (6 M de ureia, 0,375 M de Tris pH 8,8, 2% SDS, 20% glicerol, 2% (w /v), DTT (Sigma)) e, em seguida alquilado no mesmo tampão mas contendo 2,5% (w /v) de iodoacetamida (Sigma) em vez de DTT. A segunda dimensão foi realizado executando as tiras de IPG em 1,0 milímetros de espessura de 10% – (w /v) – de SDS-PAGE. Os géis foram corados com espectrometria de massa compatível com azul coomassie modificado (Pierce, Thermo-Fisher) e coloração de prata. A aquisição de imagens de gel de proteína foi realizada utilizando Quantidade One® software do sistema de VersaDocTM (Bio-Rad Laboratories, EUA), com valores paramétricos iguais. A análise de imagens e detecção de ponto foram realizados em PDQuest 2-DE software de análise versão avançada 8,0 (Bio-Rad). Para efeito de comparação local quantitativa e qualitativa em ambos géis, match-sets (conjunto Master) de seis repetições de A4-P e A4-T 2DE-géis foram preparados e analisados. Software facilita a anotação de cada um e foco individual, identidades originais foram fornecidos a todos os spots de proteínas de gel de replicar. Um conjunto de análise de proteínas foram preparadas para identificar pontos que são significativamente diferentes. Análise definir foram feitas com base em proteínas identificadas manchas única para A4-P e A4-T e pontos comuns entre os dois grupos replicar com um limite de variação de 2,0 quantidade dobra. A estimativa total de pontos combinados e incomparáveis ​​estava preparado para imagens e proteínas diferenciais finais foram identificados em entre dois tipos de células géis representativas.

In-gel a digestão e identificação de proteínas utilizando MALDI-TOF /TOF

spots de proteínas em 2DE que mostram expressão diferencial e que satisfaça os critérios estatísticos foram selecionados e extirpado para a digestão em gel e analisa ainda MS. Ponto de excisão foi realizado manualmente com a ajuda de estéril cortador ponto agudo. Resumidamente, as fatias de gel foram descoradas em 25 mM de bicarbonato de amónio, posteriormente desidratadas com uma mistura 02:01 de bicarbonato de amónio 50 mM: 100% de acetonitrilo (ACN) para repetidas 3 vezes cada 5 minutos. fatias de gel foram reduzidas com DTT 10 mM a 60 ° C durante 1 hora. Após arrefecimento, as fatias de gel foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente com ácido iodoacético 50 mM. Após a lavagem e a desidratação de tais fatias de gel com bicarbonato de amónio 25 mM e ACN durante 10 min, que foram secos sob vácuo e digestão tríptica realizada com bicarbonato de amónio 50 mM contendo 20 ug /mL modificado tripsina de grau proteómica (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante e mantido em gelo durante 30 min. bicarbonato de amónio 25 mM adicional foi adicionado e a digestão foi continuada durante a noite a 37 ° C. péptidos extraídos foram completamente secas utilizando um Speedvac e re-suspenso em 10 ul de 20% de bicarbonato de amónio e solução de ácido fórmico a 1%.

Após o processamento através das pontas de pipeta Zip-Tip (Millipore, USA), misturas de péptidos foram dissolvidos com uma solução de matriz. A matriz utilizada para a análise de MALDI era um-ciano-4-hidroxicinâmico (Sigma) a 20 mg /ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% ácido trifluoroacético. Volumes iguais de solução de péptido e matriz foram misturados, e 1 ul da solução resultante foi manchada sobre uma placa de amostras de MALDI de aço inoxidável. Espectros de péptidos digeridos foram adquiridos num 4800 MALDI-TOF /TOF espectrómetro de massa (Sciex AB, Framingham, MA) ligada ao software 4000 Explorer Series (versão 3.5.3). Os espectros de massa produzidos foram registrados em um modo reflector dentro de uma faixa de massa 800-4000 Da, usando um laser Nd: YAG 355nm. A tensão de voltagem de aceleração e extração foram criados em 20 kV e 18 kV respectivamente. Seis calibração de ponto do instrumento foi realizada com o péptido kit padrão (AB Sciex). Todos os espectros de MS foram obtidos a partir de acumulação de 900 disparos. MS /MS espectros foram adquiridos com a acumulação total de 1.500 disparos de laser e energia de colisão de 1kV. Na conclusão dos exames de pesquisa de MS, os dados foram processados ​​para gerar uma lista de íons precursores para interrogatório por MS /MS. As listas de pico MS e MS /MS combinados foram exploradas usando o GPS

TM Explorador do software versão 3.6 (AB Sciex). identificação de proteínas foi realizada por busca ion MS /MS usando MASCOTE (versão 2.1) do motor (https://www.martixscience.com) busca no banco de dados SwissProt.