Abstract

Fundo

Por analogia com a diferenciação de células estaminais normais, a corrente modelo de haste do cancro de células (CSC) pressupõe uma organização hierárquica e de uma diferenciação irreversível no tecido tumoral. Por conseguinte, os CSCs deve compreender apenas um pequeno subconjunto de células tumorais, o qual alimenta o crescimento do tumor. No entanto, alguns estudos recentes levantaram dúvidas sobre a aplicabilidade geral do modelo de CSC e perguntou pelo seu requinte.

Metodologia /Principais Achados

Neste estudo foram analisadas as propriedades CSC de células de carcinoma mamário derivado de transgênicos (WAP-T) ratos. Nós estabelecemos uma linha celular WAP-T altamente tumorigênico (células G-2) que exibe traços tronco-like. células G-2, bem como os seus derivados clonais, estão intimamente relacionados com tumores primários sobre perfis de histologia e expressão gênica, e refletem a heterogeneidade em relação aos seus estados de diferenciação. L-2 culturas compreendem populações de células em estados de diferenciação distintos identificados por co-expressão de proteínas do citoesqueleto (citoqueratinas e vimentina), uma combinação de marcadores da superfície celular e um conjunto de factores de transcrição. subconjuntos celulares classificadas de acordo com a expressão de CD24a, CD49f, CD61, EpCAM, Sca1 e proteínas da superfície celular Thy1, ou marcadores metabólicos (por exemplo, atividade ALDH) são competentes para reconstituir a composição celular inicial. Repovoamento eficácia varia muito entre os subconjuntos individuais e é influenciada por interacções com o respectivo L-2 subconjunto celular complementar. O equilíbrio entre os estados de diferenciação é regulada em parte pelo factor de transcrição SOX10, como a depleção de SOX10 levou a sobre-regulação de Twist2 e aumentou a proporção de células representam células em um, reversível, estado de diferenciação quase-mesenquimal auto-renovável Thy1-expressando .

Conclusões /Significado

células G-2 constituir um sistema de células de câncer de auto-reprodução, mantido pela conversão bi e unidirecional de subconjuntos celulares complementares. Nosso trabalho contribui para a discussão controversa atual sobre a existência ea natureza da CSC e fornece uma base para a incorporação de hipóteses alternativas para o modelo de CSC

Citation:. Wegwitz F, Kluth MA, Manz C, Otto B, Gruner K, Heinlein C, et ai. (2010) As células Oncogenia WAP-T mouse mamária Carcinoma: Um modelo para um sistema de célula auto-reprodutor Cancer homeostático. PLoS ONE 5 (8): e12103. doi: 10.1371 /journal.pone.0012103

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de abril de 2010; Aceito: 14 de julho de 2010; Publicação: 11 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Wegwitz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (de 212 /23-1-3 para WD e GT), a Deutsche Krebshilfe (Forschungsverbund “Tumorstammzellen”) para WD e GT, o VFK Krebsforschung gGmbH a WD, eo Fonds der Chemischen Industrie . O Heinrich-Pette-Institute é apoiado financeiramente pela Freie und Hansestadt Hamburg eo Bundesministerium für Gesundheit. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a definição por Rollin Hotchkiss de matéria viva “, como a produção repetitiva de heterogeneidade ordenada” é aplicável ao normal, bem como ao tecido tumoral [1]. A heterogeneidade celular observada em muitos tumores sólidos, a nível estrutural e funcional é uma reminiscência da organização celular complexa dos respectivos tecidos normais. Esta semelhança de tumor ao tecido normal legitima o pedido formal de princípios e conceitos em biologia do desenvolvimento à investigação do cancro. O modelo de cancro de células estaminais (CCC) [2], [3] descreve um tumor como um sistema hierarquicamente organizado de células estaminais do tipo e a sua progenia diferenciada. Tal como postulado por o modelo de CSC, um pequeno subconjunto de células do tumor conduz ao crescimento e é responsável pela reincidência do tumor após uma terapia aparentemente bem sucedida. Estas células tumorais, referidos como CSCs, células tumorigénicas de iniciação do tumor ou, distinguem-se por uma combinação de marcadores de superfície celular associados comum ou única operacionalmente definidas e a capacidade para estabelecer a doença em ratinhos receptores apropriados [4]. Em contraste com o modelo estocástico da evolução clonal, que atribui heterogeneidade da célula tumoral a diferenças genéticas na piscina de células de tumor [5], o modelo de CSC postula que as diferenças epigenética em vez de genéticos distinguir tumorigénico de células não tumorigénicas, proporcionando assim uma base para as relações hierárquicas dentro da população de células de tumor [6].

recentes descobertas de que as células tumorigénicas pode compreender uma fracção significativa da massa tumoral [7] questionar a organização hierárquica estritamente do tecido tumoral [8], e em vez argumentam para “plasticidade fenotípica” de células de tumor [9], mantidos por mecanismos homeostáticos [10]. Assim, os CSCs não existir como uma única população definida por propriedades moleculares discretas, mas sim juntamente com a sua progenia diferenciada constitui um “sistema de células estaminais” auto-reprodução, onde a composição celular é regulada por interconversão de vários estados de diferenciação [9]. Tumores de origem epitelial (carcinomas) geralmente apresentam elevada heterogeneidade histológica reflectindo diferentes estados de diferenciação de células individuais. Com base em três critérios fenotípicos – célula de polarização, coesividade célula e o padrão de proteínas de filamento intermediário citoplasmático (CIF) – expressão tem sido sugerido para definir quatro fenótipos, que vão desde totalmente puramente epitelial para mesênquima [11]. Por conseguinte, o estado de diferenciação de células individuais em carcinomas corresponde a um epitelial, uma mesenquimais e um fenótipo intermediário. Estes estados de diferenciação pode ser subdividido em subtipos estáveis ​​e transitórios, que em conjunto são montados em um “ecossistema” dinâmico. O processo denominado transição epitelial-mesenquimal (EMT) e o seu homólogo, denominado mesenquimal-epitelial (TEM) [12], [13], descrevem a conversão de estados de diferenciação opostas. Estas transições têm sido recentemente ligado a stemness célula pela observação de que a indução de EMT em modelos de cultura de células epiteliais da mama humana cria um subconjunto de células altamente enriquecido em CSCs [14], [15]. O modelo que emerge a partir destes estudos que propõe em carcinomas EMT e MET conta para a geração de um subconjunto de células que estão em equilíbrio com o compartimento de tumor epitelial e são capazes de regenerar toda a população de células de tumor [9].

camundongos transgênicos e knockout fornecer modelos singênica (ou congênica) de investigação CSC, uma vez que permitem estabelecer doenças cancerosas em animais imunocompetentes que imitam a situação humano correspondente, e são uma fonte de linhas celulares que permitem estudos de propriedades CSC. No entanto, a adequação de modelos do rato é muitas vezes restringida pelo facto de que os efeitos de expressão de um oncogene, ou perda de um supressor de tumor, são já exercida na fase embrionária e durante o desenvolvimento do tecido, enquanto que, na grande maioria dos cancros humanos genéticos alterações que conduzem a cancro irá ocorrer em células de tecidos adultos. ratinhos transgénicos WAP-T [16] – [19] tem provado ser um modelo útil para a análise de cancro mamário induzido pelo oncogene em ratos adultos. Na fêmea WAP-T ratinhos activação do transgene, o vírus de símio 40 (SV40) região do gene precoce flanqueada por uma região ~1.4 kb a montante do gene que codifica para a proteína de soro de leite ácida rato (WAP) [20], é iniciado durante o final de células a gravidez em epitélio mamário (ME) concordantes com o endógena

Wap

gene [21]. Expressão de SV40 precoces genes que codificam para grande antigénio T (LT) e pequena antigénio-T (r) acciona carcinogénese mamaria imitando uma variedade de alterações genéticas comumente observados em carcinomas da mama humanos, como revogação da G1-checkpoint controlado-PRB [ ,,,0],22], e a inactivação do gene supressor tumoral p53 [23]. Como consequência da expressão do gene precoce de SV40, ratos WAP-T paridas desenvolver múltiplas lesões alveolares – neoplasia intra-epitelial multifocal (MIN). Algumas destas lesões focais continuar a progredir para invasiva, mas raramente carcinomas da mama metastáticos [19]. Morfologicamente, o desenvolvimento de tumores em ratinhos WAP-T são adenocarcinomas, que variam a partir de um poço para um fenótipo pouco diferenciado [16]. A relevância deste modelo é enfatizada pela grande semelhança em histologia dos tumores de ratos com tumores humanos correspondentes [19].

Neste estudo foi perguntado se os tumores WAP-T são melhor descritas pelo modelo de CSC clássica ou por hipóteses alternativas. Descobrimos que as células tumorigénicas são relativamente frequente em tumores WAP-T (até 10/01) e são capazes de recapitular o fenótipo dos respectivos tumores primários após o transplante ortotópico em murganhos singeneicos. Para estudar as suas propriedades tumorigénicas em mais detalhe, foi estabelecida a partir de um tumor de WAP-t uma linha de células (células L-2). células G-2 com alta eficiência formar tumores em ratinhos singeneicos que pelo gene análises de expressão e fenotípicas estão intimamente relacionados com tumores primários. culturas de células L-2 são caracterizadas por uma assinatura de expressão basal do gene /luminal, heterogeneidade de estados de diferenciação e a presença de subconjuntos celulares complementares que podem ser separadas de acordo com as diferenças na expressão de certos marcadores de superfície celular relacionados com stemness. Mostramos que subconjuntos rigorosamente FACS separadas de células L-2 são competentes para reconstituir a composição celular inicial da cultura de células quando cultivadas individualmente. Nossos dados argumentam por um “sistema de célula de câncer” homeostático auto-replicáveis, onde o equilíbrio depende de interconversão dos subconjuntos celulares complementares, suas interações e competência da transcrição. Em apoio do modelo EMT-CSC [9], foram identificados na cultura G-2 uma população auto-renovação das células caracterizadas pela expressão de Thy1 e exibição de reversibilidade espontânea de um estado de diferenciação quase-mesenquimal.

resultados

tumores WAP-T contêm uma elevada proporção de células tumorigénicas

um critério decisivo para CSCs é a sua capacidade para iniciar o crescimento do tumor após transplante em ratos receptores apropriados e recapitular o fenótipo do original tumor. transplante ortotópico de células tumorais WAP-T diluídas em série revelou que tão baixa quanto 10

2 células de tumores bem ao diferenciadas moderadamente (baixo grau), e tão baixo quanto 10

1 células de (high-grade pouco diferenciado tumores) foram capazes de induzir carcinomas da mama em ratinhos singeneicos (Figura 1A). tumores transplantados geralmente reflectido o fenótipo dos tumores parentais (Figura 1B). No entanto, o transplante de células de um tumor de baixo grau, por vezes, também deu origem a tumores de grau elevado. Como pauci-clonalidade de tumores WAP-T tem sido ocasionalmente observada [17], o crescimento de células de um pool de células tumorais de alto grau não pode ser excluída.

(A) Células de alto grau WAP-T Os tumores são mais tumorigénico do que as células de tumores de baixo grau. Diluídas em série (10

1, 10

2, 10

3, 10

4) células tumorais WAP-T isoladas de fresco foram injectados na glândula mamária abdominal esquerda, tal como descrito em Materiais e Métodos. (B) H E coloração de baixo grau e alto grau, respectivamente, WAP-T primário e seu tumor transplantado correspondente. Os tumores transplantados cresceu após a injecção de 10

4 ou 10

2 células, respectivamente, a partir de tumores de baixo grau e de alta qualidade. Barra de escala:. 100 um

Caracterização do G-2 e seus derivados células clonais

Para evitar as complicações associadas à análise de células de tumor primário, foi estabelecida uma linha de células a partir de um tumor WAP-T (células G-2), que permitiria análise do tumor mamário iniciar e deter as propriedades da célula sob

in vitro

e

in vivo

configurações (ver Materiais e Métodos para detalhes) .

a)

In vitro

.

a partir das primeiras passagens G-2 culturas de células exibiram um padrão de crescimento não homogêneo, caracterizado por colônias de hermeticamente embalados incorporado em paralelepípedos-like áreas (Figura 2A). Em passagens subsequentes células L-2 preservada a capacidade de formar agregados de células múltiplas e tridimensionalmente colónias em expansão, mas adquiriu uma morfologia fibroblástica semelhante mais (Figura 2B, C). G-2 células exibem estável, embora a expressão heterogénea de SV40-LT, que no complexo com a de tipo selvagem endógeno p53 acumulado nos núcleos da maioria das células (Figura 2D), reflectindo assim a expressão do SV40-LT

In vivo

. A expressão de LT-SV40 correlaciona-se com

Wap

actividade do gene endógeno (Figura 2E), indicando que os reguladores responsáveis ​​pela transcrição do gene da

Wap Quais são constitutivamente activa nas células L-2. Em apoio, transdução lentiviral de g de 2-células com um repórter GFP construir sob o controle de um ~1.4 kb

Wap

fragmento do promotor mostraram que mesmo após 2 semanas em cultura uma grande população da eGFP enriquecido com FACS

+ – células permaneceram-eGFP positivas (Figura 2F). Estas células eventualmente formada focos densa de altamente eGFP células que expressam.

(A-C) imagens de contraste de fase de g de 2-células em um início (P9) e uma posterior (p29) passagem. (D) confocal imagem de g de 2-células coradas com anticorpos anti-p53 (vermelho) anti-R-LT-SV40 (verde) e. Imagens foram fundidas com uma micrografia de contraste de interferência diferencial (DIC). (E) confocal imagem do G-2 células marcadas com o anticorpo anti-Wap (verde). Os núcleos foram visualizadas por coloração com DRAQ5 (azul). (F) imagem de fluorescência de células ao vivo de G-2 células após a transdução lentiviral com um repórter eGFP construir sob o controle do

Wap

-promoter. FACS enriquecido eGFP

+ – células foram mantidas em cultura durante 2 semanas. (G e H) queratina 14 (vermelho) e queratina 18 (verde) imunocoloração das células em cultura G-2. Os núcleos foram visualizadas por coloração com DAPI (azul). (I) quantificação baseado em FACS de queratina 18 em expressão G-2 em células de passagem 20. (J e K) de vimentina (verde) e SV40-LT (vermelho) /queratina 18 (vermelho) co-coloração de G-2 cultivadas células na passagem 10. setas marcar células G-2 sem expressão SV40-LT detectável. Os núcleos foram visualizadas por coloração com DAPI (azul). (L) quantificação baseado em FACS de expressão de vimentina no G-2 células na passagem 20. As barras de escala: A: 150 mm; B e C: 200 um; D e E: 20 uM; F, G, H e J: 100 um; K:. 50 um

Desde constitutiva

Wap

atividade genética tem sido associada a progenitores comprometidos bipotent alveolares e CD61

+ progenitores restringiu-luminais, que são alvos presuntivos de atividade oncogene [24], foi realizada uma análise de linhagem de células por imunofluorescência coloração (IF) para o luminal epitelial queratina marcador de células 18 (Krt18), os /marcadores de células mioepiteliais basais queratina 5 (KRT5) e queratina 14 (KRT14). Em passagens iniciais a maioria das células L-2 expresso tanto KRT14 (Figura 2G) e proteínas de filamento intermediário Krt18 (Figura 2H); No entanto, o parceiro habitual de co-polimerização de KRT14, KRT5 a proteína, não foi detectável por um anticorpo específico (dados não mostrados). Em passagens subsequentes ligeiras variações nos níveis de expressão individuais de KRT14 e Krt18 (dados não apresentados) e não foram observadas uma flutuação significativa do número de células de expressão de citoqueratina variando de 40 a 70%. A Figura 2I mostra como exemplo a quantificação baseado em FACS de expressão Krt18 em células L-2 na passagem 20, o que indica uma transição para um estado de diferenciação do mesênquima. Assim, a expressão da vimentina proteína de filamento intermediário foi analisada como um marcador amplamente utilizado de células mesenquimatosas e células de carcinoma em fase de transição entre epiteliais e mesenquimais estados de diferenciação [25], [26]. Independente do número de passagem quase todas as células G-2 expressam vimentina, em que a intensidade da expressão de vimentina varia de uma distribuição citoplasmática difusa e estruturas filamentosas fracos a uma rede filamentosa abundante (Figura 2J-K mostrar vimentina /SV40-LT e vimentina /Krt18 co -staining na passagem 10). Figura 2L mostra como exemplo a quantificação baseado em FACS da expressão de vimentina em células L-2 na passagem 20. expressão de SV40-LT foi detectada quase sempre também em células que expressam fortemente vimentina (Figura 2J). No entanto, algumas células com falta de SV40-LT eram sempre presente em G-2 culturas (Figura 2J, marcados por setas). Em resumo, por imunocoloração Análise observamos em primeiro lugar, que a maioria das células L-2 distinguem-se por um estado de diferenciação caracterizado por co-expressão de vimentina e citoqueratinas, em segundo lugar que o número de células desprovidas de citoqueratinas oscila entre passagens, e em terceiro lugar, que um população pequena de células que expressam as citoqueratinas mas totalmente falta vimentina está sempre presente.

Tal heterogeneidade em estados de diferenciação pode reflectir uma origem multiclonal de cultura de células L-2, tal como esta cultura foi derivada de um tumor todo. Para abordar esta possibilidade, células L-2 foram clonadas em agar mole, e dez colónias foram expandidos em linhas celulares estáveis. Como visualizado por SE-coloração, o padrão celular G-2 de expressão citoqueratina foi reproduzida em G-2 clones derivados de células (Figura S1A-B; como exemplo para clones de L-2C9 e G-2C11), embora de acordo com a análise de qPCR os níveis relativos de

KRT14

e

Krt18

expressão genética variou significativamente entre os clones (Figura S1C-D). Também nos clones secundários, obtidos por clonagem agar de G-2C9 e G-2C11 clones, uma variação de 2-3 vezes na transcrição da

KRT14

e

Krt18

genes pode ser demonstrada ( Figura S1E-F). Semelhante à cultura parental, foi observada a expressão de vimentina heterogéneas em G-2 clones de células (Figura S1G). Portanto, concluímos que a presença de populações de células em epitelial, mesenquimal e estados de diferenciação intermédios é uma propriedade inerente do G-2 culturas.

b)

In vivo

.

Testamos o tumor iniciar potencial das células G-2 por transplante ortotópico na glândula mamária abdominal esquerda de ratos destinatário WAP-T nulíparas. 10

6 G-2 células formaram rapidamente tumores palpáveis ​​(adenocarcinomas de alta qualidade) em todos os ratinhos receptores (Tabela 1). Os menos células nos transplantados, maior era o período lag, maior sua variação (Tabela 1). Mesmo a partir de 10 células injectadas G-2 em 10 dos 12 ratinhos receptores desenvolvimento de tumor foi detectado (Tabela 1), indicando uma elevada frequência de células tumorigénicas no cultura G-2. Imunocoloração análise da vimentina e Krt8 /18 expressão em tumores derivados de células G-2 (Figura 3A) revelou sua estreita semelhança com pouco diferenciado (G3 grau) tumores WAP-T (Figura 3B). Enquanto em baixo grau de WAP-t tumores coloração vimentina foi principalmente limitado a septos e compartimento estromal (Figura 3C), a expressão variável de vimentina também foi detectável no compartimento epitelial (representado por Krt8 /18) em alto grau de WAP-t tumores (Figura 3B), indicando um estado de diferenciação intermédia de células tumorais em G-2 e tumores derivados de WAP-T de alta qualidade e um estado de diferenciação epitelial das células tumorais em tumores de baixo grau de WAP-T. Co-coloração para vimentina e SV40-LT (expressão de SV40-LT está limitada a células tumorais) permite fazer a distinção entre as células do mesênquima do estroma recrutadas para os tumores e células de tumor que expressam um fenótipo mesenquimal ou um intermediário. Em transplantados L-2 tumores (Figura 4A) e tumores WAP-T de alto grau (Figura 4B) observou-se para além da expressão esperado de vimentina no compartimento estromal também a co-expressão de vimentina e SV40-LT no tumor individual células. Em contraste, em tumores de baixo grau de WAP-T (Figura 4C) e vimentina expressão de SV40-LT é restrita a estromais e epiteliais tumorais compartimentos, respectivamente. Tumores cultivados a partir de células G-2 transplantados (Figura 5A) recapitulou as características distintivas dos tumores de alto grau WAP-T (Figura 5B), ou seja, uma proporção moderada de células co-expressando KRT14 e Krt8 /18. Em contraste, em tumores de baixo grau de WAP-T Krt8 /Krt18 e KRT14 são frequentemente co-expressos (Figura 5C).

(A-C) imagens confocais representativos de Tumor-se criosseções de uma célula L-2 tumor -derived (a), e um alto grau (B) e um baixo grau (C) endógena tumor WAP-T coradas com anti-vimentina (verde) e 8/18 anticorpos anti-queratina (vermelho). Os núcleos foram corados com DRAQ5 (azul). As inserções de potência são utilizados para exibir a co-expressão de vimentina e queratina 8/18 em L-2 e tumores de grau elevado WAP-T. As linhas tracejadas brancos marcar estruturas do estroma. As 3D pilhas confocal foram deconvoluídos usando Huygens software Essencial e reconstruído com o software Imaris. Barra de escala: imagem principal: 30 mm; Ampliação: 3 um

(A-C) imagens confocais representativos de Tumor-se criosseções de um L-2 tumor derivado de células (A), um alto grau de (b) e um de baixa. grau (C) do tumor endógeno WAP-T coradas com anti-vimentina (verde) e anticorpos anti-SV40-LT (vermelho). Os núcleos foram corados com DRAQ5 (azul). As inserções de potência são utilizados para exibir a co-expressão de vimentina e SV40-LT em G-2 e de tumores de grau elevado WAP-T. As linhas tracejadas brancos marcar estruturas do estroma. As 3D pilhas confocal foram deconvoluídos usando Huygens software Essencial e reconstruído com o software Imaris. Barra de escala: imagem principal: 50 mm; Ampliação: 6 um

(A-C) imagens confocais representativos de Tumor-se criosseções de um L-2 tumor derivado de células (A), um alto grau de (b) e um de baixa. grau (C) do tumor endógeno WAP-T coradas com anti-queratina 8/18 (verde) e 14 anticorpos anti-queratina (vermelho). Os núcleos foram corados com DRAQ5 (azul). As inserções de potência são utilizados para exibir a co-expressão da queratina 8/18 e queratina 14 em G-2, de alta qualidade e tumores de baixo grau de WAP-T. As 3D pilhas confocal foram deconvoluídos usando Huygens software Essencial e reconstruído com o software Imaris. Barra de escala: imagem principal: 50 mm; ampliação:. 6 um

Em uma experiência adicional, 10

6 células G-2 foram transplantadas para almofadas da moda de dois ratos /c não-transgênicas BALB. Em ambos os ratinhos grandes, tumores sólidos cresceram após 4-6 semanas. Interessantemente, as células tumorais foram largamente desprovida de marcadores epiteliais, EpCAM (Figura S2A) e citoqueratinas (Figura S2B, D), mas fortemente vimentina expresso (Figura S2B, C), que indica que na transição ratinhos não transgénicos para o estado mesenquimal é favorecido, possivelmente como uma consequência de uma interacção com o sistema imune do hospedeiro. À medida que as células tumorais continuem a exprimir WAP-promotor de SV40-LT (Figura S2C), é provável que a diferenciação de células mesenquimais nestes estava incompleta.

c) expressão dos genes de perfis.

A histomorfológica semelhança entre G-2 e de células transplantados tumores WAP-T indica que estes tumores pode também estar intimamente relacionada, a nível molecular. Com base na expressão comparável de proteínas CIF, nós também espera uma estreita relação entre as células G-2 em cultura e no G-2 tumores. Para testar essas hipóteses, realizamos perfil de expressão microarray. O ARN total a partir de L-2, L-2C9 e G-2C11 células, a partir de dois G-2 tumores transplantados, bem como a partir de quatro tumores WAP-t-NP8 representam quatro tipos histológicos (G1-G4) foi analisada numa micromatriz Affymetrix plataforma (MOE430 2.0). Aplicando como critérios de significância do corr. P-value (Benjamini-Hochberg) = 0,05, e uma dobra mudança de corte 3, que identificou 250 genes que foram diferencialmente expressos entre cultura de células e as amostras do tumor (Tabela S1). Apertar os critérios estatísticos a um corr. Valor P = 0,01, apenas 24 genes satisfez estes critérios rigorosos. Os 250 genes diferencialmente expressos foram analisados ​​pelo programa de expansão, no fim de identificar categorias sobre-representados GO (ontologia gênica) e (fator de transcrição) TF sítios de ligação nas suas

cis

regiões -regulatory [27]. A análise GO-enriquecimento foi combinado com agrupamento hierárquico, e os resultados são apresentados no mapa de calor mostrado na Figura 6A. Um número significativo de genes expressos diferencialmente se enquadra na categoria de genes de defesa imunológica, o que reflecte o facto de que os tumores contêm um certo contingente de células imunitárias, que está ausente em cultura de células. O enriquecimento de genes relacionados com os processos imunitários correlaciona-se bem com a sobre-representação de sítios para Elf1 ligação, um factor de transcrição altamente expressa em células linfóides [28], nas regiões promotoras dos genes diferencialmente expressos (P-valor 0,001) . Por outro lado, as amostras de cultura de células distinguem-se por uma maior expressão dos genes associados com a regulação da transcrição, v.g.

Foxa2

,

FoxM1

,

Gata6

,

Hoxb2

,

Jmjd2c

,

Ppargc1a

, e

Tle1

e processos de desenvolvimento, por exemplo,

Bmp4

que está envolvida na diferenciação de células mesenquimais. Esta observação pode ser explicada pela adaptação da rede transcricional das vias de sinalização e para a célula condições de cultura. Tomados em conjunto, a análise de expressão gênica demonstraram que G-2 células e tumores exibir mais semelhanças do que diferenças em seu programa de expressão gênica; as diferenças estão essencialmente relacionados com o seu contexto biológico diferente.

(A) 250 genes expressos diferencialmente em células L-2 cultivadas e endógeno WAP-T ou G-2 tumores derivados de células (Tabela S1) foram usadas para gerar um mapa de calor. Categorias GO enriquecidos são mostrados como diagramas de barras correspondentes a grupos de genes maiores ou menores expressas no respectivo grupo de amostra. Codificação de cores e a altura de uma barra representa a significância estatística (-log

10 (valor-p)) do enriquecimento observado das respectivas categorias GO. (B) Os genes característicos para luminal-ER

+, luminal-ER

– e basal /células mioepiteliais foram usados ​​para gerar mapas de calor. dados de expressão de gene obtidos por cultura de células (G-2, G-2C9 e células L-2C11) e amostras de tumor (dois G-2 tumores transplantados e quatro tumores WAP-t-NP8 representam quatro tipos histológicos) foram utilizados para esta análise. intensidades de expressão de genes de uma glândula mamaria de um ratinho BALB /c de paridade (50 dias após o desmame) foram usadas como referência. agrupamentos de genes proeminentes (

KRT14

,

Vim

,

KRT5

,

Krt18

, e

ESR1

) são destacadas por caixas amarelas . Os valores de expressão são codificados por cores: vermelho – alta expressão, azul – baixa expressão

O Hotel Calculado que a análise de expressão de genes deve ajudar a localizar G-2 células dentro da hierarquia de células epiteliais mamárias.. Usando uma lista de genes característica de luminal-ER

+, luminal-ER

-, e basais /células mioepiteliais [29] (Tabela S1), e o perfil da glândula mamaria de um ratinho BALB paridas a expressão do gene /c rato (50 dias após o desmame) como uma referência, a análise hierárquica de agrupamento novamente revelou semelhança entre cultura de células e as amostras do tumor (Figura 6B). Além disso, um programa de transcrição complexo que inclui muitos genes de todas as três linhagens tornou-se óbvio. Notavelmente,

ESR1

(que codificam para estrogênio receptor alfa) está dentro de um conjunto de regulada para baixo “luminal-ER

+” genes,

Vim

(que codifica para vimentina) no cluster de genes não regulada,

KRT14

está localizado no aglomerado de genes regulados positivamente “basais”, enquanto

KRT5

em conjunto com um número de outros genes formam um aglomerado de regulada para baixo ” basais “genes, consistente com a ausência de expressão KRT5 em G-2 culturas de células e a ocorrência rara de células KRT5-postive em tumores WAP-T (dados não apresentados). Com base nesta análise, concluímos que o transcriptoma de células G-2 provavelmente está relacionada com células comprometidas com luminal-ER

– diferenciação. Essas células poderiam ser progenitores da luminal-ER

– células, que durante o compromisso perdeu a expressão de marcadores de destaque, como

ESR1

e

KRT5 viajantes – genes funcionalmente ligadas luminal-ER

+ e linhagens de células basais, e tornou-se imortalizado por proteínas SV40. No entanto, clarificação final da sua identidade requer mais estudos.

stemness de células G-2 e seus derivados clonais

O alto potencial tumorigénico do G-2 células nos levou a estudar suas propriedades em CSC mais detalhes. Foi realizada uma série de ensaios padrão para medir a expressão de um conjunto de marcadores de superfície celular, a auto-renovação, e geração de descendência fenotipicamente diferente (actividade de repovoamento denominados colectivamente), actividade de aldeído desidrogenases, e formando colónia potencial.

a) marcadores da superfície celular.

a expressão de certas proteínas da superfície celular associados, como integrinas e proteínas ancoradas a GPI, é diagnóstico de células-tronco mamárias normais e células-tronco do câncer de mama. Por FACS observou-se que quase todas as células L-2 expressar o CD29 marcadores relacionados com stemness (integrina beta 1) [30] (Figura 7A) e de CD44 (receptor de hialuronato) [31] (Figura 7B). Uma grande fracção de G-2 células são positivas para EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) [31], [32] (Figura 7C, esquerda), que é co-expresso com proteínas CD24a e CD49f (alfa de integrina 6) [30] [33] – [35] (Figura 7C, à direita). Outra marcadora associada a progenitora mamária, CD61 (integrina beta 3) [36], foi detectada em grande fracção de L-2 células (Figura 7D, à esquerda) e também é co-expressa com CD24a e CD49f (Figura 7D, direita) . Portanto, designadas colectivamente por a fracção de células L-2 que co-expressam estas proteínas associadas a membrana celular como CD24a

alta subconjunto. Variações que variam de -30% para -90% no número absoluto de células neste subgrupo foram observadas entre as células e clones parentais G-2 (dados não mostrados). Em seguida, observou-se que a contrapartida da CD24a

alta subconjunto (Figura 7E, à esquerda) é caracterizada pela expressão do Sca1 marcador de células estaminais [37] (Figura 7E, à direita). Tomados em conjunto, a cultura G-2 compreende dois grandes subconjuntos distintos, CD24a

alta /Sca1

baixa e CD24a

baixo /Sca1

alta. SV40 transgene é igualmente transcrito em ambos os subgrupos, mas a transcrição de genes e KRT14 Krt18 é maior em CD24a

/Sca1

células de baixa elevados (Figura S3A, B). Observou-se também pela análise qPCR que

Cd24a

,

Cd49f

e

Sca1

genes são transcritos em ambos os subconjuntos (Figura S3C).

(A, B) FACS representativos dot tramas que apresentam a expressão de CD29 (a) e CD44 (B) em G-2 em cultura de células. (C) FACS representativos dot parcelas que mostram a expressão de EpCAM (C, à esquerda) em cultura de células G-2 e a distribuição de CD24a e CD49f (C, direita) no seio da população celular de alta EpCam

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