Abstract
aberrante citosina 5-metilação subjaz muitos elementos desregulamentados de câncer. Entre os cânceres de pulmão de células não pequenas (NSCLC) emparelhados, buscou-se a perfis de ADN características 5-metil-citosina que podem fundamentar a desregulamentação do genoma. Em um dos interrogatórios mais densas do methylome, foram amostrados 1,2 milhões de locais CpG 20-4 do tumor de NSCLC (T) -non-tumoral (NT), utilizando pares de uma restrição de enzimas sensíveis à metilação com base ensaio AJUDA-microarray. Encontramos 225,350 diferencialmente metilados (DM) sites em adenocarcinomas
contra
tecido não tumoral adjacente que variam em frequência através do compartimento genômica, particularmente notável em corpos de genes (GB; p 2,2E-16). Além disso, quando DM foi acoplado a transcriptoma diferencial (DE) nas mesmas amostras, 37056 loci diferencial no adenocarcinoma emergiu. Aproximadamente 90% das relações DM-DE eram não-canónica; por exemplo, o promotor de DM associado com DE na mesma direcção. Das mudanças canônicas observou, promotor (PR) loci DM com alterações recíprocas na expressão em adenocarcinomas incluídos
HBEGF
,
AGER
,
PTPRM
,
DPT
,
CST1
,
MELK;
DM GB loci com alterações concordantes na expressão incluída
FOXM1
,
FERMT1
,
SLC7A5
, e
genes FAP
. analisa IPA mostrou promotor específico do adenocarcinoma DMxDE sobreposição identificada familiares nós câncer de pulmão [
TP53
,
Akt
], bem como os nós menos familiares [
HBEGF
,
NQO1
,
GRK5
,
VWF
,
HPGD
,
CDH5
,
CTNNAL1
,
PTPN13
,
DACH1
,
SMAD6
,
LAMA3
,
AR
]. Os resultados originais deste estudo incluem a descoberta de numerosos candidato Os resultados originais deste estudo incluem a descoberta de inúmeros sites de metilação candidato em ambas as regiões PR e GB não previamente identificados no NSCLC, e muitos relacionamentos não-canônicos a expressão do gene. Estas características de metilação do DNA poderiam ser desenvolvidos como de risco ou de diagnóstico biomarcadores, ou como alvos candidatos para agentes preventivas ou terapêuticas mais recentes metilação direcionados para um local
Citation:. Mullapudi N, Ye B, Suzuki M, Fazzari M, Han W, Shi MK, et ai. (2015) Genome largas Methylome Alterações no câncer de pulmão. PLoS ONE 10 (12): e0143826. doi: 10.1371 /journal.pone.0143826
editor: Osman El-Maarri, da Universidade de Bonn, Institut of Experimental Hematologia e Medicina Transfusional, Alemanha |
Recebido: 18 Agosto, 2015; Aceito: 10 de novembro de 2015; Publicação: 18 de dezembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Mullapudi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability: Dados relevantes pode ser encontrado na Financiamento GEO repositório-GSE315520, GSE 31552.
: Este trabalho foi financiado pelo NCI 1rc1 CA145422-01 (SDS); 1K24-CA139054-01 (SDS); Fundação Herbert Stony-Wold (NM); 1R01-CA180126-01 (SDS Co-PI); P30 CA013330 (Albert Einstein Cancer Center núcleo de subvenção)
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O câncer de pulmão é responsável pela maior número de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos [1]. O cancro é caracterizado por alterações em todo o genoma em CpG metilação, incluindo uma hipometilação generalizada todo o genoma (perda de metilação) incluindo pelo oncogenes, e hipermetilação recíproca em determinados loci (aumento da metilação), incluindo promotores de gene supressor de tumor [2,3]. Estudos recentes têm mostrado que a consequência funcional da 5-metilação da citosina é dependente do contexto genómico e a sequência específica em que ocorre [4,5]. A metilação de resíduos de CG CG dentro ilhas (CGI) em promotores de genes está associado com o silenciamento do gene. No entanto, a metilação de CGI dentro de corpos de gene encontra-se a ser associada com a expressão específica de tecido e activação de genes nos genomas de cancro [6-8].
Painéis de genes bem conhecidos supressores tumorais candidato foram examinados em clínica espécimes de cancro do pulmão para caracterizar promotor-metilação [9,10], dando origem a assinaturas de metilação concisos [11], bem como para distinguir os diferentes sub-tipos histológicos [12]. mudanças de metilação ocorrer cedo durante o desenvolvimento de cancro do pulmão [13] e, portanto, podem ser utilizados como marcadores de previsão para detectar potenciais malignidades [14,15]. Assim, a identificação de marcas de metilação discriminatórias pode ser transformado em ensaios de diagnóstico para auxiliar na avaliação de risco e diagnóstico.
metilação do DNA pode ser medida por métodos específicos, tais como seqüenciamento bissulfito (tBGS) [16], methylation- PCR específico (MSP) [17], e métodos baseados em espectrometria de massa (Epityper
®) [18]. Cada ensaios plataforma específica para um local metilação com maior resolução, no qual um painel definido de genes pode ser avaliado para o estado de metilação de um seleto número de resíduos de CpG dentro deles. No entanto, estes métodos dependem do conhecimento prévio dos loci epigenômico específica para a concepção do ensaio.
Entre os métodos de descoberta para detectar padrões de metilação em uma escala de todo o genoma, uma abordagem é empregar enzimas de restrição isoschizmer metilação-sensíveis e resistentes ( HELP, RLM, outros). Outras abordagens incluem a imunoprecipitação da cromatina com anticorpos de ligação ao ADN metilado (MBD, MEDIP, outros), ou sequenciação de bissulfito de um componente reduzida do genoma (RRBGS, outros) [19]. Cada um desses métodos tem seus próprios preconceitos e pela necessidade de escala, amostras apenas um pequeno subconjunto do methylome humano. Whole sequenciação do genoma bisulfite [20] destina-se a densa consultar toda a methylome em resolução específica da base única. No entanto, atualmente, este método é muito caro e analiticamente intensivo para executar em grandes tamanhos de amostra.
Estudos recentes têm avaliado metilação do genoma do cancro do pulmão para descobrir assinaturas tumor metilação específica de genomas do câncer [13,21,22] . Selamat
et al
[23] usou a plataforma Illumina Infinium HumanMethylation27k para caracterizar a metilação do genoma de ~ 27.000 locais de CpG em 59 amostras de adenocarcinoma T /NT pulmão combinados, e acoplado que a matrizes transcriptoma. perfilamento molecular abrangente de 230 pacientes (adenocarcinoma) e 178 pacientes (carcinoma de células escamosas) por TCGA [24,25] fez uso de uma versão expandida da mesma plataforma, HM450k, que interroga mais de 480.000 locais de CpG, entre as ilhas e costas CpG no genoma humano.
Nossa hipótese é que um tumor de todo o genoma imparcial vs pesquisa não tumor para loci diferencialmente metilado vai levar à identificação de loci novos e conhecidos desregulamentado no cancro do pulmão. Além disso, investigar os mesmos espécimes para a expressão diferencial de genes iria permitir a identificação de maior DM loci impacto, em virtude do potencial impacto sobre a expressão. Para testar essas hipóteses, foi utilizada a ajuda do ensaio [26] para analisar a metilação CpG de 24 pares de tumor (T) e não-tumoral (NT) amostras humanas adjacentes. Este ensaio consulta fragmentos definidos pelo motivo 1200000 CCGG em todo o genoma por enzimas de restrição
Hpa II (metilação sensível) e
Msp
i (resistente à metilação) para isolar fragmentos diferencialmente metilados do genoma. Estes fragmentos são então ligados e adaptador-amplificado e marcado, após o que eles são co-hibridada com um micro-arranjo de alta densidade. A metilação é detectada nas extremidades dos fragmentos gerados por enzimas (sites CCGG) e medido como proporção do
Msp
I-gerados fragmentos
fragmentos gerados II Hpa
. Raciocínio que genes desregulados-metilação pode ser mais aparente se a expressão cognato /gene próxima é alterada, examinamos ainda mais a associação de diferencialmente metilados (DM) regiões com genes diferencialmente expressos (DE), usando dados de expressão de mRNA do mesmo emparelhado T e NT amostras de ressecção cirúrgica.
resultados
pesquisa Genome-wide de loci diferencialmente metilados em tumores de pulmão versus não-tumor
Entre 24 NSCLC doadores de ressecção pulmonar (S1 Tabela), usando o ensaio AJUDA-microarray identificou-452,754 fragmentos Hpall significativamente diferencialmente metilados (DM; p 0,05, FDR corrigidos) em relação ao lado do tumor não-tumoral (Quadro 1). Desses sites DM, 57% foram encontrados em regiões (que compreendem 38% desses sites CCGG representados na matriz) codificação. (Figura 1) Outra 39% destes foram encontrados em regiões intergénicas (48% daqueles locais representados na matriz) e foram principalmente hypomethylated em tumores. Aproximadamente 7% foram encontradas nas regiões do promotor (26% desses sítios na matriz). promotores de genes (PR) e organismos de genes (GB) mostrou tanto hiper e hipo-metilação. (Tabela 1). Promotor hipometilação excedeu hipermetilação em número (Tabela 1). Com base em um teste de permutação realizados utilizando amostragem aleatória dentro de compartimentos (PR /GB /IG) descobrimos que loci DM são significativamente sobre-representados nas regiões do corpo gene (p 2.2e-16).
452754 loci são significativamente diferencialmente metilada (MS) entre T e NT baseado em um FDR 0,05. Maioria dos loci DM são hypomethylated em T vs NT.
(A) Cerca de 91% dos 1,2 milhões de loci representadas no microarray AJUDA estão localizados no corpo gene (GB) e intergênico (IG) regiões, com uma pequena minoria (9%) do loci localizado dentro de promotores (PR). (B) A significância estatística (eixo dos Y) versus delta (eixo-X) (amplitude) da MS. Delta (eixo X) indica a diferença na metilação entre tumor (T) vs não tumoral (NT) em um dado local. Loci hipermetilado em T em relação ao NT têm delta 0. P-value (eixo Y) é calculada com base Benjamini Hochberg ajustado FDR. No FDR p 0.05, 433.505 loci em todos os compartimentos genômicos são encontrados para ser diferencialmente metilado em T vs NT. Os pontos vermelhos indicam estatisticamente significativa loci DM.
A magnitude da metilação diferencial (delta) variou compartimento ea direção da mudança. Moderados /grandes graus de hipermetilação DM no PR e GB (delta 1; PR = 74%, GB = 63%) eram mais comuns do que as pequenas graus (1 Delta 0,5; PR = 24%, GB = 33%) de hipermetilação alterações nestes compartimentos (Fig 2). A magnitude de alterações grandes /hipermetilação moderados foram distinta da de hipometilação mudanças, em que a ampla distribuição moderada /por região genómica foi PR = 12%, P = 14%, IG = 17%. Dentro promotores de tumor, ilhas CG (CGI) e margens CG (CGS) foram mais frequentemente do que hipermetilado hypomethylated (Fig 2B). distribuição global dos loci DM variou por localização genómica PR (CGI, CGS, outro) entre todas as histologias NSCLC (qui-quadrado p = 2,2E-16) e entre o adenocarcinoma somente (ChiSquare1.9E-4). Houve DM substancial fora da CGI e CGS.
(A) Todos NSCLC histologia DM foi classificado como insignificante, pequena ou moderada com base no valor absoluto. (1 abs delta 2 é moderada /Grande; 1 abs delta 0.5 é pequeno; 0,5 abs delta 0 é insignificante). loci DM FDR com p 0,05 com base no emparelhado t-teste foram consideradas para esta análise. A maioria dos tumores em hipermetilação verifica-se ser de grande magnitude moderada /em promotores de genes e órgãos, enquanto que nas regiões intergénicas, pequenas alterações são mais frequentes. A maioria de hipometilação verifica-se ser de pequena magnitude em todos os três compartimentos. Uma fracção significativa de hipometilação alterações são de grandeza insignificante ainda estatisticamente significativa. (B) Direção de MS e a distribuição dentro promotores categorizados com base na localização dentro CG-ilhas e CG-shores. Dentro da categoria de loci promotor DM, hipermetilação é mais frequente em tumores, em comparação com hipometilação para os loci dentro CG-ilhas e CG-shores. diferenças globais DM variam por localização genômica PR (CGI, CGS, outros); todos histologia NSCLC foram qui-quadrado p = 2,2E-16; só de adenocarcinoma histologia qui-quadrado p = 1.9E-4.
genes do cancro indivíduo identificado por metilação diferencial
A 25 loci diferencialmente metilado superior dentro de regiões promotoras e organismos genes estão listados (S2 Mesa). Em resumo, para todos os histologia foi observado DM combinado em muitos promotores (S2A Tabela) [hipermetilação em
C7orf54
,
DARS
,
SPTAN1
,
DOM3Z
,
PCNX
,
CTNNAL1
, outros; hipometilação em
NQO1
,
SIRP1B
,
UNC5CL
,
NFIA
,
CST1
, outros] e em corpos de genes [hipermetilação em
NOL10
,
ARHGEF12
,
UST
,
RGS3
,
MBNL2
, outros; hipometilação
FBXL7
,
RYR2
,
NTRK3
,
ADAMTS12
,
PARK2
, outros]. Para adenocarcinoma especificamente, DM foi observada em promotores [hipermetilado
RASL12; SPTAN1
,
mir-26a
, hypomethylated
NQO1
,
SIRPB1
,
NF1A
] e corpos de genes [hipermetilado
AKAP13
,
família ANK
,
PRKCE
,
ROS1
; hypomethylated
FAM171A1
,
PARK2
,
BCAS3
,
RHOJ
] e muitos outros.
mapas de calor do top 50 mais diferencialmente loci metilado dentro do subconjunto de adenocarcinomas (Fig 3A e 3B)
(a) as regiões do promotor; e (B) as regiões do corpo do gene. Vários genes mostram metilação diferencial (DM) em mais de um locus e aparecer várias vezes no mapa de calor. . Azul = Não Tumor, Red = Tumor
O top 50 mais loci DM (FDR ajustado p 0,05, classificados por magnitude do delta), refletem a separação de T e NT na maioria das amostras pareadas , exceto nas amostras 603T, 653T e 542T. Vários loci no mesmo gene show de DM, resultando na recorrência de nomes de genes nos mapas de calor. Aqueles loci múltiplos dentro de um gene (por exemplo, PR:
TMEM88
,
GIMAP6
,
RUSC2
, outros; GB:
CDH13
,
CACNA203
,
NOMO3
, outros) tendeu a ser concordantes, embora imperfeita, com a direção do DM (hiper vs hipometilação).
CpG validação metilação
a estados de metilação de três representante loci DM CCGG escolhido com base na magnitude DM (um no promotor de DARS e dois no promotor de RGS3) foram quantitativamente determinado pelo alta resolução Sequenom MassARRAY
® método, e em comparação com os resultados do ensaio baseado em microarray de ajuda para usar software de correlação da ordem de Spearman [27]. A correlação (rho) foi de 0,72 (p = 0,0006), indicando que os resultados do ensaio de ajudar significativamente correlacionados com os resultados de referência da Sequenom MassARRAY
® ensaio de referência (S1 Fig)
Identificação de classificadores discriminatórias
A precisão média para top 100 ou superior tumor loci 25 DM contra modelos de classificação não-tumorais, todos histologia NSCLC em conjunto, foi de 87% e 90%, respectivamente. No subconjunto de dados adenocarcinoma, a precisão média das top 100 e top 25 loci DM foi de 80% e 79% respectivelyIn geral, os modelos de classificação tendem a ser mais específico do que sensível. (Tabela S7). Dois loci (
LOXL4
e
LINC00841
) foram selecionados repetidamente dentro do top loci DM durante o processo de classificação.
A metilação x Expression Mesclar
loci DNA foram integrados com dados de mRNA transcriptoma microarray gerados anteriormente entre os 21 pares T-NT em que ambos os conjuntos de dados estavam disponíveis. (S2 Fig). Esta análise resultou em n = 433666 MS loci em todos os compartimentos (Tabela 2). Por exemplo, todas as histologias pooling, identificamos n = 75 loci que mostrou hipermetilação em regiões PR e concomitante regulação negativa da expressão de mRNA por microarranjo. Havia n = 219 loci dentro das regiões GB que mostrou hipermetilação concorrente e up-regulação da expressão.
Todos os histológicos (21 pares).
A distribuição subcompartimento específico do promotor (CGI , CGS, outros) das relações DMxGE canônicos (
e
g
hipermetilação do promotor:.. gene para baixo-regulação)
contra
relações não-canônicos (
e
g
hipermetilação do promotor:.. gene-regulação) é exibido na figura 4. no geral, dentro das regiões PR, padrões CGI tendia a seguir DM canônica: padrões GE (primeira barra de cada um dos mais à esquerda dois trios gráfico de barras dentro de um painel) um pouco menos frequentemente do que os outros compartimentos promotor. Notável é que o DM não canónicas: DE relações eram aproximadamente igual em frequência global de relações canónicos, como avaliado por esta análise. Para todos os 21 pares (todos os histologia NSCLC, Fig 4A), a distribuição global de diferenças DMxDE variam por localização genômica PR (CGI, CGS, outros), qui-quadrado p = 3.32E-4. Da mesma forma, dentro do conjunto de adenocarcinomas (Fig 4B), diferenças globais DMxDE variam por localização genômica PR (CGI, CGS, outros), qui-quadrado p = 1,10E-7. A maioria dos PR DM loci estão associados a hipermetilação quando os loci DM estão dentro ilhas CG. Este efeito é notável entre os adenocarcinomas subconjunto bem, onde a DM hipermetilado loci em ilhas CG são na sua maioria associados com a regulação negativa do gene.
Análise de loci DM dentro de regiões promotoras e sua sobreposição com a expressão diferencial de genes. (Painel esquerdo A) Todos os 21 pares (todos histologia NSCLC), diferenças globais variam por localização genômica PR (CGI, CGS, outros), qui-quadrado p = 3.32E-4.
(Painel direito B)
Dentro do conjunto de adenocarcinomas diferenças globais variam por localização genômica PR (CGI, CGS, outros), qui-quadrado p = 1,10E-7. Maioria dos loci promotor DM estão associados a hipermetilação quando o loci DM estão dentro ilhas CG. Este efeito é mais pronunciado entre os adenocarcinomas, em que os loci de DM em ilhas CG estão principalmente associados com a regulação negativa do gene. CHAVE: “H” = metilação, “E” = expressão. seta para cima indica aumento e seta para baixo indica diminuição.
O número de loci obtida a partir de sobreposição de expressão-metilação é exibida em coordenadas 3D no painel A (S3 Fig). coordenadas genômicos também foram exibidas por parcelas Circos; um exemplo do cromossomo 3 é exibido no painel B (S3 Fig). Estes painéis denotar os padrões gerais de corpo gene e metilação do promotor e do gene que acompanham as mudanças de expressão. A sobreposição entre DM e GE para GB foi mais frequente que PR (em parte devido à relativa sobre-representação da GB
contra
regiões PR no microarray HELP (Tabela 1). O padrão canônica mais freqüentemente vista em GB foi hipometilação e para baixo-regulação (S3 Fig).
Exemplos da relação quantitativa de DM à GE em promotores e órgãos de genes são exibidos em lotes selecionados de dispersão (S4 FIG). a maioria dos genes que eram qualitativamente canônico para a relação DM⬄GE mostrou uma relação quantitativa ambíguo (não apresentado);. aqueles genes que são selecionados para a exposição que exemplificam uma relação canônica
os oito melhores diferencialmente expressos (dE) genes associados com loci promotor DM (S3 tabela:
FILIP
,
HBEF
,
TMEM88
,
VWR
,
CASP12
,
NQO1
,
CST
,
XAGE1D
) foram submetidos a uma verificação quantitativa de mudanças de expressão GE baseada em microarrays, utilizando qRT-PCR dimensionada para
GAPDH
empregada interna. S5 Fig exibe esses resultados, mostrando concordância geral de direção de GE entre as duas plataformas (microarray e qRT-PCR;
r
2
= 0,9367815, p 0,0007), embora com uma gama dinâmica comprimida dos dados de microarrays, como é típico na literatura [28].
genes individuais reveladas por DM x GE mesclar
Todos os histologia NSCLC
: sobreposição de DM x dE sobreposição (S3 Tabela) produziu loci DM genómico adicional com padrões de expressão canônicos (
e
g
PR hipermetilação:.. mRNA reprimidos e hipometilação PR: mRNA regulada; GB hipermetilado: mRNA upregulated e hypomethylated: mRNA subregulado) [PR n = 113; GB N = 3,972] (Tabela 2). Notável loci PR hipermetilado com recíproca diminuição da expressão GE eram
HBEGF
,
DPT
,
AGER
,
SPARCL1
,
PTPRM
,
ARHGEF6
,
TMEM88
,
SEMA6A
. Aqueles PR hypomethylated loci com o aumento da GE foram
NQO1
,
CST1
,
TNS4
,
FUT2
,
MELK
,
FAM83A
,
MMP9
,
e SLCO1B3
. Aqueles loci GB com metilação concordante e expressão incluídos: hipermetilado /aumento GE:
FERMT1
,
SLC7A5
,
FAP
,
KRT15
,
ETV4
,
TFAP2a TPX2
,
FOXM1
; hypomethylated /diminuiu GE:
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8
,
ABCB1
,
SEMA5A
,
GPM6A
.
dentro da categoria de adenocarcinomas sozinho, incorporamos os resultados do DM com dE, e descobriu vários loci com metilação diferencial de promotores ou organismos de genes e alterações de expressão de genes cognatos. loci hypermethylated PR com a GE downregulation incluem
RPL23AP32
,
CTNNAL1
,
HBEGF
,
TMEM88 e CASP12
. Loci mostrando hipometilação PR e regulação positiva incluem
NQO1,
CST1
,
XAGE1D
,
IGKC e AIM2
. GB loci mostrando hipermetilação e regulação positiva incluem
FAP
,
NLN
,
TPX2
,
e KIF26B
e outros. GB loci mostrando hipometilação e downregulation incluem
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8 * Comprar e outros ( S3 Tabela)
relação
a metilação-Expressão em CG-ilhas e CG-shores
Nós questionaram a associação entre DM e dE para loci DM localizado dentro do promotor ilhas CG (CGI) e margens CG ( CGS; definido como 2 kb a montante de uma ilha CG; Figura 4; S5 tabela). Observou-se apenas uma pequena porcentagem de locos (3-11%) que exibiu DM dentro de CGI ou CGS associado à mudança esperada na gene-expressão do gene mais próximo. Estes incluem genes tais como
TMEM88
,
S1P1R
,
FZD4
,
GIPC2
,
DNAJB4
,
ADAMTS1
(hipermetilado em CGI e CGS e reprimidos) e BUB1 (hypomethylated e regulada).
analisa Pathway
Um resumo tabular de IPA análises é oferecido em S6 Table. Todos os loci MS (Bejamini-Hochberg adj p 0,05), correspondendo a oito categorias (com base no compartimento genómico, histologia e com /sem intercalação de expressão de genes) foram analisados separadamente utilizando IPA, para identificar as redes de gene enriquecida dentro dos conjuntos de loci de DM. Em todos os oito casos, “Câncer” foi superior a doença associada com o conjunto de dados de entrada, embora os genes constitutivos eram diferentes. vias canônicas da base de conhecimento da Ingenuity que foram encontrados para ser enriquecido dentro dos conjuntos de genes com adj. p 0,05 são relatados. Três das redes (Todos os histologia NSCLC, DM somente, GB; Adenocarcinomas DM somente, GB; e adenocarcinomas DM + DE ambos, PR) entre as oito categorias foram encontrados para ter uma associação estatisticamente significativa com uma via canonical com adj. p 0,05, e são ainda descritas abaixo.
Redes relacionadas com o cancro do IPA representações.
Análise de Redes dessas redes significativas tabulados no S6 tabela estão resumidas no S6 Fig. Os monitores mostram que vários genes que desempenham um papel importante nas vias relacionadas ao câncer são diferencialmente metilado em T em relação ao NT em diversas categorias, e destaca alguns genes que não são conhecidos para fazer isso. Por exemplo, reunindo todos os histologia NSCLC, S6A Fig mostra a rede relacionada ao câncer derivado de IPA de todos os loci DM (adj p . 0,05) dentro GB em todos os pares de 24 T /NT. Genes como
EZH2
,
CDH1
,
CDKN2A
e
DNMT3A /3B
são encontrados em pontos centrais nessa rede.
EZH2
(hypomethylated) é um membro da família Polycomb-grupo e desempenha um papel importante na proliferação de células, o crescimento, progressão do ciclo celular, invasão e a repressão transcricional.
DNMT3A
/3B (hipermetilado) codifica um ADN metil-transferase que é suposto para realizar metilação de novo e tem um papel importante na sinalização repressional transcricional.
CDH1
(hipermetilado) codifica a caderina-E, uma molécula de adesão de superfície conhecido reprimidos em cancros. CDKN2A (hipermetilado) é um inibidor da quinase CDK4 e é um gene supressor de tumor significativa, conhecido por ser mutado ou eliminado em diferentes tipos de cancro.
ZEB1
, GB hypomethylated, também é destacada como um nó central nesta rede relacionada ao câncer. Ele codifica um factor de transcrio de dedo de zinco (também conhecido como
TCF8
) que é conhecida por ser um indutor da transição epitelial-mesenquimal em NSCLC [29].
Dentro da categoria dos adenocarcinomas especificamente ( 16 pares S6B Fig mostra a rede relacionada ao câncer gene identificado a partir da mais significativa (p ajustado 0,05). DM loci (dentro GB) Um hub central desta rede é o gene
AR
(receptor andrógeno), que for considerada GB hypomethylated em tumores. Ar é um factor de transcrição activado por o androgénio hormona esteróide. Ela desempenha um papel importante no crescimento celular, a proliferação, a morte celular e invasão. Devido a uma central aparente nesta rede DM particular, exploramos ainda mais o padrão de DM metilação do AR no que se refere ao sexo. observou-se que os dois fragmentos relevantes DM (dentro GB) foram notáveis por hipermetilação em GB nos homens em comparação com as fêmeas em NT tecido exclusivamente (t-teste FDR, fragmento 1 = 0,041, fragmento 2 = 3.76E-5). Supervillin
(SVIL)
, é também um gene de cada cubo desta rede (Fig S6B), e é GB hypomethylated em tumores.
SVIL
é uma proteína de membrana periférica que regula a motilidade celular, espalhando e é conhecido para aumentar a sobrevivência celular através da interacção com o gene supressor tumoral p53 e os seus alvos a jusante [30]. Específica Adenocarcinoma
promotor DM x dE sobreposição se destacar familiarizado (
SMAD6
,
TP53
,
CTNNB1
,
NQO1)
, assim como nós IPA câncer de pulmão não familiares ( Fig S6C). A rede relacionada ao câncer derivadas desta análise consistia de um único gene promotor hypomethylated (NQO1) no nó de um cluster de interagir com
TP53
,
HSP70 e NPM1
. Vários promotores de genes hypermethylated incluindo
HBEGF
,
SMAD6
,
PTPN13
,
CDH5
e
SFTPC
foram encontrados na periferia a rede. Esta rede é composta de vários genes que não são identificados como DM do nosso estudo, mas não fazem parte da rede, por força de suas interações publicados anteriormente com outros loci DM, como descrito em formas abertas /as brancas.
Current vs ex-fumantes
O conjunto de amostras de 24 indivíduos foi constituída por 11 ex-fumantes e 10 fumantes atuais. Nós investigamos a presença de loci diferencialmente metilado com base no status de fumar. No ajustada p 0,05, não loci foram encontrados para ser DM entre fumantes e ex-
Discussão
Nós relatamos uma pesquisa de comparação methylome para um conjunto de tumores NSCLC
contra
o tecido não-tumoral emparelhado em amostras de ressecção cirúrgica, a fim de identificar as assinaturas de metilação do genoma do cancro do pulmão, e filtrá-los para os pertinente para alterações na expressão do gene a partir das mesmas amostras. O objetivo é informar o trabalho de diagnóstico biomarcador já em curso no laboratório, [31] e identificação de alvos para o desenvolvimento futuro em ensaios terapêuticos de diagnóstico e de prevenção /[32,33].
Usando o ensaio HELP, fomos capazes de consultar 1200000 descontínua loci CCGG (~ 1% do methylome) em uma forma representativa de todas as regiões de três genómico (PR, GB, Ig). Usando um p 0,05 como ponto de corte, 452.754 loci em todas as regiões e histológicos mostram metilação diferencial estatisticamente significativa em tumores. A distribuição desses sites DM foi notavelmente mais concentrada em corpos de genes do que em regiões promotoras, mesmo considerando variações representação regional no microarray detector, como apoiado por um teste de permutação.
Os estudos até agora têm tipicamente focada em metilação do promotor no cancro do pulmão, utilizando microarrays concentrou-promotor personalizados [10,15,34] ou matrizes talão [23,35] e, portanto, muitas vezes consulta apenas para regiões genômicas pré-selecionados e loci. Este é um dos poucos estudos realizados até à data em que mais agnostically examina metilação do genoma em todas as regiões do genoma do câncer de pulmão em várias amostras. As regiões do genoma ensaiadas pelo ensaio de ajudar são dependentes das ocorrências de sítios CCGG dentro do genoma, e não por qualquer classificação funcional ou compartimento-sábio antes dos loci. O ensaio é AJUDA menos tendencioso promotor (regiões GB e IG são representados regiões promotoras 3,5x vezes), permitindo, assim, para a descoberta de novos eventos associados com a metilação em outras regiões genómicas em amostras de tumores [36]. No entanto, o ensaio de AJUDA falha não-CCGG incorporados locais de CpG, bem como aqueles CCGGs que definem uma gama de tamanhos fora da gama de tamanho de fragmento-alvo (200-2000bp). HELP (ao contrário de matrizes Infinium HM) não está focado na detecção CpGs contíguos de promotores de genes pré-definidos. Embora a magnitude das diferenças DM globais entre tumores e tecidos de pulmão não tumorais em um locus dado tenderam a ser pequenas (geralmente 2 vezes), assegurando-se que a validação dos loci DM pré-seleccionados são favoravelmente comparados com a técnica de referência quantitativa ( Sequenom MassARRAY
®).
ao examinar as listas de genes de topo loci DM descoberto dentre outros estudos genômicos publicados no câncer de pulmão para os relatados em nosso estudo, descobrimos que, como esperado, o grau de sobreposição entre os nossos estudos e outros é modesta, possivelmente indicativa das diferenças na plataforma de ajuda (que detecta fragmentos delimitadas por sites individuais CpG, mas não adicionais locais CpG fragmento-interno), e as regiões alvo consultados (que em ajudar são igualmente distribuída entre PR, GB, e IG regiões do genoma. Além disso, notamos que a extensão da sobreposição entre os estudos que usaram a mesma metilação à base de microarray (por matriz por exemplo Infinium) ([23,24,35] também não foi grande. Isso pode ser resultado de vários fatores assunto e heterogeneidade da amostra e critérios utilizados para classificar DM loci. Por exemplo, Sandoval
et al
[35] identificou um
HOXA7 e região entre os top mais variados promotores CpG, enquanto que o mesmo locus não é relatada no estudo TCGA [24] que utiliza a mesma plataforma. Por outro lado, ambos os estudos relatam metilação diferencial do
HOXA9
lócus. Ambos os loci não figuram nas listas de loci DM topo do nosso estudo
constatações gerais desta estudo incluem que:. Há muitos DM indivíduo loci /genes, particularmente em corpos de genes (Tabelas S2 e S3 ); há muitos relacionamentos DMxDE não-canônicos; e genelists e relações de rede incluem tanto o anteriormente reconhecido e uma miríade de loci não reconhecida anteriormente. Como reconhecido anteriormente, o genoma é em geral mais hypomethylated, mas também exibe hipermetilação do promotor no câncer contra tecidos não-cancerosas emparelhados, como era verdade desde estudos genômicos iniciais de metilação diferencial no câncer de pulmão [2,21-23].