Abstract
Fundo
heparanase humano desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no gene heparanase (Qstream) foram mostrados para ser correlacionada com câncer gástrico. O presente estudo examinou a associação entre SNPs individuais ou haplótipos em Qstream e susceptibilidade, os parâmetros clínico e prognóstico do câncer gástrico em uma grande amostra da população Han, no norte da China.
Metodologia /Principais Achados
O ADN genómico foi extraído de amostras de tecido, fixado em formalina e embebidas em parafina normais gástricas de 404 pacientes e 404 a partir de sangue de controlos saudáveis. Seis SNPs foram genotipados por dessorção /ionização espectrometria de laser assistida por matriz de tempo de fuga em massa. A qui-quadrado (χ2) de teste e regressão logística não condicional foram usadas para analisar o risco de câncer gástrico; um teste Log-rank e Cox modelo de riscos proporcionais foram usados para produzir análise de sobrevivência e um método de Kaplan-Meier foi utilizado para mapear as curvas de sobrevida. As taxas de sucesso de genotipagem médios foram mais do que 99% em ambos os grupos. Haplótipo CA no bloco composto por rs11099592 e rs4693608 tinha uma distribuição maior no grupo de tipos Borrmann 3 e 4 (P = 0,037), no grupo de um maior número de metástases dos nódulos linfáticos (N3 vs grupo N0, P = 0,046), e, além disso, foi correlacionada com a sobrevivência pobre (CG CA vs: HR IC = 0,645, 95%: 0,421-0,989, P = 0,044). Além disso, os genótipos rs4693608 TT AA e rs4364254 foram associados com pior sobrevida (P = 0,030, HR = 1,527, IC 95%: 1,042-2,238 para AA rs4693608; P = 0,013, HR = 1,546, IC 95%: 1,096-2,181 para rs4364254 TT). Não houve correlação entre SNPs ou haplótipos individuais e risco de câncer gástrico.
Conclusões /Significado
Um haplótipo funcional em Qstream foi encontrado, que incluiu os rs4693608 importantes SNP. SNPs em Qstream desempenhar um papel importante na progressão do cancro gástrico e sobrevivência, e talvez pode ser um marcador molecular para valores de prognóstico e tratamento
citação:. Li AL, Song YX, Wang Zn, Gao P, Miao Y, Zhu JL, et ai. (2012) Polimorfismos e um haplótipo em heparanase Associações de genes com a progressão e prognóstico do câncer gástrico em uma população chinesa do Norte. PLoS ONE 7 (1): e30277. doi: 10.1371 /journal.pone.0030277
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 13 de outubro de 2011; Aceito: 12 de dezembro de 2011; Publicação: 20 de janeiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation da China (No. 30972879 e No. 81172370), um Fundo de Investigação especializada para o Programa de Doutorado da Educação Superior (nº 200.801.590.006) e da Fundação de Ciência Natural da província de Liaoning (No. 20.092.129). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum em todo o mundo e segunda maior causa de mortalidade por câncer [1]. Apesar dos avanços no diagnóstico e tratamento, o prognóstico para pacientes com câncer gástrico avançado permanece sombrio [2]. Além disso, o cancro é uma doença gástrica de interacções gene-ambiente e factores genéticos desempenham um importante papel na tumorigénese e progressão [3]. Portanto, a descoberta e aplicação de biomarcadores incorporados com diagnóstico tradicional câncer, estadiamento e prognóstico poderia ser considerado a melhor opção para o controle desta doença com risco de vida [4].
Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram pensados para ser biomarcadores atraentes na avaliação de risco de câncer, triagem, armazenamento temporário, ou de classificação [5]. Além disso, o genoma humano é composto de uma série de “blocos de haplótipos ‘, que são associações não aleatórias de alelos devido ao desequilíbrio de ligação (LD) e que é possível explorar uma vasta quantidade de informação considerando estes blocos de haplótipos [6], [7 ]. Embora a aplicação da análise de SNP indivíduo tem sido limitada até agora, estudo de associação à base de haplótipo tem sido proposta como uma abordagem poderosa e abrangente para identificar a variação genética causal subjacente a doenças complexas [8], [9].
A heparanase é a enzima de mamífero conhecida apenas que degrada sulfato de heparano (HS) proteoglicanos na membrana basal e da matriz extracelular [10]. Isto leva a desmontagem das barreiras extracelulares, libertação de factores bioactivos HS-ligados e geração de fragmentos SH que promove a ligação do receptor do factor de crescimento e de sinalização [11], [12]. Heparanase está fortemente associada com a progressão do cancro e metástases, incluindo a sobrevivência celular, invasão, proliferação, neovascularização, e a criação de um microambiente crescimento permissiva [13], [14] e que tem ambas as aplicações terapêuticas e de prognóstico [15]. O gene de heparanase (Qstream), clonada pela primeira vez em 1999, está localizado no cromossoma 4q21.3 [16]. Há poucos estudos sobre SNPs no gene Qstream. estudos epidemiológicos moleculares mostraram diferenças de distribuição em SNPs em Qstream em várias populações judaicas de Israel [17]. Associações a susceptibilidade do tumor também foram demonstrados, incluindo malignidades hematológicas e cancro gástrico, mas os resultados não foram concordantes [18] – [20]. Além disso, Shirley Ralphand [21] tem mostrado um haplótipo Qstream foi correlacionada com estágios em carcinoma de ovário e Yue et al. [20] SNPs têm mostrado foram correlacionados com os parâmetros clínico e taxa de sobrevivência. Especificamente, o estudo indicou que SNPs em Qstream foram associados com níveis de expressão de heparanase e forneceu a base para novos estudos sobre a associação entre SNPs e doenças [22]. No entanto, estes estudos de associação foram limitados a pequenas amostras.
Recentemente, Hennig G [23] e no Corno H [24] observadas altas taxas de genotipagem de detecção (93,5% e 94-97%) e uma taxa de concordância perfeita de 100% com ADN extraído a partir de tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina normais (FFPETs) em comparação com o ADN da linha germinal com dessorção /ionização por espectrometria de laser assistida por matriz-tempo de voo de massa (MALDI-TOF MS). Além disso, outros relatórios também demonstrou elevadas taxas de detecção de genotipagem e uma taxa de concordância perfeita com DNA FFPET derivado, incluindo blocos de décadas de idade em comparação com o sangue do mesmo indivíduo usando outros métodos, mesmo em genotipagem do genoma [25] – [28]. Foi apurado que o DNA FFPET derivado foi suficiente para análise de polimorfismo genético. No presente estudo, foi utilizada uma grande coleção de amostras de DNA FFPET derivadas de pacientes e DNA derivado do sangue dos controles em um método MALDI-TOF MS ao genótipo e estudar as possíveis associações entre seis SNPs (rs4693602, rs6856901, rs4364254, rs11099592 , rs4693608 e rs4328905) ou haplótipos em Qstream e tumor susceptibilidade, os parâmetros clínico e sobrevivência de câncer gástrico com uma grande amostra da população Han, no norte da China. Como resultado, SNPs individuais e um haplótipo foram encontrados para mostrar associações com a progressão e prognóstico do câncer gástrico.
Resultados
características Assunto
A idade média foi de 56,67 ± 11,923 y ea percentagem de machos foi de 70,54% no grupo caso. A idade média do grupo controle foi de 56,91 ± 11,477 y ea percentagem de machos foi de 70,54%. Não houve diferença distribuição por sexo e idade entre os pacientes e controles (p = 1,00 para ambos os sexos e idade). Dos 404 pacientes, fase I casos de câncer gástrico foram responsáveis por 21,0% (85/404), fase II casos de câncer gástrico foram responsáveis por 26,5% (107/404) e fase III casos de câncer gástrico foram responsáveis por 52,5% (212/404) ( tabela 1).
taxas de sucesso de Genotipagem
Nós utilizados software MassARRAY Tipos Analyzer 4.0.4.20 para o processamento de espectros automatizados e identificação de genótipos. Perfis representativos de MALDI-TOF-MS de cada genótipo dos seis SNPs em Qstream foram mostrados na Figura S1. Todos os SNPs foram polimórfica com menor frequência do alelo 10% e distribuições de genótipo foram todos de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (dados não mostrados). taxas de sucesso elevadas, variando entre 96,29% e 100% (média: 99,09%) no grupo FFPETs e entre 99,50% e 100% (média: 99,79%) no grupo de controlo, foram mostrados (Tabela S1)
as associações entre SNPs individuais e os parâmetros clínico e sobrevivência
as freqüências alélicas e genotípicas nos seis SNPs não foram significativamente diferentes entre pacientes e controles (P 0,05 e P 0,05 depois de um teste de permutação para freqüências alélicas; P 0,05 e P 0,05 após ajuste por sexo e idade para freqüências genotípicas;. Tabelas S2 e S3)
SNPs foram avaliados para associações com os parâmetros clínico. genótipos rs4364254 foram associados com graus histológicos (p = 0,002; Tabela S4), o genótipo TT foi correlacionada à diferenciação celular bem em comparação com o genótipo TC /CC (OR = 0,482; 95% CI: ,300-,774). Outros SNPs não tinha correlações significativas para os parâmetros clínico.
Na análise univariada, os pacientes portadores do genótipo rs4693608 AA apresentaram sobrevida específica para o câncer gástrico baixa comparado com pacientes com o genótipo AG + GG (p = 0,049, HR = 1.387 , IC de 95%: 1,001-1,923; Tabela 2, Figura 1 e Figura S2). Na análise multivariada, o genótipo rs4693608 AA eo genótipo rs4364254 TT ambos tiveram uma sobrevivência pobres gástrica específica ao câncer (P = 0,030, HR = 1,527, IC 95%: 1,042-2,238 para rs4693608; P = 0,013, HR = 1.546, 95% IC: 1,096-2,181 para rs4364254; Tabela 2). Além disso, o tipo Borrmann (P 0,001), a categoria pT (P 0,001), categoria pN (P 0,001), e a invasão linfática (P 0,001) foram significativamente correlacionados com a sobrevivência na análise univariada. Tipo de Borrmann (P = 0,021), a categoria pT (P 0,001), e a categoria pN (P 0,001) permaneceu significativamente correlacionada com a sobrevivência na análise multivariada (Tabela 2)
Os resultados mostram que a taxa de sobrevivência acumulado de. 381 casos com câncer gástrico foram associados com os diferentes genótipos rs4693608 no gene Qstream.
Presença de um haplótipo relacionada com as características clínico-patológicas e sobrevida
Houve dois dois-marcador blocos de haplótipos construídos entre as seis SNPs em nossos resultados (Figura 2). Bloco 1 foi composto por rs4693602 e rs6856901 e continha três haplótipos comuns (faixa de freqüência: ,025-,850), o que representou cerca de 99,9% dos sujeitos; bloco 2 foi composto por rs11099592 e rs4693608 e também continha três haplótipos comuns (variação de frequência: 0.091-0.798), que representaram aproximadamente 99,9% dos indivíduos. Todos os seis haplótipos comuns não teve correlação com o risco de câncer gástrico (P 0,05 e P Tabela S5; 0,05 depois de um teste de permutação)
A: estrutura do gene Qstream.. caixas a cheio representam os exões 13 (5 ‘→ 3’). As setas mostram os locais de SNPs. B: Mapeamento da estrutura do bloco de seis SNPs gerados por Haploview. O valor dentro de cada quadrado na trama triângulo representa a correlação de pares entre os SNPs (medido como D ‘) definido pelo laterais superior direito da Squares superior esquerdo e. As Praças sem um número correspondem a D ‘= 1. O sombreamento representa a magnitude ea importância do LD em pares, com um gradiente de vermelho para branco refletindo maior para valores mais baixos LD. A frequência de cada haplótipo comum dentro de um bloco é para o lado do haplótipo.
As associações entre haplótipos em Qstream e câncer gástrico características clínico-patológicas no momento do diagnóstico foram avaliadas. Haplótipo CA no bloco 2 teve maior distribuição no grupo de Borrmann tipos 3 e 4 em comparação com haplótipos TG + CG (P = 0,037; Tabela 3). Foram observadas diferenças de distribuição haplótipo na categoria pN (P = 0,045; Tabela 3), CA tinha uma maior distribuição no grupo N3 que o grupo N0 comparação com CG (OR = CI 1.837,95%: 1,010-3,341, P = 0,046 ), mas não houve diferenças significativas entre distribuição da N2 e grupos N0 e entre o N1 e grupos N0 (P = 0,671 e P = 0,496, respectivamente).
os haplótipos de bloco 2 indicou uma diferença significativa na sobrevivência relacionado com o tumor. Os pacientes portadores do haplótipo CA tiveram uma sobrevida específica do câncer gástrico pobres (CG vs CA: HR = 0,645, IC 95%: 0,421-0,989, P = 0,044; Tabela 4).
Discussão
Como já sabíamos, DNA FFPET derivado tem menor eficácia de extração e qualidade (DNA fragmentado) devido ao ácido nucleico cross-linking parcial e degradação do DNA derivado do sangue. Mas FFPETs arquivados fornecer uma fonte inestimável para estudos de genética molecular com várias vantagens, tais como (i) o único tipo de amostras disponível para indivíduos que não podem de outra forma fornecer uma amostra de DNA, (ii) um excelente recurso para estudos de biomarcadores retrospectiva em larga escala, ( iii) um grande número de amostras conjuntas com dados de acompanhamento clínicos de longo prazo, (iv) um recurso valioso no diagnóstico e identificação histológica, (v) um recurso disponível a partir de arquivos de patologia. Recentemente, DNA FFPET-extraído foi relatado para ser adequada para a genotipagem, e foi permitido para biomarcadores e estudos de genômica funcional [23] – [29].
MALDI-TOF MS método, oferecendo aproximadamente 100% de precisão para SNP genotipagem, é actualmente considerado como um padrão ouro [29], [30]. Genotipagem de DNA FFPET derivado por MALDI-TOF MS tem sido provado ser fiável e reprodutível. Anteriormente relatos mostraram que não havia diferenças de frequências alélicas entre ADN-FFPET derivados e ADN derivado do sangue a partir do mesmo indivíduo através de vários métodos, incluindo MALDI-TOF MS [24] – [26], [28]. Nossos esforços mostraram altas taxas de sucesso que variam entre 96,29% e 100% (média: 99,09%), que estavam de acordo com os dados comunicados anteriores [23], [24], [29]
SNPs são estavelmente herdada. , muito abundantes e mostrar a diversidade dentro e entre populações, que são pensados para ser biomarcadores atraentes. No entanto, a aplicação de SNPs individuais tem sido limitada porque eles são baixos penetrância e os seus efeitos são relativamente difíceis de identificar [5], [31]. Por conseguinte, a importância de uma informação de haplótipos foi aumentando para ligar ADN variação de sequência com a doença [32]. Artigos relataram que SNPs funcionais em Qstream foram associados com diferenças de expressão de heparanase e heparanase foi mostrado para ser intimamente envolvido no processo patológico, progressão e evolução da doença [10], [22]. Como incorporar SNPs, no entanto, em estudos sobre predisposição ao câncer gástrico e prognóstico e como determinar as verdadeiras associações ainda são tarefas desafiadoras.
Não houve SNPs individuais associados ao risco de câncer gástrico em nossos resultados. As associações entre quatro SNPs individuais (rs4328905, rs4693608, rs11099592 e rs6856901) e risco de câncer gástrico com 155 pacientes e 204 controles relatados por Yue et al. [20] foram de acordo com os nossos resultados. Além disso, todos os seis haplótipos comuns não apresentaram diferenças significativas no risco de câncer gástrico. Essa consistência mostrou SNPs em Qstream não teve correlação com a incidência de câncer gástrico em étnica Han chineses do norte, não só do ponto de vista de SNPs individuais, mas também a partir da perspectiva de haplótipos.
Em nosso estudo, o genótipo rs4364254 TT foi correlacionada à diferenciação celular também. Além disso, Ostróvski et ai. [22] encontraram indivíduos com genótipo TT possuía níveis de mRNA relativamente elevados (P = 0,0029). No entanto, tem havido resultados conflitantes relatadas quanto à associação entre a expressão heparanase e diferenciação histológica. Endo K et al. [33] descobriram que a diferenciação histológica foi pior nos tecidos heparanase de mRNA-positivo câncer gástrico (p 0,01). Chen et ai JQ. [34] descobriram que a diferenciação histológica não foi relacionada com a expressão do mRNA heparanase no câncer gástrico (P = 1,000). Takaomi Ohkawa et ai. [35] demonstraram que a expressão de heparanase foi detectado como mais forte em células bem diferenciadas (P = 0,0277), o que é uma descoberta que consistents com os nossos resultados. Portanto, heparanase podem estar envolvidos na diferenciação celular, mas os mecanismos não são claros no momento
Na análise univariada, pacientes portadores do genótipo rs4693608 AA teve uma pior sobrevida (P = 0,049).; Na análise multivariada, AA rs4693608 e rs4364254 TT ambos foram significativamente correlacionados com pior sobrevida (P = 0,030 para AA rs4693608 e P = 0,013 para rs4364254 TT). Possivelmente, a ausência de consenso na análise uni e multivariada foi devido ao efeito fraco do SNP individual, mas quando o SNP indivíduo foi considerado em conjunto com o outro SNP, tipo de Borrmann, categoria pT e categoria pN na análise multivariada, gerada uma influência sobre o prognóstico. Há ampla evidência para sugerir que os fatores genéticos contribuem para o processo da doença em doenças característica complexa comuns, mas o efeito de uma única variante é provavelmente pequena [36]. Além disso, Ostróvski et ai. [37] fornecida uma primeira evidência de correlação entre SNPs rs4693608 funcionais e rs4364254 e risco de doença aguda enxerto-versus-hospedeiro desenvolvimento (GVHD), e o rs4693608 foi o mais importante. Seus resultados foram de acordo com a nossa. Além disso, Ostróvski et ai. [22] relataram tanto rs4364254 genótipo TT e também genótipo AA rs4693608 foram correlacionados com um nível de mRNA relativamente alta (P = 0,0029 e 0,004, respectivamente), o que pode explicar parcialmente um pior prognóstico em pacientes com AA rs4693608 ou rs4364254 TT no presente estudo . Estas observações foram biologicamente plausível, porque a sobre-expressão de Qstream estava intimamente associado com maior capacidade de invasão de câncer gástrico [38] – [40]. Os resultados deste estudo demonstraram a nossa presunção de que SNPs foram envolvidos na regulação da expressão de heparanase, afetando assim a capacidade de invasão e sobrevivência no cancro gástrico.
Apesar de nenhum genótipo rs11099592 CC nem rs4693608 AA mostrou diferença estatística no tipo de Borrmann, haplótipo CA composta com eles mostrou uma diferença significativa. Haplótipo CA tinha uma maior distribuição no grupo de tipos Borrmann 3 e 4 (p = 0,037). Talvez pacientes com haplótipo CA eram mais propensos a desenvolver um tipo geral mais pobre. Além disso, haplótipo CA tinha uma maior distribuição no grupo N3 (P = 0,046, comparado com o grupo N0). No entanto, não houve diferenças significativas entre a distribuição e os grupos N0 N2 e entre os grupos e N1 N0. Talvez houvesse uma associação entre CA haplótipo e um maior número de metástases linfáticas, mas precisa de um estudo mais aprofundado. Além disso, os pacientes portadores do haplótipo CA também mostrou baixa sobrevida gástrica específicos de câncer, o que era consistente com as diferenças no tipo de Borrmann e número de metástases linfáticas. Além disso, Ostróvski et ai. [22] relatou que o genótipo rs11099592 CC eo genótipo rs4693608 AA foram correlacionados com alta expressão de mRNA (P = 0,0167 e P = 0,004, respectivamente), que estavam de acordo com os nossos resultados sobre CA. haplótipo Talvez o risco absoluto associado com cada um dos SNPs foi baixa, mas a análise de haplótipos combinada pode ser mais útil na identificação de indivíduos em risco elevado de progressão da doença. Talvez fosse haplótipos específicos que desempenham um papel significativo na invasão câncer gástrico e metástase, afectar ainda mais o prognóstico.
Um bloco haplótipo funcional composto por rs11099592 e rs4693608 foi encontrado em nossos resultados, que foi associado com o tipo de Borrmann, pN categoria e prognóstico do câncer gástrico. Por um lado, o SNP rs11099592 é um A-L substituição SNP nonsynonymous localizado no exon 8 e esta alteração resulta na substituição de uma arginina-para-lisina na posição 307, talvez, conduzindo a uma diferença funcional na proteína. Por outro lado, rs4693608 SNP está localizado no intrão 3 e mostraram uma correlação com a sobrevivência. Quantidades crescentes de evidências indicam que as variantes genómicas em sequências não codificadoras podem alterar a expressão de produtos de genes, alterando a regulação de genes, de splicing exão, a estabilidade do mRNA, críptico activação locais de splicing e assim por diante, que podem, portanto, causar fenótipos da doença. Além disso, haplótipos podem fornecer informações mais relevantes do que SNPs individuais [7], [41]. Além disso, se a transcrição de genes, a manutenção da diferenciação celular e a indução de um fenótipo metastático invasiva são devidas à interacção directa com o ADN de heparanase ainda está para ser demonstrado.
Ostróvski et ai. [22] mostrou importante associação entre os genótipos combinados para rs4693608 e rs4364254 SNPs e nível de expressão de mRNA heparanase. Além disso, eles dividiram todos os genótipos combinados em três subgrupos (expressão LR-baixo, MR-intermediário de expressão, expressão HR-alta) de acordo com heparanase nível de cada genótipo expressão do mRNA, e eles confirmaram diferenças significativas entre os três subgrupos de portadores de genótipos combinados e mRNA níveis. Além disso, Ostróvski et ai. [37] primeiro encontraram correlações entre os genótipos combinados para rs4693608 e rs4364254 SNPs e risco de desenvolvimento de GVHD aguda em seu estudo seguinte com este subgrupos método de análise. É um método importante e valioso. Além disso, este método é útil para a previsão de risco associado com a abordagem de haplótipos em conformidade com a prática clínica. Nosso estudo futuro, que ligava nível de expressão de mRNA para genótipos ou haplótipos em Qstream da população Han, no norte da China, usaria esse método.
Uma vez que o tamanho da amostra do tipo selvagem homozigoto foi relativamente pequeno demais para análise estratificada em cada genótipo de todos os seis SNPs investigados em nosso estudo, não pudemos mostrar os resultados de análise de SNP em cada genótipo, mas realizamos análises heterozigoto combinado com o tipo selvagem homozigoto. Foi uma limitação do estudo.
Em conclusão, este estudo avaliou polimorfismos do gene Qstream no câncer gástrico com um método MALDI-TOF MS e FFPETs arquivados em uma grande coorte de caso-controle do norte da China. Encontramos um bloco haplótipo funcional composto por rs11099592 e rs4693608, que foi associado com o tipo de Borrmann, categoria pN e prognóstico; e rs4693608 SNP, que foi incluído no bloco, mostrou uma correlação com a sobrevivência. Estes resultados são apoiados por associações entre SNPs em Qstream e níveis de expressão de mRNA relatado anteriormente por Ostrovsky et al. [22]. Além disso, seis SNPs e haplótipos individuais não foram correlacionados com o risco de câncer gástrico. Estes resultados foram consistentes com a nossa hipótese inicial de que heparanase estava envolvido na invasão e metástase do câncer e afetou o prognóstico, em última instância, mas não estava envolvido na incidência de câncer.
Materiais e Métodos
coleta de Amostra
404 pacientes com diagnóstico histopatológico confirmado câncer gástrico que tinham recebido cirurgia radical entre janeiro de 1998 e dezembro de 2004 foram selecionados consecutivamente. Os pacientes eram do norte da China e foram acreditados para ser bons representantes desta região. 404 amostras de tecido gástrico normais foram obtidos a partir de um segmento dos espécimes ressecados mais distante do tumor ( 10 cm) e FFPETs foram arquivados na Surgical Oncology Departamento do Primeiro Hospital da China Medical University, no norte da China. Todas as amostras foram fixadas e incluídas em condições histológicos e clínicos padrão foram armazenadas à temperatura ambiente. As secções de parafina de FFPETs foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) para inspeção patológica para confirmar a ausência de tecido tumoral. O grau histológico do tumor foi avaliada de acordo com critérios e tumores Organização Mundial de Saúde foram encenadas usando a 7ª edição do TNM da União Internacional Contra o Câncer (UICC) do sistema /Comité Misto Americana do Câncer (AJCC) (2010), com base patológica pós-operatória o exame dos espécimes. dados patológicos completos foram obtidos, incluindo idade, sexo, data da cirurgia, localização do tumor primário, grau histológico, invasão venosa, invasão linfática, profundidade de invasão, número de linfonodos recuperados, número de linfonodos metastáticos, e número de depósitos tumorais recuperados. Aqueles (i) com tumores malignos sincrônicos ou metacrônicos, (ii) com metástases à distância encontrada no pré-operatório, (iii) que foram submetidos a radioterapia pré-operatória ou quimioterapia, ou (iv) com entradas de dados patológicos incompletos foram excluídos deste estudo. Follow-up foi completado para toda a população do estudo em janeiro de 2010. Dois pacientes morreram no pós-operatório e 21 pacientes foram perdidos durante o acompanhamento, portanto, 381 pacientes foram incluídos na análise de sobrevivência. Mediana e média períodos de acompanhamento foram 90,0 meses e 93,3 ± 20,24 meses (variação: 61-136 meses), respectivamente. Os seguintes dados foram obtidos para todos os pacientes: data da morte (se aplicável), causa de morte (se aplicável), e data de follow-up. O endpoint primário foi a duração de sobrevida causa específica a partir da data do diagnóstico de câncer gástrico para a data da morte. A taxa de sobrevida em 5 anos dos 404 pacientes foi de 54,2%.
404 amostras de sangue foram obtidos de indivíduos sem câncer que foram selecionados aleatoriamente com base em exames físicos no mês de dezembro de 2009 a agosto de 2011, como o grupo de controle, e este grupo se acreditava ser uma boa representação da população na região norte da China. Os critérios de selecção incluíram nenhuma história individual de câncer, a frequência correspondente aos casos sobre sexo e idade e indivíduos eram independentes chineses Han étnicas. As amostras (etileno-diamino-tetra-acético [EDTA] anticoagulate) foram armazenados a -20 ° C no decurso de 30-40 minutos, e depois transferida para um congelador a -80 ° C dentro de 2 ou 3 dias após a sua recolha.
o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da China Medical University, China. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes antes de participar no estudo.
DNA extração
O DNA genômico foi extraído de amostras FFPET no grupo caso. As secções com uma espessura de 8 um e uma área superficial de até 250 mm
2 foram preparados com um micrótomo e o ADN foi isolado a partir de 6 a 12 partes, dependendo da dimensão do tecido e as contagens de células. O micrótomo foi limpo e as lâminas foram alterados para evitar a contaminação intersample. a extracção do ADN a partir de FFPETs foi realizada com DNA QIAamp® FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) [29], seguindo os procedimentos descritos pelo fabricante, incluindo (i) dissolver parafina em xileno e remover, (ii) lise da amostra sob desnaturação condições com proteinase K, (iii) inverter a formalina reticulação de incubação a 90 ° C, (iv) de ADN de ligação à membrana e permitir que os contaminantes fluam através, (v) lavar os contaminantes residuais, e (vi) eluir o ADN puro e concentrou-se a partir de a membrana (com tampão de tris-EDTA [TE]). Cerca de 2-10 ug de ADN foi recuperado na solução final e 50 ul foi armazenado a -80 ° C.
O ADN genómico foi extraído de amostras de sangue do grupo de controlo com o ADN genómico Universal Extracção Kit Ver.3.0 (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Cerca de 2-6 ug de ADN foi recuperado em TE e foi armazenado a -80 ° C.
Selecção de SNPs e genotipagem
O estudo incluiu seis SNPs em Qstream, que foram tomadas a partir da banco de dados NCBI SNPs (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) e a base de dados HapMap (a base de dados de Fase III) (https://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.zh ). Estes SNPs foram mapeados no gene Qstream (Figura 2). rs 11099592 foi único, não só com uma frequência menor alelo (MAF) 1%, mas também como polimórfica em Han China Beijing (HCB) da população entre todos os SNPs região codificadora (CSNPs) em Qstream, que foi registrado em bancos de dados. Além disso, outros cinco SNPs foram localizadas em regiões intrónicas e 3′-UTR. Além disso, outros investigadores demonstraram que rs11099592, rs4693608, rs4364254 e foram correlacionadas com a expressão de ARNm de heparanase [22]. Além disso, as associações entre SNPs individuais ou haplótipos em Qstream e susceptibilidade, os parâmetros clínico e prognóstico do tumor relatado nestes artigos era complexo, mas a maioria concentrada nas seis SNPs foram selecionados [17] – [22].
SNPs foram genotipados utilizando o sistema de MALDI-TOF MS (MassARRAY; Sequenom, San Diego, CA, EUA) com os iniciadores e sondas (Tabela S6), como descrito anteriormente [29], [42]. Para garantir a qualidade de digitação, amostras positivas 1% (estirpe de células Yanhuang) foram incorporados em cada prato genotipagem para validar a fiabilidade dos primers e 1% de amostras negativas (água sem DNA) para monitorar a contaminação. 5% das amostras aleatórias foram testados em duplicado, por diferentes pessoas e a reprodutibilidade foi de 100%. O pessoal do laboratório estavam cegos para a disposição das amostras durante o processo. Havia seis etapas, incluindo a amplificação PCR, tratamento com fosfatase alcalina de camarão, extensão base, remoção de sal com resina, SpectroCHIP distribuição (Sequenom, San Diego, CA, EUA), e dados aquisições com MALDI-TOF MS de acordo com Justenhoven et al. [43]. Finalmente, a análise dos dados foi realizada utilizando software MassARRAY Tipos Analyzer 4.0.4.20 (Sequenom, San Diego, CA) [44].
determinação bloco LD e haplótipo construção
Haploview 4,2 software foi utilizado para avaliar LD e construir haplotipos [31]. LD entre os seis SNPs usados na análise de haplótipos foi medida por estatística a D pares ‘. A estrutura do bloco de LD foi examinada utilizando o método de Gabriel et al. [45], usando os limites de 80% de confiança de D ‘para definir locais de recombinação histórica entre SNPs. Haplótipos foram construídos a partir de dados do genótipo no painel de controle de caso a full-size dentro de blocos usando um método algoritmo expectativa de maximização acelerado [46]. Resumidamente, esse método cria estimativas de frequência população altamente precisos dos haplótipos faseada com base na probabilidade máxima determinada a partir da entrada unphased [47].
A análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando as Estatísticas PASW 18,0 (SPSS, Inc., Somers, Nova Iorque, EUA). Um teste de dois lados do qui-quadrado (χ2) foi utilizado para estimar características de distribuição da população, comparar diferenças de freqüências alélicas e genotípicas entre casos e controles e avaliar a associação entre SNPs individuais e os parâmetros clínico. Um procedimento de permutação (1.000 testes) foi utilizado para corrigir o valor P de resultados de associação para um local único. odds ratio (OR) e intervalos de confiança (IC; 95%) foram calculados por regressão logística incondicional para analisar a associação entre freqüências genotípicas e risco de câncer gástrico, e foram ajustados para sexo e idade. análise de sobrevida univariada e multivariada foram realizadas com o teste log-rank e Cox modelo de riscos proporcionais usando os parâmetros clínico-patológicos e SNPs. Isto resultou na identificação de co-variáveis que se correlacionaram significativamente com a sobrevivência dos pacientes. A análise multivariada foi realizada pela adição separadamente as variáveis SNP a todos os parâmetros clínico. Um método de Kaplan-Meier foi utilizado para mapear as curvas de sobrevida. O pacote de software 4.2 Haploview foi usado para: estimativa de pares de desequilíbrio de ligação (LD), detectar partida do equilíbrio de Hardy-Weinberg, construir haplótipo e calcular frequências dos haplótipos e associações estimam entre haplótipos e risco de câncer gástrico. O software Haplo.states foi usado para avaliar associações entre haplótipos e características clínico-patológicas [31]. O software THEsias baseado em riscos proporcionais de Cox sobrevivência de regressão na análise de associação de haplótipos baseia-usando o algoritmo estocástico-EM foi usada para produzir a análise de sobrevivência de haplótipos [48]. Agradecemos também o Colégio da China Medical University para obter assistência técnica em experiências.