Abstract

Fundo

Apesar do progresso na quimioterapia adjuvante nas últimas décadas, pâncreas e cancros do cólon permanecem causas comuns de morte no mundo. toxinas bacterianas, que se ligam especificamente a glicoesfingolípidos expostos à superfície das células, são uma nova terapia potencial. Foi determinada a expressão de globotriaosylceramide (Gb3Cer /CD77), o receptor da toxina Shiga, em adenocarcinomas pancreáticos e do cólon humano.

Metodologia /Principais Achados

extratos de tecidos lipídicos de pares de cancerígenos e adjacente tecido normal a partir de 21 de pâncreas e 16 pacientes com câncer de cólon foram investigados com camada fina ensaio de cromatografia de camada combinada com uma nova abordagem espectrometria de massa. Gb3Cer /CD77 foi localizado por microscopia de imunofluorescência de criocortes de amostras de tecidos saudáveis ​​e malignas correspondentes. 62% de pâncreas e 81% dos adenocarcinomas do cólon mostraram aumento da expressão Gb3Cer /CD77, ao passo que 38% e 19% do pâncreas maligno e tecido do cólon, respectivamente, não fez, indicando uma associação deste marcador com a transformação neoplásica. Além disso, Gb3Cer /CD77 foi associada com pobre diferenciação (G 2) no câncer de pâncreas (P = 0,039). Análise por espectrometria de massa evidenciado expressão aumentada de Gb3Cer /CD77 com ácidos gordos de cadeia longa (C24) e (C16) curtas em tecidos malignos e apontou para a presença de lipoforms de ácidos gordos hidroxilados, que são propostos como sendo importantes para o receptor de segmentação. Podiam ser detectado em 86% de pâncreas e cerca de 19% dos adenocarcinomas do cólon. Imuno de criosecções tecido indicado tumor-associação desses receptores.

Conclusões /Significado

expressão aumentada de Gb3Cer /CD77 na maioria dos adenocarcinomas pancreáticos e cólon pede consideração da toxina Shiga, a sua subunidade B ou subunidade B-derivados como novas estratégias terapêuticas para o tratamento destas malignidades desafiantes

citação:. Distler L, J Souady, Hülsewig H, Drmic-Hofman I, J Haier, Friedrich AW, et ai. (2009) Shiga Toxina Receptor Gb3Cer /CD77: Tumor-Associação e alvo terapêutico promissor no pâncreas e cancro do cólon. PLoS ONE 4 (8): e6813. doi: 10.1371 /journal.pone.0006813

editor: Georg Häcker, Universidade Técnica de Munique, Alemanha |

Recebido: 30 de março de 2009; Aceito: 22 de junho de 2009; Publicado: August 28, 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Distler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (URL: www.dfg.de) concede FR2569 /1-1 e MU845 /4-1, o Graduiertenkolleg GRK1409 /1 (URL: http: //zmbe.uni-muenster.de/GRK1409 /) ea Deutsche Krebshilfe (URL: www.krebshilfe.de) conceder DKH 106742. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

concorrentes. interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas e cólon são o quarto eo segundo mais frequente causas de mortalidade por câncer no mundo ocidental, respectivamente, representando estimado. 84,250 mortes em 2008, em os EUA sozinhos [1]. Com um período médio de sobrevivência de cerca de 6 meses e taxas 5% fileiras com cancro pancreático, entre as mais letal dos tumores comuns. O prognóstico para pacientes que sofrem de carcinomas do cólon com metástases à distância no momento do diagnóstico é quase tão pobre como para o câncer de pâncreas [2]. Apenas cerca de 10-15% dos pacientes com câncer pancreático são candidatos à cirurgia potencialmente curativa [3], [4], sublinhando a necessidade urgente de desenvolver novas estratégias para o tratamento de pacientes com estes tumores não ressecáveis. terapias orientadas, por exemplo, com base em toxinas bacterianas e vegetais ou anticorpos monoclonais, que reconhecem superfície celular glicoesfingolípidos (GSL), que são sobre-expressas no pâncreas e /ou cancro do cólon, poderia revelar-se abordagens promissoras para terapia adjuvante após a cirurgia [5] -. [9]

GSL, que consiste de uma cadeia de oligossacárido hidrofílica e uma âncora na membrana hidrofóbica ceramida [10], são expressos como componentes integrais de jangadas lipídicas do folheto exterior da membrana plasmática [11]. Além de seu envolvimento na regulação do crescimento celular e adesão celular [12], a superfície exposta celular cadeias de oligossacarídeos de GSLs “servir” como sítios de ligação para as bactérias [13] e são exploradas por diferentes toxinas, incluindo toxinas Shiga (STXS), para a superfície de ligação , tráfico intracelular, e eventos de sinalização [14]. STXS (também denominado verotoxinas), que são produzidos a partir de

estirpes patogénicas de Escherichia coli

[15] – [19], pertencem ao AB

5 família de toxinas bacterianas. Eles consistem de uma enzimaticamente activa A-subunidade que inibe a biossíntese de proteínas, modificando rRNA hospedeiro e uma subunidade B não tóxica homopentameric [20], [21]. O B-pentâmero se liga ao seu receptor preferencial globotriaosylceramide GSL (Gb3Cer /CD77) e desencadeia internalização do AB

5-Gb3Cer complexo de receptor endocitose mediada

via

vesículas revestidas por clatrina [22] ou por endocitose rotas que não envolvem poços revestidos por clatrina [23]. O complexo do receptor de toxina sofre transporte retrógrado através da rede de Golgi para o retículo endoplasmático. Depois de retro-a translocação para o citosol [24], uma molécula do A proteoliticamente processada

1-subunidade pode inibir a síntese de proteínas e matar uma célula.

expressão aberrante de GSL ocorre em quase todos os animais e humanos cancros [12], [25] e muitos antigénios associados a tumores são já conhecidos por serem GSL. A expressão aumentada do receptor de Stx Gb3Cer /CD77 tem sido relatado em diversos tumores sólidos, tais como do ovário [26] e do cancro da mama [27] ou meningiomas malignos [28]. Recentemente, a expressão aumentada de Gb3Cer /CD77 tem sido descrito como correlacionando-se com o desenvolvimento de metástases do cancro do cólon em [9], [29]. Gb3Cer /CD77 também permite a localização da membrana de plasma específico para o tumor de proteínas (e. G. Hsp70) [30]. Como moléculas de superfície celular, GSL associados a tumores são acessíveis a anticorpos ou toxinas GSL-ligação (isto é, Stx), tornando-os alvos candidatos para aplicações oncológicas [31]. Consequentemente, a STX-ligando Gb3Cer /CD77 está atualmente sob investigação como um potencial candidato alvo para terapias à base de toxina [28], [29], [32], [33].

Neste estudo foram analisados pâncreas e tecidos do cancro do cólon para a expressão de Gb3Cer /CD77, utilizando cromatografia em camada fina (TLC) de GSL extractos de tecidos e coloração imuno-histológica de criocortes de tecido. A expressão intensificada de STX-receptores foi detectado na maioria dos tecidos do pâncreas e cancro do cólon, respectivamente, indicando uma associação com transformação neoplásica. Além disso, as modificações estruturais das âncoras de lípidos Gb3Cer associado ao tumor /espécies CD77 foram detectados em tecidos cancerosos de ambos os tipos de tumor, empregando uma nova abordagem espectrometria de massa combinada com TLC imunodetecção [8], [34]. Assim, melhorados de expressão e de lipídios alterações de Gb3Cer /CD77 em carcinomas tornar essa meta um candidato promissor para Stx e /ou STX-construções em aplicações oncológicas dos dois pâncreas e neoplasias do cólon.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o local Comissão de Ética do Conselho Médico da Westfalen-Lippe e da Faculdade de Medicina da Universidade Hospital Münster (Münster, Alemanha) aprovou o estudo atual (número de referência 1IXHai). Todos os pacientes foram informados e consentiram por escrito.

espécimes cirúrgicos

O estudo foi realizado utilizando amostras de pâncreas (n = 21) e cólon (n = 16) adenocarcinomas de pacientes que haviam sido submetidos a cirurgia para os tumores primários [5]. histologia do tumor foi determinada seguindo os critérios da UICC [35]. As características clínico-patológicas da coorte de pacientes com carcinomas são descritos nos quadros suplementares S1 e S2. amostras de tumor foram congeladas rapidamente em azoto líquido imediatamente após a intervenção cirúrgica e armazenado a -80 ° C até serem analisadas. Correspondentes amostras de controlo foram obtidos a partir do mesmo paciente no mesmo local órgão sem envolvimento tumoral macroscópica que foi confirmado por exame histológico.

Preparação de lípidos Extractos de espécimes cirúrgicos

Os tecidos foram homogeneizados e extraída duas vezes com 2 ml de clorofórmio /metanol (1/2, v /v), 2 mL de clorofórmio /metanol (1/1, v /v), e 2 ml de clorofórmio /metanol (2/1, v /v). Os sobrenadantes combinados de cada extracto de tecido (12 ml) foram secos por evaporação rotativa e fosfolípidos foram saponif içados por incubação em 4 ml de solução aquosa de NaOH 1 N durante 1 h a 37 ° C. Após neutralização com 400 mL de HCl 10 N, as amostras foram dialisadas contra água desionizada e secou-se por evaporação rotativa. Os extractos foram ajustadas a volumes definidos de clorofórmio /metanol (2/1, v /v) correspondendo a 0,1 mg de peso húmido por mL.

Purificação de Stx1

Stx1 foi purificado a partir de

E. coli

C600 (H19J) carregando o

STX

1 gene

de

E. coli

O26: H11 estirpe H19 [36]. Em resumo, as bactérias foram desintegradas por sonicação e extraiu-se com polimixina B (3000 U /mL) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha). Após centrifugação, o sobrenadante contendo Stx1 em bruto foi concentrada por ultraf iltração e submetido a cromatografia numa coluna de hidroxilapatite seguido por cromatofocagem [37]. As fracções da coluna contendo Stx1 foram reunidas, dialisadas e armazenaram-se aliquotas a -70 ° C até à sua utilização. Pureza da preparação de Stx1 foi monitorizada por SDS-PAGE, e a integridade estrutural da toxina foi verificada por mapeamento de péptidos utilizando espectrometria de massa [21]. A actividade biológica foi determinada pela citotoxicidade das células Vero [38].

Anti-Gb3Cer /CD77 e anti-stx1 Anticorpos

A preparação ea especificidade do anticorpo anti-Gb3Cer /CD77 policlonal de galinha reconhecendo a Galα1 -4Galβ1-4Glc-resíduo de Gb3Cer espécies /CD77 tenha sido descrita [39], [40]. Stx1 foi detectada com o anticorpo anti-IgG1 de ratinho monoclonal Stx1 109/4-E9b (Sifin, Berlim, Alemanha).

Alto desempenho cromatografia em camada fina (TLC) e GSL Referência

Uma mistura de GSL neutros a partir de eritrócitos humanos, que consistem em monohexosylceramide, lactosilceramida, Gb3Cer /CD77, e globotetraosylceramide (Gb4Cer), foi utilizado como referência [40] para o anticorpo e ensaios de TLC de sobreposição stx1. A nomenclatura dos GSLs segue as recomendações da IUPAC-IUBM de 1997 [41]. GSL de referência e os extractos de lípidos dos tecidos foram aplicados ao gel de sílica suporte de vidro 60 cromatografia em camada fina de alta performance pré-revestidas placas (TLC) (sem 1.05633.0001;. Merck, Darmstadt, Alemanha), com um aplicador automático (Linomat IV, CAMAG, Muttenz, Suíça) e separados em clorofórmio /metanol /água (120/70/17, cada um em vol., com 2 mM de CaCl

2). GSLs de referência foram coradas com orcinol.

TLC Assay Overlay

Gb3Cer /CD77 foi detectado utilizando o anticorpo policlonal de galinha sobreposta ou Stx1 como descrito [40], [42]. anticorpos marcados com fosfatase alcalina primária anti-Gb3Cer /CD77 e secundário (Dianova, Hamburg, Alemanha) foram utilizados em 1:2000 diluições. anticorpos secundários ligados foram visualizados por desenvolvimento de cor com 0,05% (w /v) de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo sal de p-toluidina (BCIP, não 6368,3;. Roth, Karlsruhe, Alemanha). Os cromatogramas imunomarcadas foram lavadas com tampão de glicina e armazenado a -20 ° C. Azul imunopositivas Gb3Cer /CD77-bandas foram quantificados com um scanner de CD60 (Desaga, Heidelberg, Alemanha, software ProQuant

R, versão 1.06.000). quantidades Gb3Cer /CD77 foram determinadas semi-quantitativamente como expressão relativa em comparação com GSL de referência. Os dados densitométricos secundário (ver “Análise Estatística” abaixo) foram utilizados para definir 4 categorias de expressão tumoral em comparação com os tecidos normais por análise de ponto de corte formais: alta superexpressão (categoria I, 4000 x), a sobre-expressão moderada (categoria II, 700 x 4000), expressão de igual (categoria III, -700 x 700), e baixou a expressão (categoria IV, x -700) para o carcinoma de pâncreas e de alta superexpressão (categoria I, 2000 x), a sobre-expressão moderada (categoria II, 200 x 2000), expressão de igual (categoria III, -200 x 200), e baixou a expressão (categoria IV, x -200) para o carcinoma do cólon, respectivamente

a imuno-histoquímica.

coloração imunocitoquímica foi realizada como descrito [8]. Resumidamente, criocortes (4 uM) foram incubados com o anticorpo anti-Gb3Cer /CD77 (01:15) e um anticorpo anti-CD31 (1:200) (IgG1 de ratinho, clone MEM-05, Immunotools, Friesoythe, Alemanha). Os anticorpos que se ligam a Gb3Cer /CD77 e CD31 foram detectados com dichlorotriazinylamino fluoresceína (DTAF) marcado com anti-anticorpo IgY de galinha-(Dianova) e Alexa Fluor 568 conjugado com anti-ratinho IgG (Invitrogen, EUA, CA), diluída 1: 40 e 1:250, respectivamente. Para controlos negativos, imuno-histoquímica foi realizada utilizando soro de frango pré-imune e anticorpos IgG1 irrelevante (Immunotools). ADN nuclear das células foi corada com 4 ‘, 6-diamidinas-2-fenilindole-dicloridrato (DAPI, Sigma-Aldrich, EUA). anticorpos marcados com fluorocromos e núcleos DAPI-coradas foram avaliadas sob um microscópio de fluorescência (Axioskop, Zeiss, Jena, Alemanha), aumento original x 40 (lente objetiva Plan-Neofluar, abertura numérica 0,75), seguindo protocolos publicados [43]. Para confirmar a natureza hidrofóbica do alvo dos anticorpos anti-Gb3Cer /CD77, os lípidos foram extraídos com metanol e clorofórmio /metanol (1/1, v /v) a partir das secções montadas antes da coloração.

Infravermelho laser assistida por matriz Dessorção /Ionização Orthogonal Time-of-Flight (IR-MALDI-o-TOF) Espectrometria de massa

as especificações do espectrômetro de massa IR-MALDI-o-TOF (MDS Sciex, Concord, Ontário , Canadá) e direta TLC-IR-MALDI-MS-análise de bandas imunopositivas do ensaio sobreposição Stx1 TLC foram detalhados por Distler et al. [34]. GSLs foram analisados ​​no modo de iões positivos usando glicerol como matriz.

Análise Estatística

Os dados densitométricos primárias de bandas imunomarcadas Gb3Cer /CD77 e dados densitométricos secundários, obtidos a partir de valores de diferença de pares correspondentes calculados pela subtraindo normal a partir de valores de tecido tumoral relacionados, foram compilados com o pacote de software SPSS, versão 14.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL) para análise estatística não paramétrica. O teste do sinal foi usado para o conjunto de dados densitométricos primárias para examinar o significado da relação entre Gb3Cer expressão /CD77 e transformação neoplásica. O teste da mediana foi realizada para os dados densitométricos primárias e secundárias para testar se Gb3Cer /CD77-expressão foi significativamente diferente entre os tumores que compreendem várias categorias clinicopatológicas. Os coeficientes de correlação foram calculadas para os valores de ordenada dos dados densitométrica primária de tecidos normais e tumorais, respectivamente, e os valores de diferença classificados. τ de Kendall foi utilizado para avaliar o grau de associação entre Gb3Cer /CD77-expressão e classificação histopatológica. Todos os testes foram bicaudais e αwas de 0,05.

Resultados

Nós sondado tecidos de pacientes de adenocarcinoma do pâncreas 21 e 16 de cólon para expressão de receptor de Stx Gb3Cer /CD77 (para a estrutura veja a Figura 1 ). Para este efeito, os extratos de lípidos em bruto e criosecções de pós-operatório pares combinados de

contra

tecidos não afetados adjacentes malignas dos mesmos pacientes foram analisadas por meio da técnica de sobreposição de TLC e microscopia de imunofluorescência. Para obter mais pormenores estruturais de modificações associados a tumores de Gb3Cer espécies /CD77, uma abordagem nova espectrometria de massa foi empregado que combina TLC imunodetecção com IR-MALDI-O-TOF-MS [8], [34]. Os pesos úmidos dos tecidos cancerosos e saudáveis ​​investigados e os dados de patologia correspondentes aparecem nos quadros suplementares S1 e S2.

As alíquotas de extractos lipídicos bruto equivalente a 2 mg peso húmido de tecido normal (N) e do tecido tumoral (t), simultaneamente, foram separados por TLC. GSL neutros de eritrócitos humanos serviu como referência positiva no ensaio de sobreposição (R, 10,8 g) e a mancha de orcinol (O, 16,0? G). O resumo de Gb3Cer /CD77-expressão em tecidos cancerosos de ambas as entidades tumorais é fornecida na Tabela 1, e os dados histopatológicos de carcinoma do pâncreas e do cólon estão resumidos nas Tabelas complementares S1 e S2, respectivamente. Exemplos representativos de pâncreas (A) e cancros do cólon (B) de categorias de tumor I a IV são mostrados. Nenhum dos carcinomas do cólon investigado foi encontrada com igual expressão de Gb3Cer /CD77 em tecido normal adjacente (B). Assim, categoria III ficou vago na coorte de pacientes. C, a estrutura de receptor de Stx1 Gb3Cer (D18: 1, C16: 0). A ceramida (Cer) âncora lipídica aparece preferencialmente em tecidos humanos saudáveis ​​com ácido gordo C24 ou C16, mas esfingosina constante (d18: 1).

TLC imunodetecção de Tumor-Associated Gb3Cer /CD77 no pâncreas e cólon cancro

alíquotas idênticas de extractos de lípidos em bruto de pares correspondentes a partir de tecidos não afectados neoplásicas e correspondentes foram submetidas em simultâneo com a TLC, seguido por TLC detecção de sobreposição Gb3Cer /CD77 utilizando Stx1 e o anticorpo anti-Gb3Cer /CD77. As bandas positivas foram classificados de acordo com a expressão diferente de Gb3Cer /CD77; rank 1 indica a mais alta intensidade (Tabela 1). Com base na densitometria, os tumores foram agrupados em quatro categorias: variando de altura (I), moderada e (II) a sobre-expressão, de igual (III), e reduzido de expressão (IV)

pâncreas

Figura 1A mostra quatro único representante Stx1 TLC manchas de sobreposição de tumor e extratos de tecidos saudáveis ​​relacionados, cada um representando uma das quatro categorias de pâncreas. No total, 61,9% dos carcinomas pancreáticos investigados apresentaram moderada a alta superexpressão de Gb3Cer /CD77, ao passo que 14,3% apresentaram igual e 23,8% níveis diminuídos Gb3Cer /expressão CD77 (ver Tabela 1). Globotetraosylceramide (Gb4Cer), conhecido como “baixa afinidade” ligando de Stx1, não foi detectada em tumores pancreáticos e tecidos normais adjacentes usando Stx1 como ferramenta de detecção. immunostains TLC empregando o anticorpo policlonal /CD77 anti-Gb3Cer foram semelhantes nos resultados aos obtidos com os ensaios de sobreposição Stx1 TLC mostrando pouco maior sensibilidade na detecção dos Gb3Cer /CD77-espécies (ver Suplementar Figura S1A).

Colon cancros.

Figura 1B mostra três único representante Stx1 TLC manchas de sobreposição de pares de câncer combinados cólon, cada uma representando uma das três categorias verificadas em cancros do cólon. Gb3Cer /CD77 foi moderadamente a altamente sobre-expressos em 81,3% dos malignos

contra

tecidos cólon saudável. Nenhum dos tumores do cólon exibiu igual expressão resultante na categoria III vago. Menos Gb3Cer /CD77 foi detectado em 18,8% de todo o tecido tumoral (ver Tabela 1). Tal como em tecidos pancreáticos, Gb4Cer não foi detectada em tumores de cólon e tecidos normais adjacentes utilizando um instrumento de detecção de Stx1. Os immunostains TLC paralelas empregando o anticorpo anti-Gb3Cer /CD77 policlonal são mostrados na Figura Suplementar S1B.

Detecção imunohistoquímica de Tumor-Associated Gb3Cer /CD77 no pâncreas e cancro do cólon

A ligação de anti- Gb3Cer /CD77 anticorpo para secções congeladas de tecidos de carcinoma do cólon e do pâncreas e em tecidos saudáveis ​​do mesmo paciente correspondente foi monitorizada histoquimicamente. As secções foram co-imunocoradas com um anticorpo contra o marcador CD31 de células endoteliais, e os núcleos das células foram visualizadas com DAPI fluorocromo.

Por exemplo, foi detectada extensa ligação de anticorpo a células tumorais pancreáticas (T) para o paciente 18 (tumor categoria I) tal como mostrado na Figura 2A. Em contraste, pouco ou nenhum Gb3Cer /CD77 foi encontrado no tecido de pâncreas normal (N). células endoteliais ocasionais dos vasos sanguíneos, conhecidos para transportar Gb3Cer /CD77 [21], [39], [43], mostrou também coloração positiva no tecido maligno no pâncreas.

As secções de tecido normal (N) e tumor (T) do paciente com cancro pancreático 18 (a) e de doente de cancro de cólon 13 (B) foram imunocoradas com o anticorpo anti-Gb3Cer /CD77 e coimmunostained com um anticorpo contra o marcador CD31 de células endoteliais. núcleos celulares foram detectados com DAPI. As barras de escala correspondem a 20 um. Os exemplos representativos de tumores da categoria I são mostradas (ver Tabela 1). Os dados histopatológicos de pâncreas e carcinoma do cólon estão resumidos nos quadros suplementares S1 e S2, respectivamente.

comparações imunohistoquímicas demonstram alta Gb3Cer /níveis de expressão de CD77 em tumores de cólon (T) como exemplificado para o paciente 13, Figura 2B. Em contraste, o tecido adjacente normal (N) a partir do mesmo paciente faltava Gb3Cer /CD77. A angiogénese parece ser avançada em alguns cancros do cólon investigados como evidenciado pela CD31 e Gb3Cer /CD77 células endoteliais positivas no interior da massa tumoral.

secções de controlo incubadas com controlos de isotipo de IgG1 de ratinho, bem como com soro de galinha pré-imune não manchar . Depois de GSL extração dos tecidos, Gb3Cer /CD77 já não era detectável com o anticorpo (dados não mostrados).

caracterização estrutural de Tumor-Associated Gb3Cer /CD77 no pâncreas e cancro do cólon

A bandas positivas stx1 de extractos lipídicos foram separados por TLC analisados ​​directamente sobre as placas de TLC através de TLC-IR-MALDI-MS, como descrito [34]. Os espectros de massa foram adquiridos no modo de iões positivos e todas as espécies /CD77 Gb3Cer foram detectados como isoladamente cobrado monosodiated iões moleculares.

pâncreas.

A detecção combinada Stx1 e TLC-IR-MALDI-MS demonstram alterações de composição de espécies individuais /CD77 sobre-expressa em Gb3Cer neoplásicas em comparação com o tecido pancreático afectada (por exemplo, doente 19 (tumor de classe I), a Figura 3). Analisando o superior do Stx1 positivo banda tripla do tumor (T, painel esquerdo, inserir), mais abundante [H

3 * + Na]

+ iões moleculares indicam que a presença de Gb3Cer (D18: 1 /d18: 0, C24: 0) com d18 saturado: 0 esfinganina além do d18 monoinsaturados mais comuns: 1 esfingosina (esf ingenina). O mesmo vale para o menor [M

2 * + Na]

+ e [M

1 * + Na]

+ íons, que se referem às estruturas de Gb3Cer (d18: 1 /d18 : 0, C23: 0) e Gb3Cer (D18: 1 /d18: 0, C22: 0), respectivamente. Em contraste, apenas baixa expressão de Gb3Cer /CD77 pode ser detectado na banda positiva Stx1 superior de tecido de pâncreas normal, tal como mostrado na Figura 3 (N, painel esquerdo). A alta abundância [M

4 + Na]

+ íons da banda inferior positiva Stx1 do tumor (T, painel do meio) indicam forte superexpressão de Gb3Cer (d18: 1, C16: 0) no tecido tumoral em comparação a íons apenas em pequena quantidade no tecido saudável correspondente (N, painel do meio). No entanto, a alteração estrutural mais proeminente foi encontrado na banda mais baixa positiva Stx1 do tecido canceroso através da detecção de [H

5 * + Na]

+ iões (t, painel da direita), que foram indetectáveis ​​em tecidos normais ( N, painel da direita). Quando comparado com Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) (t, painel do meio), a mudança de 16 unidades de massa atómica indica hidroxilação da porção de ceramida que leva para a estrutura proposta de Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) carregando um C16 hidroxilado: 0 ácido gordo. Além disso, os iões a

m /z 1064,65

indicar a presença de Gb3Cer (d18: 0, H16: 0). Esta modificação ceramida marcante ocorreu em 85,7% dos tumores do pâncreas, até agora investigadas. Uma sinopse das estruturas propostas de Gb3Cer espécies /CD77 é fornecida na Tabela S3 suplementar.

Lípido extrai equivalente a 2 mg de peso molhado do normal (N) e tecido de tumor (T) (categoria do paciente 19 tumoral I, ver Quadro 1 e Quadro suplementar S1) foram separados por TLC em simultâneo, seguido por análise de sobreposição usando Stx1. As bandas positiva Gb3Cer /CD77 stx1, que estão marcados com setas nas inserções, foram analisadas por TLC-IR-MALDI-MS. O prevalente [H

3 * + Na]

+ iões moleculares das bandas superior do tecido do tumor (T, painel esquerdo) corresponde a Gb3Cer (D18: 1 /d18: 0, C24: 0) e o iões menores poderia ser atribuído a Gb3Cer (D18: 1 /d18: 0, C23: 0) e Gb3Cer (D18: 1 /d18: 0, C22: 0), respectivamente. Na banda superior de tecido normal (N, painel esquerdo) intensidades muito mais baixas desses iões moleculares foram observadas. A alta abundante [H

4 + Na]

iões + da banda mais baixa no tumor (T, painel do meio) representam Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), que é detectável apenas em quantidades vestigiais em tecido normal (N, painel do meio). Análise da banda mais baixa do tumor (T, painel da direita) revelou [M

5 * + Na]

+ iões, que são indicativos de hidroxilado Gb3Cer (D18: 1 /d18: 0, H16: 0) . Esta variante Gb3Cer /CD77 não foi detectada em tecido normal (N, painel da direita). O

m /z

valores de íons moleculares e estruturas propostas de Gb3Cer /CD77-variantes de tecidos normais e malignas adjacentes, bem como referências de eritrócitos humanos estão listadas na Tabela Complementar S3.

cancros do cólon.

detecção Stx1 combinado com TLC-IR-MALDI-MS nos permitiu traçar o perfil das estruturas individuais de espécies /CD77 Gb3Cer sobre-expressos como exemplarmente mostrados para o paciente 16 na Figura 4 (T, painel esquerdo) . Alta abundante [H

3 + Na]

+ iões apontar para Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) como as variantes Gb3Cer /CD77 mais prováveis ​​na banda positiva superior Stx1, acompanhada por menos pronunciado [H

2 + Na]

+ e [M

1 + Na]

+ iões, que correspondem a Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) e Gb3Cer (D18: 1, C22: 0), respectivamente. Os mesmos iões mas com intensidades muito mais baixas foram obtidas a partir da banda positiva Stx1 superior do tecido normal (N, painel esquerdo). Na banda inferior do tumor (T, painel do meio), proeminente [H

4 + Na]

+ iões poderia ser atribuído ao Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) estrutura, que também é detectável no tecido normal, mas com menos intensidade iónica (N, painel do meio). Na banda mais baixa [H

5 * + Na]

+ iões indicar a presença do Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) variante com C16 hidroxilado: ácido 0 gordo, que não podiam ser encontrados no tecido normal (N, painel da direita). Esta modificação notável ceramida foi encontrada em cerca de 19% do tumor do cólon TLC immunostains até agora investigados. Uma sinopse das estruturas propostas de Gb3Cer espécies /CD77 é fornecida na Tabela S3 suplementar.

Lípido extrai equivalente a 2 mg de peso molhado do normal (N) e tecido de tumor (T) (categoria do paciente 16 tumoral II, ver Quadro 1 e Quadro suplementar S2) foram separados por TLC em simultâneo, seguido por análise de sobreposição usando Stx1. As bandas positiva Gb3Cer stx1, que estão marcados com setas nas inserções, foram analisadas por TLC-IR-MALDI-MS. O prevalente [H

3 + Na]

+ iões moleculares das bandas superior do tecido do tumor (T, painel esquerdo) corresponde a Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) e a menos abundante [M

2 + Na]

+ e [M

1 + Na]

+ íons para Gb3Cer (d18: 1, C23: 0) e Gb3Cer (d18: 1, C22: 0 ), respectivamente. Na banda superior de tecido normal (N, painel esquerdo) intensidades muito mais baixas de iões moleculares correspondentes foram observadas. A forte [H

4 + Na]

iões + da banda mais baixa no tumor (T, painel do meio) representam Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), que é detectável apenas em pequena quantidade, em condições normais tecidos (N, painel do meio). Análise da banda mais baixa do tumor (T, painel da direita) revelou [M

5 * + Na]

+ iões, que são indicativos de hidroxilado Gb3Cer (D18: 1, H16: 0). Esta variante Gb3Cer /CD77 não foi detectada em tecido normal (N, painel da direita). O

m /z

valores de íons moleculares e estruturas propostas de Gb3Cer /CD77-variantes de tecidos normais e malignas adjacentes, bem como referências de eritrócitos humanos estão listadas na Tabela Complementar S3.

parcelas Análise estatística

de caixa de dados densitométricos primárias de ensaio sobreposição TLC determinados níveis Gb3Cer /CD77 no pâncreas (n = 21 pacientes) e cólon (n = 16 pacientes) tecidos são fornecidos (Figura 5A e B, respectivamente). A sobre-expressão de Gb3Cer /CD77 gravada em 81,3% do cancro do cólon em comparação com os tecidos saudáveis ​​adjacentes foi significativa (P = 0,021), ao passo que o aumento da expressão de Gb3Cer /CD77 em 61,9% dos tecidos pancreáticos malignos não foi significativa (P = 0,189). Em ambos câncer de pâncreas e cólon, a presença de bandas /CD77 Gb3Cer STX-detectados não se correlacionou com os parâmetros clínico-patológicos (para dados patológicos ver quadros suplementares S1 e S2). No entanto, para os tumores pancreáticos, os valores de diferença de expressão Gb3Cer /CD77 se correlacionam com o grau de diferenciação do tumor (P = 0,039, τ = 0,396), indicando níveis mais elevados de Gb3Cer /CD77 em malignidades menos diferenciadas. Esta associação entre pobre diferenciação de tumores em pacientes com Gb3Cer /CD77 sobre-expressão em tecido pancreático maligno é descrita nos gráficos de caixas da Figura 5C. Em conclusão, a expressão de Gb3Cer /CD77 é maior em tecidos malignos menos diferenciadas sugerindo o receptor Stx como um marcador potencial para a fraca diferenciação de tumores pancreáticos.

As caixas são delimitadas por cima e por baixo a 25% e 75 % percentis. As linhas nas caixas e os pequenos quadrados indicam a mediana e os valores médios e os dois × os valores mínimos e máximos, respectivamente. Uma, embora não significativa (P = 0,189, N = 21), uma expressão melhorada do Gb3Cer /CD77 pode ser observada em tumores do pâncreas em comparação com tecidos normais. B, a expressão de Gb3Cer /CD77 está marcadamente aumentada em tecidos de tumor de cólon em comparação com que nos tecidos normais adjacentes, indicando uma associação entre a expressão Gb3Cer /CD77 e transformação neoplásica (*, P = 0,021, N = 16). C, a correlação entre a expressão Gb3Cer /CD77 e diferenciação do tumor pancreático (N = 20 doentes, porque um tumor não pode ser atribuído; ver Tabela 1). Os tumores foram divididos em dois grupos de acordo com a graduação histopatológica: grade≤2 (n = 14 pacientes) e grau 2 (n = 6 pacientes). análise de correlação da diferença de valores aponta para uma maior expressão /CD77 estatisticamente significativa Gb3Cer em tumores do pâncreas classificados como . 2 (*, P = 0,039, τ = 0,396)

Discussão

por agrupamento em microdomínios de membrana jangada de lipídios [11], [44], as cadeias de oligossacarídeos dos GSLs exibem actividades de ligação fortes para com os seus ligantes [45]. Assim, GSL associados a tumores, isto é, GSL mostrando uma expressão elevada no canceroso em comparação com tecidos normais, são perfeitamente adequados para o diagnóstico de tumor e terapias anticancro segmentados [31], [46], [47]. Consequentemente, anticorpos, lectinas ou toxinas com especificidades de ligação GSL geraram grande interesse em oncologia.