Sumário
Ataxia-telangiectasia mutada (ATM) é uma proteína quinase Ser /Thr que desempenha um papel crítico no DNA a sinalização induzida por danos e iniciação de checkpoint do ciclo de sinalização celular em resposta a agentes que danificam o ADN tais como a radiação ionizante. Nós já relataram a perda de proteína ATM por imuno-histoquímica (IHQ) em 16% do tecido humano câncer gástrico (GC). Nossa hipótese é que
ATM
mutações intron gene alvo de instabilidade de microssatélites (MSI) provocar a perda de proteína ATM em um subconjunto de GC. Estudamos mutações mononucleotídicos no intron de
ATM
gene, ATM IHC e MSI na GC. Dez linhas celulares de cancro gástrico humano foram estudados para o
ATM
mutação genética em íntrons, RT-PCR, sequenciação directa, e imuno-histoquímica. tecidos GC de 839 pacientes foram analisadas para MSI e ATM IHC. Entre eles, 604 casos foram analisados para o
ATM
mutações no exão 6 intrões anteriores, exão 10 e exão 20. Duas linhas de células de GC humano (SNU-1 e -638) apresentaram
ATM
mutações intron, deleção em RT-PCR e sequenciação directa e perda de proteína ATM por IHC. As frequências de
ATM
mutação, a perda de proteína MSI, e ATM eram 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) e 15,2% (134/839), respectivamente. Análise das associações entre MSI, mutação do gene ATM, e perda de proteína ATM revelou altamente
ATM
alterações co-existentes de genes e MSI.
ATM
mutação intron e perda de proteína ATM foram detectados em 69,3% (52/75) e 53,3% (40/75) do GC MSI positivo. MSI positividade e perda de proteína ATM estavam presentes em 68,4% (52/76) e 48,7% (37/76) dos GC com a mutação intron ATM.
ATM
perda de mutação e proteína ATM tinham características da velhice, localização distal do tumor, tamanho grande tumor e tipo intestinal histológica. Nosso estudo pode ser interpretada como o
ATM
mutação genética no íntron pode ser alvo de MSI e levar à perda de proteína ATM em um grupo selecionado de GC.
Citation: Mutação em Intronic repetições do Gene Ataxia Telangiectasia-Mutante (ATM) e perda de proteína ATM em Câncer gástrico primário com instabilidade de microssatélites Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10.1371 /journal.pone.0082769
editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República da Coreia
Recebido: 21 de julho de 2013; Aceito: 27 de outubro de 2013; Publicação: 06 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC Planejamento Futuro (NRF-2012R1A1A2004648). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Ataxia-telangiectasia mutada (ATM) gene é um componente de resposta de ADN-danos (DDR) e é activado por quebras na cadeia de ADN duplas (DSB), e sinaliza o ponto de controlo do ciclo celular para retardar a passagem de células através do ciclo para facilitar a reparação do ADN. O gene está localizado no cromossoma 11q22-23. O gene de
ATM
é muito grande, que abrange uma região genómica de 150 kb, que compreende de 66 exões, com uma sequência de codificação de 91668 pb.
ATM está implicado em respostas de LAP que ocorrem fisiologicamente em tipos celulares especializados, tais como as células germinais e linfócitos. A proteína ATM ajuda as células a reconhecer cadeias de ADN danificado ou partido. A proteína ATM coordenadas reparo do DNA, ativando enzimas que fixam os fios quebrados. reparação eficaz de cadeias de ADN danificadas ajuda a manter a estabilidade da informação genética da célula [1].
ATM perda foi observada em 16% do tecido GC humana em um grande estudo de coorte [2]. Inativação do gene
ATM
pode ser um evento frequente no desenvolvimento do cancro gástrico humano (GC); No entanto, os eventos relacionados com a perda de
expressão ATM
no GC não poderia ser explicada pela baixa prevalência de
ATM
mutação. A maioria dos
ATM
mutações identificadas em linhas celulares GC primários e tecidos GC foram mutações pontuais [3]. sistema
A reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN (MMR) corrige os erros que podem ocorrer durante a replicação do ADN, enquanto que a recombinação homóloga e não homóloga extremidade de junção estão envolvidos na reparação de DSB de ADN. As mutações em genes de reparação de DSB de ADN, tais como
ATM, MRE11, RAD50, NBS1
e
ATR
, são postulados para desempenhar um papel no desenvolvimento de malignidades gastrointestinais com uma função prejudicada de MMR. Em tumores colo-rectais com um sistema de MMR prejudicada, mutações de repetições em mononucleotídicos intrónicas
ATM
e
MRE11
foram encontrados para resultar no splicing aberrante, seguido por redução da expressão da proteína de tipo selvagem [4 ].
Aproximadamente 10% dos GC é associado com instabilidade de microssatélites (MSI). MSI refere-se a alterações no número de repetições de nucleótidos nas regiões microssatélite localizados dentro das regiões de codificação de genes, e resulta em mutações frameshift. MSI foi identificada nas regiões de genes alvos conhecidos, incluindo codificação de proteínas
TGF-βRII, IGFIIR, BAX
[5-7], e
hRAD50
genes [8]. O
hRAD50, BLM
, e
BRACA1
genes têm poli (A) mononucleótido repete dentro das regiões codificadoras, a
hMSH6
tem (C) 8 trato, o
NBS1
tem a (a) 7 trato, e
ATM
tem o (T) 7 trato. mutações frameshift destes genes com incidências variáveis foram relatados anteriormente [9-11].
Além do grande número de mutações acumuladas em sequências microssatélites neutros, a MSI também gera mutações em genes do cancro, isto é, naqueles genes que desempenham um papel activo no processo de várias etapas da carcinogênese. Embora as sequências utilizadas na região de codificação de genes são mais curtos do que os loci de microssatélites típico utilizado para o mapeamento de genes, a sua propensão para sofrer erros de deslizamento durante a replicação espontâneas é ainda mais elevada do que a de sequências não repetitivas. As mutações de uma repetição intrônica foram relatados para induzir a expressão prejudicada de
MRE11
gene [12,13]. mutações polipirimidina repetidos no gene
ATM
pode perturbar o splicing mRNA correta [14]. No entanto, não há nenhuma evidência de que a inserção /deleção ocorrendo a estas sequências não codificantes mononucleotídicos afectar a função normal de proteína ATM em GC relacionados em MSI. No tecido GC humana com a MSI, a frequência de
ATM
mutação ea associação com a perda da função da proteína não é claramente compreendido. Temos a hipótese de que alterações mononucleótido trato no intron do gene
ATM
está associado à perda da função da proteína ATM em GC com a MSI.
Nós investigamos mutações no intrónica (T) 15 na
ATM
gene interveniente de sequência (IVS) que precede o exão 6, que levam à supressão de 22 pb do exão 6 em linhas celulares de cancro gástrico humano . No presente estudo, as mutações de a
ATM
gene juntamente com a presença de MSI foram examinados em linhas celulares e tecidos humanos GC GC primárias. Nossos resultados mostraram que
ATM
mutação intron gene era frequente em GC com a MSI e foi significativamente associada com a perda da função da proteína ATM.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo retrospectivo foi realizado utilizando as amostras ao longo das prateleiras após o diagnóstico patológico, e todas as amostras foram anónimos antes do estudo. Este estudo retrospectivo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital Universidade Nacional de Seul (H-1010-065-336) com dispensa de consentimento informado sob a condição de o anonimização.
As linhas celulares e amostras de tecido
Ten células de câncer gástrico humano linhas- SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 e SNU-719 foram obtidas a partir do celular coreana Linha Bank (Seul, Coréia). Todas as linhas celulares foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, EUA) e antibióticos (100 U /mL de penicilina G e 100 ug /mL de estreptomicina) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% CO
2 incubadora. A linha de células de slides de arranjo de tecido feito de linhas celulares GC humana colhidos e fixos foi obtido para imuno-histoquímica (Superbiochips, Coreia).
fixado em formol e amostras de tecido GC embebidos em parafina de 839 pacientes submetidos a gastrectomia curativa para tratamento do câncer gástrico primário entre 1
de Janeiro de 2004 e 31
st de dezembro de 2005 no Hospital da Universidade Nacional de Seul foram recolhidos. Os pacientes incluídos 577 homens e 262 mulheres, com idade média de 57,6 anos (intervalo: 4 a 87 anos). Informações sobre a localização do tumor foi obtido a partir de 835 casos: terço superior em 109, terço médio, em 323, terço inferior em 383, e todo o estômago em 20 casos. Com base na classificação Lauren, os cancros foram histologicamente classificados como tipo intestinal em 381, tipo difuso no 327, de tipo misto, em 123, e indeterminada em 8 casos. Dos 839 casos, 165 eram GC cedo e 674 foram avançados GC. Metástases linfonodais estava presente em 531 casos e ausente em 308 casos. Duzentos e quarenta e cinco pacientes foram diagnosticados como estágio I, 254 como estágio II, 291 como estágio III, e 85 como estágio IV. A quimioterapia adjuvante após a cirurgia foi realizada em 533 pacientes, dos quais 32 pacientes em Estágio I, 153 no Estágio II, 260 na Fase III, e 82 na Fase IV. O período médio de acompanhamento foi de 49,3 meses (intervalo: 0-85 meses). recorrência local foi observada em 185 (21,0%), metástases à distância em 85 (9,6%) e morte por qualquer causa em 289 fora de 882 pacientes (32,8%). dados de sobrevivência de pacientes, incluindo datas e causas de morte, foram obtidos a partir do Registro Korean Central Cancer, Ministério da Saúde e Bem-Estar, Coreia. exame histopatológico padrão incluiu a avaliação do tipo de câncer e estágio do tumor patológico, de acordo com os critérios estabelecidos pela 7ª Edição da AJCC Staging Manual [15].
extracção de ADN e MSI determinação
O tecido tumoral amostras em lâminas de vidro foram examinadas sob um microscópio de luz. Uma área do tumor, em que a percentagem de células de tumor excedeu um mínimo de 50% de todas as células em que a área e uma área emparelhado de tecido de mucosa normal não contendo células tumorais foram marcadas e raspada com uma lâmina de faca. O tecido raspado foi recolhido em 1,5 microtubos mL contendo 50 mL de tampão de lise de tecidos (0,5% de Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 tampão de Tris-HCl mM [pH 7,6], EDTA 1 mM, e 20 ug de proteinase K [ ,,,0],Sigma]). Os tubos foram incubados durante 24 a 48 horas a 55 ° C, até o tampão de lise contendo o tecido tornou-se clara. Proteinase K foi inactivada por incubação a 95 ° C durante 10 minutos, e extraiu-se o ADN foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização. MSI foi avaliada no loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, e D17S250. Os tumores foram classificados como MSI + quando, pelo menos, dois (40%) dos 5 marcadores microssatélites foram associados com alelos de tamanho alterada no ADN do tumor em comparação com o DNA de tecido não-tumoral.
A detecção de mutações de
ATM Restaurant at intron mononucleótido repete
A amplificação por PCR foi realizada em 10 volumes ul contendo 1 mL de DNA genômico, 5 pmol de cada de frente e reverso primários, e 5 ul de pré-mistura. Trinta e três ciclos de PCR foram realizados com parâmetros de um ciclo de 95 ° C durante 30 seg, 30 seg a uma temperatura de emparelhamento apropriada para cada par de iniciadores a 65 ° C durante 1 min, seguido de 10 min de extensão a 72 ° C.
Variação de repetir mononucleótido na
ATM
foi detectada usando um ensaio baseado em PCR. O ADN genómico foi amplificado com primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG para exon6 (T) 15 (155 pb), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA para exon10 (T) 15 (165 pb), e F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA para exon20 (T) 15 (178 pb).
Detecção de splicing aberrante em
ATM
RNA total (2,5 g) a partir de linhas celulares de cancro gástrico humano preparados pelo Trizol reagente (GIBCO-BRL) foi utilizado para síntese de ADNc de primeira cadeia com Superscript II Reverse Transcriptase (GIBCO-BRL) e oligo-d (T)
12-18 iniciador. Uma alíquota da mistura reaccional foi amplificado por PCR para sintetizar vários segmentos de ADNc ATM.
A amplificação por PCR foi realizada em volume de 20 uL contendo um ADNc uL transcritos de modo inverso, 5 pmol de cada um dos iniciadores directos e inversos, e 10 ul de pré-mistura. Trinta e cinco ciclos de PCR foram realizados com parâmetros de um ciclo de 95 ° C durante 30 seg, 30 seg a uma temperatura de emparelhamento apropriada para cada par de iniciadores a 72 ° C durante 1 min, seguido de 10 min de extensão a 72 ° C. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio e visualizadas sob luz UV. β-actina foi utilizado como um padrão interno.
Três pares de iniciadores de RT-PCR derivados de
ATM
sequências do GenBank NM_000051) (utilizados foram F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG e R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA para detectar transcritos de exão 5-7 (tamanho do produto: 347 pb), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA e R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA para exão (tamanho do produto: 504 pb) 9-11 e F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC e R-GATTGACTCTGCAGCCAACA para exão 19-22 (tamanho do produto: 415 pb ).
A análise de sequenciação
A sequenciação foi realizada pelo método de terminação de cadeia didesoxi, utilizando o kit de sequenciação de ADN (Applied Biosystems) e o ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Os produtos de PCR amplificados foram purificados utilizando um kit enzimaticamente presequencing (Amersham Life Science, Cleveland, OH, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, e, em seguida, directamente sequenciado utilizando o método de terminador BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reacções de sequenciação foram executados em um sequenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, EUA) e os dados obtidos foram analisados por meio de análise de DNA sequenciamento 3,7 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os novos dados foram depositados no GenBank (número de acesso: KF704396)
Imunohistoquímica
seções tumor de blocos representativos e secções de matriz de linha de células de espessura de 4 mm foram desparafinados e reidratados em classificados. álcool. A recuperação de antígenos foi atingida pela pressão -cooking as amostras em /L de tampão citrato de 0,01 mol por 5 min. O anticorpo monoclonal de coelho (obtido a partir do clone Y170 Epitomics, Burlingame, CA, EUA) foi utilizado para imuno-histoquímica. ATM foi corada no núcleo da mucosa gástrica normais, células do estroma, e linfócitos. A intensidade foi classificada como 0 (totalmente negativo), ± (coloração equívoco, sinal observado somente em microscopia de alta potência com × 40 ocular), + /3 (fracamente positivo), ++ /3 (moderadamente positivo) e +++ /3 (fortemente positiva, quase igual a linfócitos e neutrófilos). Os critérios para casos negativos foi definido como menos de 10% de células coradas como fracamente positiva (+ /3) ou mais elevada intensidade, isto é, mais de 90% de células mostrando (0) ou coloração equívoca totalmente negativo (±) [2 ].
A análise estatística
O pacote SPSS 15.0 foi utilizado para análises estatísticas. Foram utilizados os testes qui-quadrado e Cox modelo de riscos proporcionais. Todos os valores P são dois lados e P valores . 0,05 foram considerados significativos para os métodos estatísticos deste estudo
Resultados
Mutation na repete mononucleotídicos intrônicas do gene ATM em gástrica humana linhas celulares de cancro
Entre 10 linhas celulares de cancro gástrico humano, SNU-1 e SNU-638 foram caracterizados como MSI positivo,
ATM
perda de mutações genéticas positivas e ATM por IHC. Em SNU-1 e SNU-638, 22 pares de bases deleção do exão 6 foi detectada por RT-PCR e confirmou-se na análise de sequência subsequente (Figura 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668, e SNU-719 foram MSI negativo e tinha tipo selvagem do gene
ATM
. Embora SNU-216 foi MSI negativo, ele abrigou mutações no
ATM
gene, e teve forte expressão ATM detectado por IHC (Tabela 1).
(A) BAT26 (azul) e BAT25 (verde) mostrou padrão estável em SNU-5 (superior) e padrão instável no SNU-1 (inferior). (B) ATM produtos de PCR gene sequência (IVS6) (laranja) inintervening, IVS10 (azul), IVS20 (verde) mostrou comprimento normal no SNU-5 (superior) e encurtando em SNU-1 (inferior). (C) RT-PCR de
ATM
exão 6, exão 10, e exão 20 em linhas celulares de cancro gástrico. SNU-1 e 638 mostraram supressão de 22 pb no exon 6. (D) A sequenciação directa da IVS 6. SNU-5 tem sequência normal e SNU-1 tem 22 deleção em sequências sublinhadas. (E) A imuno-histoquímica da proteína ATM em linhas celulares de cancro gástrico. Negativa na SNU-1, equívoca no SNU-638, leve positivo na SNU-16 forte e positiva na SNU-5. (F) Representação esquemática de uma deleção de 22 pb do exão 6 de
ATM
(882del22).
MSI
ATM
mutação do gene de mononucleótido intrônica repete
ATM
sequenciamento
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
Exon 6
exon 10
exon 20
exon 6
exon 10
exon 20
SNU-1 +++++ 22 pb delnono22 pb delnonoNegativeSNU-5 —– nonononononoPositiveSNU-16 —– ndndndnononoPositiveSNU-216 – +++ nononono nonoPositiveSNU-484—–ndndndnononoPositiveSNU-601—–ndndndnononoPositiveSNU-620—–ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22 pb del nonoNegativeSNU-668 —– ndndndnononoPositiveSNU-719 —– ndndndnononoPositiveTable status e instabilidade de microssatélites 1.
ATM
perfis de genes de linhas celulares de cancro gástrico humano.
IVS, sequência interveniente ; IHC, imuno-histoquímica. CSV Baixar CSV
Mutation na repete intron mononucleotídicos do
ATM
instabilidade genética e microssatélites no tecido câncer gástrico
A frequência de mutação intrônica em
gene ATM
foi determinada como 12,9% (78/604). A frequência do
ATM
mutação genética foi de 9,3% (50/540) no intrão que precede IVS 6; 11,0% (59/534) no intrão que precede IVS 10 e 8,8% (46/523) no intrão que precede IVS 20; entre eles, IVS 6 e IVS 10 sobrepostas em 39, 10 e IVS IVS 20 em 35, 10 e IVS IVS 20 em 34, IVS 6, IVS 10 e IVS 20 em 31 casos (Tabela 2). As frequências de MSI positividade foi de 9,2% (81/882) e perda de proteína ATM foi de 15,2% (134/839) em nosso estudo da GC. Em 596 casos, foram analisadas as associações entre MSI (Figura 2A), a mutação do gene ATM (Figura 2B), e perda de proteína ATM (Figura 3).
ATM
mutação intron e perda de proteína ATM foram detectados em 69,3% (52/75) e 53,3% (40/75) do GC MSI positivo. MSI positividade e perda de proteína ATM estavam presentes em 68,4% (52/76) e 48,7% (37/76) dos GC com a mutação intron ATM. MSI positividade e mutação intrão ATM foram detectados em 35,7% (40/112) e 33,0% (37/112) dos GC com a perda de proteína ATM (Tabela 3). A frequência de resultados ATM IHC mostraram uma significativamente maior perda de ATM em um subgrupo de MSI positivo e
ATM
mutação positiva GC (Figura 4A). Trinta e três dos 596 casos (5,5%) têm as três características moleculares (Figura 4B).
Localização
Repete (tipo selvagem)
mutação Intron no GC
Intron mutação no MSI positivo GC
mutação Intron em ATM IHC GC negativo
ATM
IVS 6 (T)
1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 10 (T)
1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%)
ATM
IVS 20 (T)
1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%)
ATM
IVS 6 ou IVS 10 ou IVS 20 (T)
1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Tabela 2. Incidencies de
ATM
mutação intron do gene no câncer gástrico (CG)
IVS, sequência interveniente.; MSI, instabilidade de microssatélites; IHC, imuno-histoquímica. CSV Baixar CSV pista
Baixa mostrou instabilidade no BAT26 (azul) e BAT25 (verde). (B) da pista inferiores apresentaram mutação na sequência de 6 (IVS6) (azul) intervir.
(A) Negativo. (B) Equivocal (+/-). (C) positiva fraca (1 + ~ 2 +). (D) positivo Strong (3+).
ATM IHC
MSI
ATM
mutação
N
negativo positivo
NegativeNegative49768 (13,7%) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3%) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) tabela 3. Frequência de expressão da proteína ATM em subgrupos de acordo com instabilidade de microssatélites (MSI) de status e
ATM
intron mutação.
CSV Baixar CSV
(a) Frequências de perda de proteína ATM por imuno-histoquímica em gástrica subgrupos de câncer por status MSI e
ATM
mutação intron. diagrama (B) Venn mostrando o número de casos de câncer gástrico com sobreposição de características moleculares entre instabilidade de microssatélites de alto nível (MSI-H),
mutação intron ATM e ATM perda de proteína.
correlações clinicopatológico de
ATM
mutação genética em GC
pacientes GC com
ATM
mutação do gene foram associados com idade avançada, grande tamanho do tumor, localização distal, tipo intestinal, invasão mais profunda, e menor taxa de recorrência. pacientes GC com negativo ATM IHC foram associados com idade avançada, grande tamanho do tumor, tipo bem ao diferenciadas moderadamente, e tipo intestinal de classificação de Lauren (Tabela S1). qui-quadrado
ATM
status de mutação genética em grupos negativos e positivos ATM IHC com variáveis clínico-patológicas foi realizada. No grupo negativo ATM IHC,
ATM
GC positiva mutação foram associados com idade avançada (P = 0,032) e localização distal (P = 0,045). No grupo positiva ATM IHC,
ATM
mutação do gene foi associado com o tipo de bem ou moderadamente diferenciada do GC (P = 0,022) (Tabela S1).
A análise de sobrevida
o modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado em ambos os testes uni e multivariada. A análise univariada de regressão de Cox para sobrevida global ea sobrevida livre de doença mostrou valor preditivo significativo de alguns fatores prognósticos estabelecidos, tais como metástases em linfonodos, profundidade de tumor, e classificação do tipo histológico de Lauren. O grupo de pacientes que recebeu adjuvante chemotherpy tiveram um risco relativo significativamente elevado para global (SG) e sobrevida livre de doença (DFS) (P 0,001, risco relativo = [CI 95,0%, 2,81-5,18] 3,82 para OS e P 0.001, risco relativo = 5,63 [IC de 95,0%, 3,69-8,58] para DFS). No entanto, não foram observadas tendências significativas de risco relativo (RR) para a
ATM
mutação intron, perda MSI, ou ATM IHC. A análise multivariada utilizando variáveis de profundidade de tumor, estado linfonodal, a classificação do tipo histológico de Lauren, a quimioterapia adjuvante,
ATM
mutação intron, e expressão da proteína ATM foi realizada. ATM mutação intron tem um risco relativo inferior com uma significância limítrofe para a sobrevida global (P = 0,05, risco relativo = 0,60, [CI 95,0% 0,36-1,00]) (Tabela 4).
Sobrevida global
Sobrevivência livre de doença
risco relativo
95,0% CI
valor P
N
risco relativo
95,0% CI
valor P
N
avançada gástrica Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph nó do tipo positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544
ATM
intron loss1.190.82-1.730 proteína mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM .355961.100.67-1.810.70544Table análise de regressão multivariada 4. Cox.
CSV Baixar CSV
Discussão
Nossos resultados mostraram que as mutações de uma repetição intron no gene
ATM
resultar em splicing aberrante, levando à supressão de 22 pb e ATM proteína perda de expressão em linhas celulares de GC. Estes resultados são consistentes com o relatório anterior [13] sobre a identificação de um defeito de splicing no
MRE11
precursor transcrição associada a mutações por um poli (T) 11 repeat dentro intervir sequência de 4 (IVS-4), exclusivamente em linhas celulares de cancro da MMR-deficiente e tumores primários. Nossos resultados revelaram que a perda de proteína ATM no GC correlação significativa com a presença de mutação genética intrônica em
ATM
.
Em pacientes Ataxia-telangiectasia, 70% -90% do
ATM
mutações são nonsense, mudança de quadro, ou splicing mutações que truncar a proteína [16]. De acordo com os bancos de dados cósmica (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutações nas regiões de
gene ATM
foram detectados em 5% (433 de 9249) de vários cancros codificação. Entre eles câncer de estômago mostraram mutação apenas em 1,35% (1 de 74). Embora
ATM
mutação genética em GC foi relatado anteriormente [3,9], a explicação abrangente foi limitada pela baixa frequência de mutação e relativamente alta incidência de perda funcional da ATM [2]. Em nosso estudo, cerca de 70% do GC MSI positiva mostrou
ATM
mutação intrônica gene significativo associado com a perda de proteína ATM. Os resultados suportam que a mutação intrônica do
ATM
com MSI subjacente é um dos principais mecanismos de perda de ATM em GC humano. perda de ATM é atribuída a splicing aberrante associada com encurtamento intrônica em linhas celulares MSI positivos cólon de câncer. Ejima et ai. procurou
ATM
mutações genéticas usando 62 pares de primers de oligonucleotídeos, o que corresponde à região que vão desde o exão 4 a exão 65 do
ATM
e seus introns flanqueando. Encurtamento do trato mononucleotídicos de
ATM
íntrons representaram 34 (87%) de 39 alterações intrônicas. Trinta e um deles foram encontrados em linhas de células de tumor colo-5 tendo MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, e LoVo). Eles também demonstraram a baixa expressão da proteína ATM em MSI linhas celulares de cancro colorrectal positivos [14]. A expressão ATM é significativamente reduzida em muitos carcinomas da mama, e não encontrou nenhuma
ATM
mutação em que a linha de células [17]. Isto indica diferentes características de
ATM
alterações genéticas entre cancros gastrointestinais e da mama.
Para além de mutações, genes supressores de tumor pode ser inactivado por metilação dos resíduos de citosina dentro ilhas CpG que estão localizados na promotor de muitos genes. gene
ATM
é um novo alvo para o silenciamento epigenético através de metilação inadequado de sua região promotora proximal se correlaciona com o aumento da radiossensibilidade e expressão baixa proteína em uma linha humana colorectal células tumorais [18] e linha de células de glioma humano [18]. sem
ATM
mutações genéticas.
A MSI segmentação do gene
ATM
representar um elo entre MSI e reparo de DNA em GC. Vários estudos indicam que a perda funcional da ATM é aumentada em MSI e gene
ATM
humano é um dos principais alvos de inactivação em linhas de células positivas GC MSI e tecidos [19,20]. A razão para notavelmente alta incidência de
ATM
mutação intron do gene em GC MSI positivo pode ser devido às repetições mononucleotídicos (T) 15, e um comprimento de 13 nucleótidos ou mais foram particularmente suscetíveis a esse alvo encurtando [14 ]. A frequência de
ATM
mutação frameshift gene (T) 7 em exão 6 sequência de codificação em GC MSI positivo foi relatado para ser apenas 6% (2/36) [8], que é muito menor do que a nossa observação.
Relata-se que a deficiência de ATM sensibiliza células aos efeitos inibidores do crescimento de inibidor de PARP, olaparibe, em células de cancro gástrico com
expressão reduzida ATM
[21]. inibidores de polimerase de poli (ADP-ribose) são actualmente avaliadas em ensaios clínicos contra uma variedade de cancros, incluindo carcinoma do cólon em [22]. No GC, a deficiência de ATM é conhecido por ser um preditor de resposta ao inibidor de PARP [23-25]. Um marcador de recombinação homóloga, Rad 51, é conhecido por ser marcador preditivo de quimioterapia baseada em anthracylcine neoadjuvante no cancro da mama [26], bem como do inibidor de PARP em GC [24].
Os nossos resultados demonstraram que a ATM perda de proteína não é um fator agressivo de GC, embora seja significativamente associada com tendência desfavorável de RH em MSI GC negativo. Isto é comparável com outros estudos que relatam a perda de proteína ATM como um fator prognóstico adverso [20]. Em nossos estudos,
ATM
mutação e GC ATM negativo tinham características clínico-patológicas distintas; No entanto, este grupo não mostraram qualquer diferença na sobrevida com os outros. No grupo negativo MSI, HR de GC com perda de proteína ATM foi significativamente alta, no entanto, no grupo positivo MSI, RH em GC com perda de proteína ATM não foi significativa. Isto indica que a MSI é um fator molecular potencial de afetar o comportamento biológico de GC. Assim, o nosso estudo apoia esse status MSI poderia influenciar a sensibilidade ao inibidor de PARP por afetar o status da expressão da proteína DNA danos resposta através mononucleótido repete alterações.
Em resumo,
ATM
mutação genética em GC é de 12,9%, e 33,0% do GC com
ATM
mutação do gene está associada com a perda de proteína ATM. MSI GC positiva mostrou
ATM
mutação em 69,7%. Nossos resultados sugerem que o resultado da perda de ATM e sensibilidade à composto quimioterapêutico, olaparib, pode ser melhor compreendida se os casos são estratificados com base em
ATM
estado de mutação de genes ou MSI.
Conclusões
O nosso estudo revelou
ATM
mutação intron gene está presente em 69% dos GC MSI positiva e 49% do
ATM
mutação intron está associada com perda de proteína ATM. Estes sugerem que o
ATM
mutação intron gene alvo de instabilidade de microssatélites está associada com a perda de proteína ATM em um subconjunto de câncer gástrico humano.
Informações de Apoio
Tabela S1.
correlações clinicopatológico de carcinoma gástrico com a mutação do gene ATM e expressão da proteína ATM.
doi: 10.1371 /journal.pone.0082769.s001
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