Abstract
Fundo e visa
A pancreatite crônica e câncer de pâncreas são caracterizada por extensa fibrose mediada por células estreladas e desenvolvimento terapêutico atual inclui segmentação interações estroma câncer e tumor-hospedeiro pancreáticas. Evidências recentes sugerem que circulam de medula óssea derivados de células estaminais (BMDC) contribuir para órgãos sólidos. Nosso objetivo foi definir o papel das células circulantes hematopoéticas no pâncreas normal e doente.
Métodos
medula óssea total foi colhido a partir de camundongos machos doadores β-actina-EGFP e transplantadas para destinatário do sexo feminino irradiados ratinhos C57 /BL6. pancreatite crónica foi induzida com injeções repetidas de ceruleina, enquanto carcinogênese foi induzida com uma injeção intrapancreática de dimetilbenzantraceno (DMBA). Fenótipo de células derivadas do doador enxertados dentro do pâncreas foi avaliada por imuno-histoquímica, imunofluorescência e
in situ
hibridação.
Resultados
células GFP positivas eram visíveis no epitélio pancreática exócrina a partir de 3 meses após o transplante. Estes exibiram morfologia acinar e foram positivos para amilase e aglutinina de amendoim. Camundongos administrados ceruleina desenvolveu pancreatite crónica, enquanto os ratos DMBA exibiu lesões precursoras e do câncer de pâncreas. Não células acinares foram identificados para ser após a cessação do tratamento ceruleína derivados do doador, no entanto foram observados casos raros de células acinares derivadas da medula óssea durante a regeneração do pâncreas. Aumento do recrutamento de BMDC foi observada dentro do estroma desmoplástico, contribuindo para a população de células estreladas activadas do pâncreas (PASC), em ambas as doenças. A expressão de marcadores de células estreladas CELSR3, foi observada PBX1 e GFAP na DMO PaSCs associados ao câncer, no entanto associado a um cancro, mas não PaSCs BMD associada a pancreatite, expressou o câncer PASC CELSR3 marcador específico.
Conclusões
Este estudo demonstra que BMDC pode incorporar no pâncreas e adotar o estado diferenciado do compartimento de exócrina. BMDC que contribuem para a população de ALAF activado na pancreatite crónica e cancro do pâncreas têm fenótipos diferentes, e podem desempenhar papéis importantes nessas doenças. Além disso, o transplante de medula óssea pode fornecer um modelo útil para o estudo das interações tumor-hospedeiro em câncer e pancreatite
Citation:. Scarlett CJ, Colvin EK, Pinese M, Chang DK, Morey AL, Musgrove EA, et ai. (2011) recrutamento e ativação de células pancreáticas estreladas da medula óssea no cancro do pâncreas: Um modelo de interação tumor-hospedeiro. PLoS ONE 6 (10): e26088. doi: 10.1371 /journal.pone.0026088
editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |
Recebido: 19 Agosto, 2010; Aceite: 19 de setembro de 2011; Publicação: 14 de outubro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Scarlett et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (CINSW), o Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho (NHMRC) da Austrália, The Cancer Council de Nova Gales do Sul, Fundação Clínica do St. Vincent, o Royal Australian College of Surgeons, o cancro do Australian Research Foundation, eo RT Municipal Trust. AVB, CJS, DKC, EAM e EKC são apoiados por bolsas de estudo do CINSW. RLS é um Fellow Diretor Sênior do NHMRC e ocupa a Cadeira Petre do cancro da mama Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas (PC) continua a ser um dos cancros mais devastadores, e é a quarta principal causa de morte por cancro nas sociedades ocidentais, com uma taxa de sobrevivência de menos de 5% [1]. Nada além de ressecção pancreática numa proporção de pacientes (10-20%), oferece qualquer potencial curativo, com agentes quimioterapêuticos que satisfazem sucesso limitado [2]. A pancreatite crônica é um fator de risco significativo para o desenvolvimento de câncer de pâncreas e ambos são caracterizados por extensa fibrose mediada por células estreladas, que no caso do câncer de pâncreas facilita a progressão e metástase de câncer [3], [4]. Recentemente, Olive
et ai
[5] demonstraram que, por direccionamento do estroma usando inibidores da sinalização de hedgehog, melhora significativamente a entrega de agentes quimioterapêuticos para o compartimento epitelial do tumor e, embora o efeito era transiente, melhorou eficácia global. Além disso, Kraman
et al
demonstrado que a segmentação sub-populações específicas de células do estroma para a destruição poderia remover seu efeito inibidor sobre a resposta imune do hospedeiro ao tumor [6].
As observações feitas nos últimos anos anos demonstraram que as células-tronco adultas têm notável flexibilidade em seus repertórios de diferenciação. Esta plasticidade permite que as células-tronco adultas, particularmente aqueles de origem da medula óssea, para enxertar alternativa locais não hematopoiéticas e transdifferentiate em tipos de células necessárias para o seu novo nicho. Isto é particularmente evidente quando o órgão destinatário está danificado [7], [8]. células derivadas da medula óssea (BMDC) pode enxertar ou fusível para adotar, ou ser reprogramado, para o estado diferenciado dos epitélios em particular [9] (revisto em [10]). Isto sugere que a célula estaminal endógena de um órgão, e o seu papel no crescimento e regeneração, não se limita a cada órgão específico, mas pode ser um sistema dinâmico que envolve BMDC circulante com a nichos de células estaminais que regulam o recrutamento, proliferação e diferenciação [7], [11]. Isto pode ter implicações significativas sobre a evolução dos casos de câncer em vários órgãos sólidos, incluindo pâncreas. Houghton
et ai demonstraram que num modelo de
carcinogénese gástrica induzida por Helicobacter felis
, o desenvolvimento de metaplasia e displasia foi ligado ao enxerto e expansão da população BMDC, eventualmente, dar origem a gástrico adenocarcinoma [12]. Observações em mulheres que receberam transplantes de medula óssea a partir de dadores macho, e que, subsequentemente, desenvolveu um cancro, identificou-se que miofibroblastos (pancreático equivalentes de células estreladas) dentro destes tumores foram derivadas a partir da medula óssea do dador [13].
A maioria dos estudos anteriores que avaliam o papel da BMDC na regeneração e reparação de pâncreas têm se concentrado em restaurar a função endócrina após a lesão de células ilhotas [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Poucos estudos centraram-se na contribuição de BMDC para o crescimento e regeneração do pâncreas exócrino, ou seu papel no câncer de pâncreas. Wang
et al
[22] descrevem a contribuição de BMDC à formação ducto pancreático em ratos neonatais, Marrache
et al
[23], e Watanabe
et al
[24 ] demonstrar num modelo de pancreatite crónica induzida por ceruleina BMDC que contribuem para a população de células estreladas do pâncreas, sugerindo um papel na reparação de tecidos, enquanto que, mais recentemente, Pan
et al [25] identificou uma contribuição de BMDC ao estreladas pancreático população de células em um modelo de rato de carcinogénese química.
Aqui nós geramos um modelo robusto de transplante de medula óssea inteira para mostrar que na carcinogénese do pâncreas, e na pancreatite crónica, BMDC contribuir significativamente para o pâncreas de células estreladas activadas (PASC ) população. Aqueles associados com cancro do pâncreas expressam genes característicos das células estreladas peritumoral, em comparação com aqueles que não estão associados com a malignidade, sugerindo que BMDC podem desempenhar um papel importante no apoio a carcinogênese pancreática. Além disso, esses modelos de transplante de medula óssea pode ser útil na investigação de interações tumor-hospedeiro
in vivo
.
Métodos
Declaração de Ética
Todos os animais trabalho foi aprovado pelo Instituto Garvan do Comité de Investigação médica /St Vincent Hospital animal Ética (Protocolo # 06/53).
Transplante de medula óssea
medula óssea total foi colhida a partir de macho C57 /BL6 -TgN (ACTbEGFP) IOsb /J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EUA; doravante referida como a β-actina-EGFP mouse) através de lavagem tíbias e fêmures com Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, Eugene, OR, EUA) utilizando uma agulha 26G. As células foram filtrados através de um filtro celular de 70 uM, contado, em seguida, lavadas e ressuspensas em PBS. 5 × 10
6 β-actina-EGFP células da medula óssea foram transplantadas para irradiados (950 Rads; Gammacell 40 Exactor; Nordion International Inc. Canadá) destinatário 4-8 semanas fêmea C57 /B6 ratos velhos através da veia da cauda. Os ratinhos receberam água antibiótico (40 mg /5 mL + trimetoprim 200 mg /5 ml de sulfametoxazol) durante 14 dias. Enquanto o uso de reforçada da proteína fluorescente verde (GFP) tornou-se o marcador de escolha para os diversos tipos de transplante de células e experimentos de marcação de linhagem, não é claro que a GFP expressa em células estaminais da medula óssea continuaria a ser expressa em não-hematopoiéticas tecidos seguintes reprogramação nuclear [26], [27], [28]. Consequentemente, foi realizada género transplantes incompatíveis para rastrear o destino das células derivadas do doador utilizando o cromossomo Y marcador genotípica para validar os resultados observados usando o repórter GFP.
normal Pâncreas
Os ratos foram sacrificados 3 (n = 12), 6 (n = 12), 9 (n = 12) e 12 (n = 11) meses após o transplante (Figura 1). Em cada ponto de tempo, o pâncreas foi colhido, cortados ao meio e colocados em ambos os 10% de formalina tamponada neutra, em seguida, embebidas em parafina, ou incorporado no frio Tissue-Tek OCT Composto (Sakura Finetek, Torrance, CA, EUA) e congeladas rapidamente em líquidos N
2. fenótipo celular de células derivadas de doadores dentro do pâncreas foram avaliados por imuno-histoquímica, imunofluorescência e
in situ
hibridação para o cromossomo Y. Para monitorizar o enxerto de β-EGFP-actina de dadores de medula óssea, sangue periférico foi avaliado para a positividade GFP usando fluorescência de células activadas (FACS) na altura do transplante de pós 1 mês, em seguida, após sacrifício (Tabela 1).
5 × 10
6 células da medula óssea de ratinhos β-actina-EGFP macho fêmea foram transplantadas para ratinhos irradiados letalmente B6 C57 /. Para a avaliação do pâncreas normais, pancreata foram colhidas em 3, 6, 9 e 12 meses pós-transplante. Para pancreatite crónica, os ratinhos foram administrados por via intraperitoneal durante 10 Ceruleína semanas depois sacrificados após a cessação do tratamento, bem como 3, 6 e 9 meses pós tratamento para avaliar a regeneração. Para o câncer de pâncreas, em 1 mês ratos pós transplante foram administradas uma injeção intrapancreática de 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA) e sacrificados por 4, 8, 12 ou 12 meses após o tratamento DMBA ou quando foi detectada uma massa pancreática
crônica Pancreatite
Um mês após o transplante, os ratos foram injectados intraperitonealmente com 50 mg /kg de ceruleina (# 152860; MP Biomedicals Inc., Solon, OH, EUA), 5 vezes mais de 4 horas consecutivas, duas vezes por semana durante 10 semanas, como descrito anteriormente [29]. Os ratinhos foram sacrificados após a conclusão do tratamento caeruleina (n = 8) e 3 (n = 8), 6 (n = 8) e 9 (n = 8) meses após caeruleina tratamento para avaliar a regeneração do pâncreas. Um braço adicional avaliou a regeneração do pâncreas em ratos tratados com ceruleína aos 6 meses após o transplante e sacrificados em 3 meses após a interrupção do tratamento ceruleina (n = 4) (Figura 1).
Química Modelo de câncer pancreático
um mês após o transplante, os ratinhos foram anestesiados com isofluorano e uma incisão subcostal lateral esquerdo na parede abdominal foi realizada e o baço exteriorizou para revelar o corpo e cauda do pâncreas. 1 mg /50 uL de 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi dissolvido em PBS /TWEEN a 0,1% e injectado na cauda do pâncreas, usando uma agulha de 25G, como previamente descrito [30 ]. O baço e o pâncreas foram devolvidos para a cavidade abdominal e do peritoneu /camadas de músculo e a pele foram suturados fechada. Os ratinhos foram sacrificados entre 1-4 (n = 16), 5-8 (n = 6), 9-12 (n = 4) e 12 (n = 2) semanas após o tratamento com DMBA ou quando foi detectada uma massa pancreática seguinte palpação abdominal (Figura 1). Tal como acontece com o modelo de pancreatite crónica, um braço adicional avaliada a contribuição de BMDC a carcinogénese pancreática após a indução com DMBA, tanto a 6 (n = 10) e 9 (n = 10) meses após o transplante.
análise FACS
glóbulos periféricos e medula óssea foram analisados para a expressão de GFP usando células activadas por fluorescência (FACS) (Tabela 1).
sangue periférico.
em 1 mês pós transplante e no sacrifício, o sangue foi recolhido através de sangria da cauda e coletado em BD microtainers com lítio /heparina (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). 1000 ul FACSlyse (1X) foi então adicionada e incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 1000 g durante 5 minutos, o sobrenadante foi removido e as células ressuspensas em 200 ul de PBS frio em gelo até à análise.
Medula Óssea.
A medula óssea foi lavada do fémures de ratinhos transplantados com PBS frio, utilizando uma agulha de 26G, filtrou-se através de um filtro celular de 70 fiM e mantido em gelo até à análise. A análise de separação de células activada por fluorescência (FACS) foi levada a cabo usando um BD FACS CANTO (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA).
A imuno-histoquímica /Imunofluorescência /hibridização in situ de
A imuno-histoquímica.
embebidos em parafina cortes de tecidos pancreáticos (4 mm) foram de-encerado e reidratados antes de H e coloração para avaliar a morfologia histológica. Para imuno-histoquímica, desmascaramento antigénio foi conseguida utilizando uma solução de meta-recuperação (s2367, pH 9,0: DAKO Corporation, Carpenteria, Califórnia, EUA) durante 30 minutos num banho de água a ferver. A actividade da peroxidase endógena foi extinta com peróxido de hidrogénio a 3% (5 minutos), lavadas em tampão de DAKO (DAKO Corporation), em seguida, as lâminas foram bloqueadas com bloco de proteína DAKO (10 minutos; DAKO Corporation). As secções foram então incubadas durante 60 minutos com anticorpo primário (ver abaixo), em seguida, foi usado um sistema de detecção anti-coelho marcado polímero peroxidase de rábano (30 minutos; Envision + anti-coelho; DAKO Corporation) e 3,3′-diaminobenzidina foi utilizada como um substrato. Contra-coloração foi realizada com hematoxilina de Mayer (DAKO Corporation).
imunofluorescência.
Para a análise de imunofluorescência, 4 uM secções de parafina foram de-encerado, re-hidratados e antigénio recuperado como descrito acima. As secções foram então bloqueadas com bloco de proteína (10 minutos), em seguida, anticorpos primários (ver abaixo) foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, lavou-se em tampão de DAKO (3 × 5 minutos) e incubadas em anticorpos secundários (ver a seguir) durante 1 hora à temperatura ambiente. coloração fluorescente das membranas apicais de células acinares exócrinas foi realizada utilizando aglutinina de amendoim rodamina conjugada (PNA; 1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). As lâminas foram lavadas em seguida, contrastadas e montadas em Vectashield dureza média com DAPI montagem definida (H-1500; Vector Laboratories)
Anticorpos Primários:. GFP policlonal de coelho (A11122; Invitrogen, Eugene, OR, EUA; 1: 1000 IHC, 1:200 SE), a GFP de cabra policlonal (ab5450; Abcam, Cambridge, MA, EUA; 1:1000), amilase de cabra policlonal (C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA; 1 :200 IF), desmina (Thermo Scientific, Fremont, CA, EUA; 1:200 IHC), músculo α-Smooth actina de rato monoclonal (clone 1A4; A5228; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA, 1: 1: 500 IHC /IF), Vimentin (SP-20; Epitomics, Burlingame, CA, EUA; 1:200 IHC), Cytokeratin 5/6 (D-13; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA; 1: 100 IHC), proteína ácida fibrilar glial (GFAP) policlonal de coelho (Z0334; DAKO Corporation, Carpenteria, Califórnia, EUA; 1:50), de pré-células B factor de transcrição 1 leucemia (PBX1) policlonal de coelho (ab12001; Abcam, Cambridge , MA, EUA; 1:100), caderina EGF LAG sete-pass receptor G-tipo 3 (CELSR3) policlonal de coelho (ab12958; Abcam, Cambridge, MA, EUA; 1:100)
Os anticorpos secundários:. Anti-coelho Cy5 (1:250; # 711-176-152; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA), Cy5 anti-cabra (1:250; # 705-175-003; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA), Cy3 anti-cabra (1:500; # 715-166-147; Jackson ImmunoResearch), anti-rato Cy3 (1:500; # 715- 166-150; Jackson ImmunoResearch)
hibridização in-situ
rato inteiro Y sonda cromossomo marcado com fluoresceína (Star * FISH, # 1189-YMF-01;.. Cambio Ltd) foi aplicado 3 UM secções de parafina seguintes desparafinização em xileno, pré-tratamento com a solução de recuperação alvo DAKO (TRS: 30 minutos a 95 ° C), a digestão de protease a 37 ° C durante 15 minutos e pós-fixação em formalina tamponada neutra a 10 minutos. site de hibridação foi seleccionado por referência a uma secção de série coradas com H + E. 3,5 mL sonda foi aplicada sob uma lamela 15 × 15 mm selada com cimento de borracha. Co-desnaturação a 90 ° C foi seguido por hibridação durante a noite a 37 ° C sobre um bloco do termociclador. Depois de pós-hibridação lavagens em 2X SSC /0,3% de NP-40 (2 × 2 minutos a 72 ° C), as lâminas foram secas e contrastadas com DAPI. Sinal foi analisado com um microscópio Zeiss Axioscope II com AxioCam digital e software AxioVision.
Resultados
reconstituição bem sucedida de medula óssea em ratos transplantados foi demonstrável no sangue periférico em 1 mês pós-transplante usando análise FACS por expressão da GFP. Além disso, o enxerto a longo prazo foi verificada no momento do sacrifício. GFP positividade de sangue periférico e medula óssea em cada ponto temporal era comparável à do β-actina-EGFP doadoras de ratinho (Blood, 70,07% ± 3,90 SEM; Medula, 30,87% ± 1,60 SEM). (Tabela 1)
BMDC e pâncreas exócrino normais
a partir de 3 meses após o transplante, indivíduo, as células positivas para GFP derivadas de dador foram vistos no interior do compartimento epitelial pancreática exócrina de ratinhos de controlo transplantados não tratados (figura 2A). As células positivas para GFP pequenos que tinham a morfologia das células fusiforme, ou imune foram dispersos ao longo do interstício (dados não apresentados), enquanto ocorrência rara de células positivas para GFP com morfologia acinar se presentes no compartimento de exócrina. Depois de muitos exames usando co-imunofluorescência, essas células foram positivas para GFP, amilase e aglutinina de amendoim (Figura 2C, 2D), marcadores específicos para células pancreáticas acinar, sugerindo que BMDC pode incorporar no pâncreas adultos e adotar o estado diferenciado do exócrina compartimento. grupos coesos de 2-3 células foram observadas a partir de 6 meses após o transplante, enquanto as unidades acinares inteiras ocasionais que consistem em células GFP positivas provenientes do doador também eram evidentes (Figura 2B, 2E, 2F).
GFP imuno-histoquímica de pancreata identificada GFP indivíduo + ve células derivadas do dador e com a morfologia de células acinares a partir de 3 meses após o transplante (A), e as unidades inteiras acinares ocasionais (B), foram observados a partir de 6 meses pós-transplante. imagens de imunof luorescência de doador de derivados de GFP + ve células acinares co-coloração positiva tanto para GFP e amilase (C, E); e GFP e PNA (D, F).
BMDC e pâncreas lesão
Um braço experimental para avaliar o enxerto de doador BMDC no pâncreas lesão específica (pancreatite crônica) e regeneração também foi estabelecida. Após 10 semanas de tratamento caeruleina, ratinhos tinham pâncreas que tivesse atrofiado, e fibrose peri-acinar desenvolvido como uma malha fina em toda a glândula exócrina. Intra-acinar lumina estavam dilatadas. Algumas unidades acinares apareceu para desenvolver um fenótipo ductal com perda de grânulos de zimogénio e mais núcleos localizados centralmente. Estes complexos tubulares consistiu de cilindros com uma vasta lúmen revestidas por uma monocamada de células do ducto-like achatadas (Figuras S1B, E) [31], [32]. pancreata controle foram histologicamente normal (Figura S1A). Sirius coloração vermelha de colágeno intersticial foi mais proeminente nos ratos tratados Ceruleína, indicativo de lesão crônica. Coloração em animais de controle foi localizada principalmente em torno de dutos, pequenos vasos sanguíneos com finos fios que se estende entre lóbulos maiores, e unidades acinares não em torno individuais. Nos animais tratados Ceruleína periacinar colagénio aumentou, em torno de unidades acinares individuais, semelhante à fibrose observada em pancreatite crônica (Figuras S1D, E) humana.
Após interrupção do tratamento ceruleina (3 meses após o transplante imediatamente após a lesão) houve aumento do recrutamento para o pâncreas BMDC (Figura 3A). Isto incluiu o recrutamento de células inflamatórias GFP positivas, tais como os linfócitos (positivas para a expressão de CD45; dados não mostrados) e os macrófagos, enquanto alguns BMDC localizados intersticialmente foram positivas para desmina, e células peri-acinar fusiformes possuía a morfologia de células estreladas pancreáticas ( ALAF de; Figura 3C). Sem células acinares foram identificados como sendo derivadas do doador (GFP positivo) neste ponto de tempo inicial.
a presença aumentada de células positivas para GFP dentro do interstício do pâncreas feridas, incluindo infiltrado inflamatório (A), quando comparado com o pâncreas regenerado (B); bem como as células GFP positivas fusiformes (setas pretas), com uma morfologia de células estreladas pancreático (C) que circundam as unidades acinares (a); (D) cromossomo Y FISH confirmou a contribuição mínima de BMDC à regeneração de parênquima exócrina, enquanto alguns linfócitos Y positivos foram observados no parênquima (setas brancas).
BMDC e pâncreas regeneração
Após interrupção do tratamento ceruleina, os animais foram deixados a recuperar para avaliar a contribuição de BMDC à regeneração do pâncreas. Após 3 meses de recuperação pós cessação do tratamento caeruleina, os pâncreas dos animais tratados devolvido para um fenótipo normal histologicamente (Figura S1C), que se assemelha ao dos animais não tratados. Uma redução de colágeno intersticial e periacinar também foi visível (Figura S1F). Quanto pâncreas normal, apenas ocorrências raras de grupos individuais e pequenos de células positivas acinares GFP exibindo amilase e PNA positividade foram observados, sugerindo que BMDC poderia adotar o estado diferenciado do compartimento de exócrina durante a regeneração do pâncreas. células inflamatórias positivas para GFP intersticial estavam diminuídos em número com o tempo de regeneração aumentada (Figura 3B). Resultados semelhantes foram observados para os ratinhos que foram tratados com ceruleína seguintes enxerto a longo prazo (6 meses pós-transplante) e deixado a recuperar.
In situ
hibridação para o cromossomo Y confirmou que não houve aumento na contribuição de BMDC ao pâncreas exócrino com a regeneração (Figura 3D).
BMDC e câncer pancreático
Duas semanas após a injecção de DMBA, complexos tubulares estavam presentes focalmente entre células acinares com metaplasia ductal adjacente ao tecido acinar normal observado por um mês. A partir de 1 mês após o tratamento com DMBA, as lesões precursoras pancreáticas (mPanIN) com diferentes graus de displasia estavam presentes. Focos de adenocarcinoma em relação ao mPanIN foram vistos no pâncreas de 2 meses depois de DMBA, ao passo que o adenocarcinoma ductal (variante sarcomatoide) desenvolvido em 3-4 meses (Figuras S1G-I). Este fenótipo se assemelhava ao observado em um modelo semelhante usado por Kimura et al [30].
Nós avaliamos a contribuição de BMDC ao estroma desmoplásico, em especial para a população de células estreladas pancreáticas, avaliando co- expressão de GFP e a células estreladas marcadores selectivos desmina, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), α-actina de músculo liso (αSMA), a co-expressão dos quais define células estreladas activadas [3], [33], [34] ( revisto em [35]). Estes marcadores, originalmente identificadas como ALAF específico, são usados para distinguir ALAF de a partir de fibroblastos normais, devido à co-expressão do intermediário proteínas de filamento desmina e GFAP [33], [34], enquanto que a expressão de αSMA em ALAF do foi originalmente descrito como um fonte de fibrose na pancreatite crônica e câncer pancreático, designando activado de PASC [3], [36]. Não foi significativo o recrutamento BMDC ao estroma circundante lesões precursoras após o tratamento com DMBA, com a contribuição de BMDC à população activada de células estreladas pancreático (GFP, desmina e αSMA positivo; Figura S2A, C, E). A análise de co-imunofluorescência demonstraram também que derivados do dador BMDC positivo tanto para GFP e αSMA estava presente nas células directamente adjacentes a neoplasia intra-epitelial pancreáticas (mPanIN) lesões (Figura S2B, D, F). Também se observou o desenvolvimento de um tumor citoqueratina grande, fracamente diferenciado e invasivo positivo /vimentina negativa adenocarcinoma ductal (sarcomatoide) com uma população BMDC significativa (Figura 4A, 4B), que incluiu uma extensa infiltrado inflamatório doador derivado, demonstrado por FISH para o Y-chromosome (Y-FISH; Figura 4C), bem como células de medula óssea derivados activados pancreáticas estreladas (Figura 4D), visualizadas por co-imunofluorescência de GFP com αSMA (Figura 4D). da medula óssea as células tumorais epiteliais derivadas não foram observadas. Foram quantificados a proporção de BMDC dentro do microambiente do tumor, em 5 campos poder de ampliação elevada (400X) e determinado que 41,8% (± 2,77 SEM) de células foram derivadas da medula óssea (Figura 4). Resultados semelhantes foram observados quando administrada DMBA seguinte enxerto a longo prazo (6 meses após o transplante)
(A) H . E mostrando o tumor pancreático pouco diferenciado, invasivo; (B) GFP IHC e (C) PEIXES cromossoma Y, demonstrar a medula óssea derivada grande população de células dentro do tumor; (D) Co-imunofluorescência de GFP com células estreladas ativadas medula óssea αSMA identificados derivados dentro do tumor (seta).
Mais recentemente, Erkan
et al
[37] utilizado transcrição perfilar para identificar marcadores para diferenciar de ALAF associada a pancreatite crónica versus os de cancro do pâncreas, com o objectivo de subtipagem de ALAF em um ou outro ou inflamação associada a cancro. -Célula pré B factor de leucemia transcrição 1 (PBX1) foi regulada positivamente em ALAF associada à inflamação da comparação com associado a um tumor de ALAF de, enquanto caderina EGF LAG sete passagens receptor de G-tipo 3 expressão (CELSR3) foi regulado positivamente na comparação de ALAF associado a tumores ao de ALAF associada à inflamação de [37]. Foram examinados secções de 5 cada um dos 3 ratinhos que desenvolveram adenocarcinoma e observados que GFAP, PBX1 e CELSR3 expressão foi co-localizada com GFP no tumor associado de ALAF (Figura S3A, S3B, S3C, respectivamente), e apesar PBX1 (mas não CELSR3) foi detectada no estroma na pancreatite, ele não co-localizar com GFAP, sugerindo que não foi expressa em células estreladas ativadas.
Discussão
transplantes de medula óssea todo gênero-incompatíveis demonstrou que BMDC migrar para o pâncreas e expandir-se como unidades clonais para adoptar os estados diferenciados do compartimento de exócrina. Embora não foi mínima recrutamento para a população de células acinares, que não aumentou com ferimentos, a regeneração, ou carcinogénese, houve recrutamento significativo para o estroma. Embora a maioria das células recrutadas durante a lesão aguda e cancro eram células inflamatórias, uma proporção diferenciadas em células estreladas. Aqueles associada com o cancro expressa marcadores característicos de células estreladas associados a tumores, sugerindo que eles eram co-optou, e modificado pelo microambiente do tumor.
Embora a capacidade de regeneração é mantida no pâncreas exócrino adulto, a origem de regeneração do epitélio restos claro [38]. Recentemente, um mecanismo de desenvolvimento clonal de ácinos pancreáticos tenha sido descrita com evidência desde que uma única célula progenitora, quer se trate de uma célula acinar maduro ou uma célula estaminal multipotente, dá origem a todas as células exócrinas de um ácino [39]. Além disso, estudos de rastreamento de linhagem fornecem evidências de que novas células acinares são gerados a partir de células acinares pré-existentes seguinte pancreatectomia parcial [40] e ceruleína pancreatite induzida [41]. Tendo em conta estes dados e as nossas observações no pâncreas normais, a hipótese de que BMDCs contribuir para a regeneração do compartimento de exócrina. Apesar de usar diferentes protocolo de lesão pontos de tempo não fomos capazes de demonstrar um aumento significativo na contribuição BMDC para a população de células acinar. Y dados cromossomo PEIXES excluídos GFP silenciamento [42], [43], [44] como uma causa potencial de falta de expressão GFP, e refletiu a distribuição de células positivas para GFP.
PASC de são células miofibroblastos como residentes existentes em o espaço periacinar do pâncreas exócrino, e existem cada vez mais provas que sugerem que eles são os participantes-chave na patogénese de doenças exócrinas pancreáticas, particularmente na produção de abundante estroma fibroso, o que é uma característica do cancro do pâncreas [3]. Embora não foi significativa BMDC recrutamento para o infiltrado inflamatório no momento da lesão pancreática consistentes com relatórios anteriores [45], [46], esta foi números de células transientes e diminuiu ao longo do tempo a níveis baixos quando a regeneração estava completa. No entanto, as células estreladas manteve-se entre a população residual de BMDC. Esta observação sugere que BMDC desempenhar um papel importante no apoio do processo regenerativo, mas não transformam a contribuir para o próprio epitélio regenerativo. Associados a tumores BMDC ALAF do pode ser retida no estroma peri-tumoral, ao passo que aqueles associados com pancreatite não são. Embora o número de medula óssea derivada de ALAF foi ligeiramente inferior na definição de pancreatite em relação ao cancro, pontos de tempo mais longos seria necessária para determinar se BMDC foram preferencialmente retido no pâncreas na definição de cancro.
Tal como no crónica pancreatite, houve aumento do recrutamento de BMDC para o pâncreas após tratamento com DMBA. Este novo incluiu um infiltrado inflamatório e ativado PASC de. Importante, a expressão de CELSR3 em BMDC associado com o tumor sugere que houve modificação destes ALAF de pelo microambiente do tumor. Esta é suportada por estudos recentes em que as células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea, preferencialmente, para localizar regiões de crescimento de tumor pancreático [47] e foram mostrados para transformar em miofibroblastos associados a tumores em insulinomas [48]. células de cancro do pâncreas segregam factores de crescimento tais como TGF-β1, PDGF e VEGF, assim como a matriz extracelular (ECM) indutores de metaloproteinase que transformam os normalmente quiescentes ALAF de em um-tipo miofibroblastos activados fenótipo e secretam quantidades excessivas de ECM e enzimas matriz degradante [ ,,,0],3], [4], [49] (revisto em [50]).