Abstract

antígeno O tumor de MUC1 associada é altamente expressa em uma variedade de tumores. A sua ampla distribuição em tumores primários e metástases torna um alvo atractivo para imunoterapia. Depois de MUC1 síntese é clivada, obtendo-se uma grande subunidade alfa solúvel extracelular contendo repetições em tandem da matriz de domínio (TRA) especificamente ligado, através de interacção não-covalente, a uma subunidade beta menores que contêm os domínios transmembranar e citoplasmático. Até agora, a eficácia inconclusivos foi reportado para os anticorpos anti-MUC1 dirigidos contra a subunidade alfa solúvel. A segmentação da subunidade beta ligado à célula, pode ignorar limitações impostas por domínios TRA circulação. péptido de sinal de MUC1 (SP) de domínio se liga promiscuamente múltipla MHC de classe II e classe I alelos, o qual após a vacinação, gerados a imunidade de células T contra tumores robusta MUC1-positiva. Esta é uma primeira demonstração de não-MHC associadas, MUC1, superfícies presença de células específicas para o domínio de MUC1 SP. Os anticorpos policlonais e monoclonais gerados contra o domínio de MUC1 SP ligam-se especificamente uma grande variedade de linhas celulares de tumores sólidos e hematológicos humanos MUC1-positivo; de medula derivada de células-MUC1 positivo do osso de plasma obtidas a partir de mieloma múltiplo (MM) -Pacientes, mas as células de tumores não MUC1 negativas e células de sangue primário e ingénuos epiteliais normais. Membranar MUC1 SP aparece principalmente como uma entidade independente, mas também co-localizada com a molécula MUC1 completo. MUC1-SP ligação em células plasmáticas BM-derivados podem auxiliar na selecção de doentes específica a ser tratada com anti-MUC1 SP vacina terapêutica, ImMucin. Um potencial terapêutico dos anticorpos anti-MUC1 SP foi sugerido pela sua capacidade para suportar de lise mediada pelo complemento das células do tumor de MUC1-MUC1 positivo, mas não as células tumorais negativas e células epiteliais primárias normais ingénuos. Estes achados sugerem uma presença de superfície celular novo de domínio MUC1 SP, um benefício terapêutico potencial para anticorpos anti-MUC1 SP em tumores MUC1-positiva e uma ferramenta de selecção para pacientes de MM a ser tratado com a vacina anti-MUC1 SP, ImMucin.

Citation: Kovjazin R, Corno G, Smorodinsky NI, Shapira MEU, Carmon L (2014) Surface-Associated celular Anti-MUC1-Derived Signal Peptide Antibodies: Implicações para o cancro Diagnóstico e Terapia. PLoS ONE 9 (1): e85400. doi: 10.1371 /journal.pone.0085400

Autor: Stefan Dübel, Universidade Técnica de Braunschweig, Alemanha |

Recebido: 09 de outubro de 2013; Aceito: 05 de dezembro de 2013; Publicação: 08 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kovjazin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa No. 48.447 do cientista-chefe de Israel do Ministério da Indústria, Comércio e Trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Lior Carmon é o fundador e CEO e Riva Kovjazin, e é um cientista sênior da Vaxil BioTherapeutics Ltd., uma empresa start-up que está desenvolvendo ImMucin, uma vacina terapêutica anti-MUC1 SP contra tumores MUC1-positivo. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os outros autores declaram não haver conflitos de interesse.

Introdução

MUC1 é uma glicoproteína mucina-como altamente expresso numa série de carcinomas epiteliais, incluindo pulmão, mama, ovário, próstata e cólon, como bem como na superfície de tumores hematológicos, tais como mieloma múltiplo (MM) [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Sua ampla distribuição em ambos tumor primário e metástases, incluindo células-tronco cancerosas [7], estabeleceu-o como um alvo amplamente explorado para imunoterapia [1], [8], [9], [10]. Na verdade, MUC1 foi listado pelo projecto-piloto Instituto Nacional do Câncer como o segundo destino mais promissor a partir de uma lista de 75 potenciais antígenos associados a tumores (TAA) [11].

MUC1 existe em um número de isoformas [12 ], em que a forma mais extensivamente estudado é o tipo polimórfica I proteína transmembranar (TM-MUC1), que consiste de um domínio extracelular que contém 20-125 matrizes 20-amino-ácidos de comprimento de repetição em tandem (TRA), seguido de um domínio transmembranar e uma curta cauda citoplasmática [13], [14]. MUC-1 é processado na via secretora, dando origem a uma grande subunidade alfa do domínio extracelular contendo TRA, não-covalentemente a uma subunidade beta menor contendo transmembranar da molécula e domínios citoplasmáticos [15]. Até à data, enquanto que a maioria dos anticorpos anti-MUC1 como alvo o domínio TRA da subunidade alfa extracelular [16], [17], [18], estudos têm mostrado resultados contraditórios sobre a eficácia imunoterapêutico de tal à base de anticorpo TRA-epitopo segmentação [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Estes resultados inconsistentes são propostos como sendo a consequência da ligação não-covalente do domínio TRA à superfície de células de tumor; a forma solúvel, que circula actua como um chamariz para anticorpos anti-tra, limitando a sua capacidade para atingir as células tumorais que expressam MUC1 [23], [25]. Consequentemente, visando MUC1 epítopos noncirculating exclusivamente expressa na superfície das células do tumor pode potencialmente contornar essas limitações. Para este efeito, os segmentos de epitopos extracelulares e intracelulares que rodeiam o domínio MUC1 TRA, juntamente com epítopos dentro do péptido de sinal MUC1 (SP) de domínio, foram identificados [20], [21], [27], [28].

SPs são sequências de longa de ácidos aminados 13-50 curtas lipofílicos tipicamente localizados no terminal amino de proteínas destinadas à secreção ou integração para dentro das membranas celulares [29]. Uma vez que a tradução da proteína é completado, os SPs incorporados no retículo endoplasmático (ER) da membrana são geralmente removidos a partir da proteína madura, mas ainda pode entrar no lúmen ER e ligam-se as moléculas de MHC, quer directamente, devido à actividade de protease única de ER-por membrana peptidase associada peptídeo sinal (SPP) [29], ou indiretamente, como outras sequências degradadas, via o transportador associado com processamento de antígenos (TAP) máquinas [30]. No entanto, ER localização e proficiência de ligação MHC de SPs [31] depende tanto da sua natureza hidrofóbica e sequência específica. Ou seja, ao lado de manutenção do motivo de consenso requerido como um sinal de direccionamento, SPs diferentes exibem elevada variabilidade e especificidade de antigénio [29], [33] [32]. Por conseguinte, os domínios SP podem servir como vacinas candidatas (VCS), a indução de respostas imunitárias específicas para o antigénio em uma grande parte da população.

O domínio SP 21-mero de MUC-1 (MUC1 SP), aqui o MUC1- SP-L ou péptido VXL100 ou a vacina formulada terapêutico, ImMucin [28], é processado e apresentado em associação com múltiplos de MHC de classe I e II na superfície da célula tanto de antigénio de células e várias células de tumor de MUC1 positivo apresentando, o que pode gerar robusto imunidade de células T contra tumores MUC1-positivas [28]. Além disso, uma resposta humoral específica-MUC1 pode ser gerado contra MUC1 SP, que se manifesta por uma elevação significativa de auto-anticorpos naturais na corrente sanguínea de pacientes de MM, mas não em dadores saudáveis ​​[34]. Desde solúvel MUC1 SP não foi detectado no soro dos pacientes [34], foi especulado que os auto-anticorpos naturalmente gerados foram sensibilizados por MHC-restrita não, SP-MUC1 associado a um tumor ligado às células. O estudo atual explorou essa possibilidade através da geração de anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais específicos para MUC1-SP-G. presença de superfície celular da proteína MUC1 SP foi detectado, utilizando os anticorpos criados, em linhagens de células tumorais e de tumores primários, mas não em células primárias naive. Além de sua actividade anti-tumoral potencial terapêutico directo, estes anticorpos podem melhorar os critérios de selecção de pacientes de MM destinadas a ser tratado com a vacina terapêutica anti-MUC1 ImMucin SP.

Materiais e Métodos

Peptide Synthesis

MUC1-SP-G, MUC1-SP-H, MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2, MUC1-SP-S3, MUC1-SP-S4, MUC1-SP-S5 e TB-Rv0476 /4941-SP-L foram sintetizados por totalmente automatizado, em fase sólida, a síntese de péptidos utilizando fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) /-tBu estratégia e resina de Rink-amida-poliestireno (EMC Microcollections, Alemanha e Ciências ALMAC, UK). MUC1-TRA-L e BAGE-SP-L foram sintetizados utilizando a mesma metodologia (GL Biochem, China). pureza peptídeo e identidade foi . 95%, como determinado por cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massa analisa

O tumor de células-linhas e hibridomas

As linhas de leucemia linfocítica B-humanas Raji e Ramos , a linhas celulares de mM humano U266, e RPMI8226 e a linha PC leucemia humana ARH-77 foram cultivadas em suspensão em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 1% de aminoácidos não essenciais, 1 mM de HEPES e 50 ug /ml de gentamicina. A linha de carcinoma do ovário humano OVARCAR-3 foi cultivada como uma monocamada aderente em meio RPMI-1640 suplementado com 20% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 50 ug /ml de gentamicina. A linha de carcinoma do ovário humano ES-2, a linha de melanoma SK-MEL-28, as linhas celulares de cancro da mama MCF7, MDA-231 e MDA-453, e foram cultivadas como monocamadas aderentes e a linha de melanoma humano SK-MEL-1 foi cultivada em suspensão em DMEM, suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 50 ug /ml de gentamicina. Todas as linhas celulares foram adquiridas a partir da ATCC (Manassas VA, EUA). Todos os hibridomas usados ​​neste estudo foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 50 ug /ml de gentamicina. Todos os reagentes de cultura foram adquiridos de Biological Industries, (Bet-HaEmek, Israel).

Os anticorpos

O anti-MUC1 TRA mAb H23, levantou contra a linha de células de cancro da mama humano T47D, [35 ], que reconhece o não-glicosilada APDTRP MUC1 epitopo, serviu como um controlo positivo. Rato anti-cabra ou de coelho anti-IgG de ratinho-FITC (Jackson ImmunoResearch, EUA) serviu como um controlo negativo para a análise de FACS. rato ou coelho anticorpos IgG normais (Chemicon, Millipore, EUA) foram utilizados para a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) analisa.

Animais

Oito semanas de idade camundongos fêmeas BALB /c (Tel Universidade Aviv criatório) e de dois meses de idade, coelhos (Harlan, Jerusalém, Israel) foram mantidos na unidade universidade de pesquisa animal.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo ratos e coelhos foram aprovados pela Universidade animal Care Tel Aviv Comissão.

paciente de Medula óssea (BM) aspirados e Primary Naïve saudáveis ​​células

aspirados BM (2-3 ml) foram retiradas de quatro pacientes (idades 50-75) com a progredir lentamente, assintomática MM, que haviam sido selecionados para a inscrição para a fase de ImMucin I /II de ensaios clínicos (protocolo VAXIL-001). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Hadassah, em Jerusalém, Israel o Ministério da Saúde de Israel e foi registrado no PRS como NCT01232712. A análise da PC BM-derivado foi realizada no âmbito do processo de seleção do estudo e consentimento informado por escrito dos pacientes com MM foi obtido para o uso de sua amostra para a pesquisa. Fresca humana normal BM (Cat. N ° 1 H-105) e NHEC (No. CC-2251 Cat.) Humana, foram adquiridos a partir de Lonza BioResearch (Somerset, NJ, EUA). glóbulos brancos humanos normais foram isolados de amostras buffy-coat doados pelo Banco Nacional de Sangue de Israel, a partir de 3 dadores não.

Produção de anti-MUC1 SP Anticorpos policlonais

Quatro coelhos (R22, R23, R32 e R33) foram imunizados subcutaneamente quatro vezes, em intervalos de duas semanas, com 500 ug de hemocianina de lapa (KLH) -conjugated MUC1-SP-H, emulsionado em adjuvante de Freund completo na primeira imunização e em adjuvante incompleto de Freund em imunizações subsequentes. conjugação KLH-peptídeo foi realizada por adar Biotech (Rehovot, Israel) por meio de reticulação com glutaraldeído conduzido. Sete dias após a imunização final, os soros de coelho foram examinadas quanto a presença de anticorpos específicos de MUC1-SP-H-; soros positivos (título 1:12,800) foram recolhidas e reunidas. IgG de coelho fracções de R23, denominado R23IgG, utilizado para todos os ensaios imunológicos, foram submetidos a sulfato de amónio (40%) de precipitação antes da utilização, como previamente descrito [36].

produção de anticorpos anti-MUC1 SP mAbs

Quatro ratinhos BALB /c foram imunizados por via subcutânea como descrito acima. Duas semanas após a imunização final, os ratos soros foram avaliados para a presença de anticorpos específicos de MUC1-SP-H-. As células do baço de ratinho a maior soros de rolamento positiva foram colhidas e fundidas com a linha celular NSO parceiro de mieloma murino, utilizando polietileno-glicol (peso molecular 1500) (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). Os hibridomas foram seleccionados durante 2 semanas em meio de crescimento de hibridoma suplementado com 2% de hipoxantina-aminopterina-timidina, e foram posteriormente cultivadas em meio de crescimento de hibridoma suplementado com 2% de hipoxantina-timidina. ELISA foi realizado para os sobrenadantes da cultura de tela para a presença de anti-MUC1-SP-M Abs IgG. As amostras positivas foram novamente pesquisados ​​através de ELISA e foram ainda subclonados e expandidos. Em larga escala de produção de anticorpo de clones seleccionados foi conseguido por purificação de mAbs utilizando uma coluna de agarose de IgG anti-ratinho (Sigma, Israel, Cat. A6531 não). Genotipagem das isoformas de mAbs foi realizada utilizando um kit IsoStrip (Roche;.. Cat sem 1.493.027).

O rastreio baseado em ELISA de rato hiperimune Sera e de Anti-MUC1-SP M-IgG de produção de hibridomas

placas de ELISA (F96 Maxisorp, Nunc, Dinamarca) foram activadas durante 1 h, com 0,1% de glutaraldeído (Sigma, Israel) em tampão de carbonato, pH = 9. em seguida, as placas foram revestidas com 50 ul de péptido (5 ug /ml), em tampão de carbonato (durante a noite, 4 ° C), seguida de bloqueamento (2 h, temperatura ambiente) com PBS suplementado com 5% de FBS e 0,04% de Tween 20 (ICN Biomedical Inc, EUA). As amostras de soro a partir de ratinhos SP-MUC1-H-imunizados foram então diluídas em tampão de bloqueio, enquanto as amostras a partir de culturas de hibridoma não foram diluídas. Todas as amostras foram incubadas (2 h, temperatura ambiente), antes da lavagem extensiva e de tratamento (1 h, temperatura ambiente) com rato anti-IgG conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch, EUA; 50 ul /poço), na sequência de uma diluição 1:10,000 em tampão de bloqueio. Após lavagem extensiva, as placas foram desenvolvidas com TMB solução /E (CHEMICON, Millipore, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

Para os ensaios de competição de anticorpos péptido, soros hiperimunes e meio de crescimento de hibridoma foram incubados com 1 ug /bem péptidos em placas de 96 poços de ELISA (F96 Maxisorp, Nunc, Dinamarca) activada com glutaraldeído. O resto do ensaio foi realizado como descrito acima. Uma diminuição de pelo menos 50% da OD foi considerado um resultado positivo.

citometria de fluxo e ImageStream

Para confirmar a coloração da superfície da proteína MUC1 em linhas celulares tumorais e a co-expressão de marcadores MM e MUC1 em aspirados BM, as células foram lavadas e incubadas durante 30 min em tampão de coloração, que consiste em PBS, suplementado com 3% de FBS, 10% de soro humano AB e 0,1% de azida de sódio. BM “grandes células” foram inicialmente fechado a lado vs. dispersão para a frente. Em seguida, as células foram coradas com uma ou mais das seguintes: Abs CD138-APC anti-humana comercialmente conjugados (IQ Products, Países Baixos), anti-humano leve kapa de cadeia eFluor 450 e anti-humana leve lambda de cadeia-PE (eBioscience, EUA) e /ou em preparados internamente com FITC ou PE-conjugado anti-MUC1 humana (anti-MUC1-TRA H23), anti-MUC1 SP R23IgG, SPmAb-6 e SPmAb 2,1-anticorpos. FITC e PE de conjugação foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (ligação Iluminação R-ficoeritrina Conjugação Kit, Innova Biosciences, EUA). As células marcadas foram lavadas duas vezes, fixadas em BD CellFIX (Becton Dickenson, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante, e armazenadas a 4 ° C até à análise. Pelo menos 1 × 10

6, e 3 × 10

4 eventos foram adquiridas por citometria de fluxo e fluxo de imagem, respectivamente. Para a análise ImageStream, os núcleos das células foram coradas com solução de coloração de Hoechst (3030145), de acordo com o protocolo do fabricante (MP Biomedicals, CA, EUA). A citometria de fluxo análise foi realizada com o LSR II (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, EUA) e os dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo (TreeStar, EUA). A análise foi realizada uma co-localização com o sistema ImageStream (ImageStreamX citómetro de fluxo; Amnis Corp) e analisados ​​utilizando os FIM semelhança característica Detalhe brilhante (6,0 IDEAL; Amnis Corp). A pontuação de semelhança é uma medida do grau com que duas imagens estão linearmente correlacionadas.

Microscopia de imunofluorescência

As células aderentes (5 × 104 células /poço) foram plaqueadas em lamelas de vidro (Marlenfeld GmbH Co), em placas de 24 poços, durante 18 h a 37 ° C. lamelas de vidro foram lavadas duas vezes com frio (4 ° C) PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% (20 min, temperatura ambiente), bloqueadas e permeabilizadas com PBS, suplementado com 3% de BSA e 0,1% de Triton (1 h, temperatura ambiente). Em seguida, as células foram coradas (1 h, temperatura ambiente) com anticorpos diluídos a 20 ug /ml em solução de coloração (1% de BSA, 0,1% de Triton em PBS), e depois com anticorpo secundário, diluída 1:200, em solução de coloração suplementado com DAPI (30 min, temperatura ambiente). As lâminas foram montadas com fluorescência Meio de montagem (Golden Bridge Life Science, EUA). As células cultivadas em suspensão foram coradas com anticorpos primários e secundários e, em seguida, fixadas e plaqueadas em lamelas de vidro. As células foram vistos com um × Zeiss 100, NA 1.4, Yokogawa CSU-22, ou Zeiss totalmente automatizada invertida 200 M microscópio, com lasers de estado sólido 473, 561 e 660 nm; Z-stage todos sob o comando do Slidebook ™ controlado por piezo. As imagens foram adquiridas com uma câmera Evolve EMCCD (fotométricos, 100 × lente, 1 × 1 binning, tamanho do pixel: 0,16 microns).

CDC

Várias linhas tumorais e células (alvo) HMEC ( 1 × 10

6 células /ml) foram marcados com 2 uCi /ml de 3 [H] -timidina (Amersham, Reino Unido), durante 18 h a 37 ° C. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e incubadas (2 h, temperatura ambiente) com 100, 50 ou 10 /ml de H23, R23IgG, SPmAb-6 ou SPmAb-2,1 ug de anticorpos. As células foram então lavadas com PBS, e 1 × 10

células foram incubadas 4 (5 h, 37 ° C) em tubos de 4 ml com 20 ul, 10 ul de complemento ou 5 ul de soro humano (Sigma, Israel). As células foram então lavadas três vezes com PBS, ressuspensas em 300 ul de PBS e semeadas em 100 ul /cavidade em triplicado, em placas de 96 poços (GRINER, De Groot, Alemanha). colheita das células foi realizada utilizando Unifilter placas de 96 poços (PerkinElmer, EUA). A radioactividade foi determinada num contador beta (Perkin Elmer, IL, EUA). Para a lise espontânea, as células foram incubadas sob as mesmas condições, mas sem adição de complemento. Para a lise total 10% de Triton X100 foi adicionado às células marcadas. Percentagem de lise específica foi calculada da seguinte forma:. (CPM no experimental bem – CPM na amostra espontânea) /(CPM na amostra total – CPM na amostra espontânea) × 100

Análise Estatística

Estatística significância foi determinada utilizando o teste t de estudante. Em todos os testes, o nível mínimo de significância para um teste de 2 caudas foi estabelecido em p . 0,01

Anticorpos

Resultados

Geração de MUC1 SP específicas-

Para promover a exploração da natureza, a especificidade e a localização do antigénio que conduz à geração de auto-anticorpos a MUC1-SP-L, o péptido de MUC1-SP-H-KLH conjugada 17-mer (Tabela 1) foi utilizado para gerar anticorpos policlonais e mAbs. MUC1-SP-M foi escolhida com base numa previsão silico em alta densidade de MHC de Classe II e epítopos de células B e sobre a concentração considerável de auto-anticorpos contra este péptido, encontrado no soro de pacientes de MM [34]. Anti-MUC1-SP-H anticorpos policlonais (título de soros positivos em ≤1:25,000) foram obtidos em ratinhos (dados não apresentados) e em dois coelhos imunizados R23 e R32 (positiva no título ≤1:12,800) (Tabela 1 e Fig . 1A painel esquerdo). A resposta humoral anti-MUC1 demonstrado reactividade cruzada limitada (títulos de 1:800 diluições) tanto eucariota (Bagé-SP-L, Tabela 1 e Fig 1A painel do meio.) E prokaryote (TB-Rv0476 /4941-SP- L, Tabela 1 e painel da direita) SPs Fig. 1A. Os epitopos internos de MUC1-SP-M mais reconhecidos por R23 foram MUC1-SP-S1 e MUC1-SP-S2 (Tabela 1, Fig. 1B), ambos localizados no MUC1 SP C-terminal. Os ensaios de competição avaliando a especificidade dos anticorpos policlonais demonstraram 50% de inibição de ambas e R23- R32-anticorpos MUC1 derivada por SP-M e o seu epítopo interior MUC1-SP-S2 (Figura 1C.). Inibição de 10% foi obtida por outros epitopos MUC1 SP, em particular MUC1-SP-S4 e MUC1-TRA-L, e por o domínio BAGE-SP-L BAGE SP. Com base nestes resultados, o epítopo mínimo de R23 e R32 está localizado dentro das sequências de MUC1-SP-S1 e MUC1-SP-S2, isto é, os aminoácidos 12-21.

A especificidade e epitopo mínimo definido de o gerado anti-MUC1 SP anticorpos policlonais (a-C) e mAbs SPmAb-2.1 e SPmAb-6 (D-e) foram avaliados contra o péptido imunizante MUC1-SP-H e os seus epitopos internos de MUC1-SP-S1 a S5, em ensaios de ELISA. epitopo de MUC1 TRA, MUC1-TRA-L, eo domínio Bagé-SP-L não-MUC1 SP, foram utilizados nestes ensaios como controles negativos.

Na sequência estabelecimento de MUC1-SP imunogenicidade -M em coelhos, optamos por gerar mAb em camundongos. Os soros recolhidos a partir de rato MUC1-SP-H-imunizados No. 1 (M1) ligou-se fortemente o péptido imunizante, MUC1-SP-H ( 1:12,800 título) (Figura 1D.), Moderadamente ligados MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2 e MUC1-SP-S3 ( 1:1800-3600 títulos) e fracamente ligada MUC1-SP-S4 e MUC1-SP-S5 ( 1:800 título). Os soros não se conseguiu ligar-MUC1 TRA-G. Binding experiências com soros de rato No. 2 demonstrou os títulos mais elevados ( 1:1600) para péptidos de MUC1-SP-S4 e MUC1-SP-S5 (dados não mostrados). Os esforços de clonagem proporcionou dois mAbs, um com um isotipo de Ig-gama1, designado SPmAb-2,1, e a segunda com um isotipo de Ig-gamma2a, designado SPmAb-6. especificidade de mAb foi validado por ensaios de competição (fig. 1E), com vários péptidos livres (Tabela 1) e de ligação. MUC1-SP-S2 mais potentemente inibida SPmAb-2.1, enquanto que a ligação de MUC1-SP-S4 mais eficazmente inibida SPmAb-6, tanto a definição dos epitopos mínimas dos respectivos anticorpos.

anti-MUC1 SP anticorpos se ligam a MUC1 células tumorais -positivas

citometria de fluxo demonstrou moderada de alta SPmAb-2,1, 6-SPmAb e R23IgG ligação a tumores sólidos e hematológicos que expressam MUC-1 (Tabela 2). O anti-MUC1 TRA mAb H23 [35], que serviu como um controlo positivo de MUC1, mostrou reactividade inequívoca, com uma força semelhante à dos anticorpos R23IgG ligação. Em contraste, MUC1-negativo melanoma linhas celulares, SK-MEL-28 e SK-MEL-1, e do ovário de linha de células de MUC1-negativa, ES-2, consistentemente falhou a reagir (baixa média geométrica), com todos os anticorpos testados (Tabela 2), demonstrando a selectividade do anticorpo ao MUC-1 SP. Um apoio adicional do tumor cell- MUC1 e SP-especificidade dos anticorpos, foi fornecida pela ausência de ligação de SPmAb-2,1, 6-SPmAb mAbs e anticorpos R23IgG para células brancas do sangue, em particular, para CD3

+ T -cells, CD20

+ células B e CD14

+ células mielóides, bem como a ingênua células epiteliais mamárias humanas normais (HMEC) (Tabela 2).

Anti-MUC1 SP anticorpos Localizar para as membranas de células de tumor de MUC1 positivo

a localização do antigénio reconhecido pelos diferentes anticorpos MUC1 SP foi determinado por análise ImageStream. Observou-se a presença de MUC1 SP, utilizando conjugado com PE SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb e APC conjugada com H23 MUC1 TRA mAb, na superfície das células de linha celular de ovário de MUC1 positivo OVCAR-3, enquanto que nenhuma expressão foi observada no MUC1 A linha de células de ovário -negative ES-2 (Fig. 2A). As imagens fundidas de 30000 células indicam que a MUC1 SP e MUC1 TRA localizam principalmente sozinho na membrana das células. SP MUC1 foi observado como um domínio membranar independente, tal como demonstrado por um único PE

membranar coloração brilhante, em 47% e 56% das células analisadas, por tratamento com SPmAb-6 e SPmAb-2.1, respectivamente. Co-localização das moléculas de MUC1 SP e MUC1 TRA, demonstrada por um duplo PE

brilhante /APC

brilhante coloração membranar, foi mínima, e observada em 18% e 27% das células expostas a SPmAb-6 e SPmAb- 2,1, respectivamente (dados não mostrados). Observou-se (dados não mostrados), indicando uma co-localização destas moléculas em muito poucas células seleccionadas e uma alta semelhança entre MUC1 SP e coloração MUC1 TRA (1,0 coeficientes de similaridade expressão de domínio MUC1 TRA foi determinada com H23 mAb. Para cada experiência, foram utilizados anticorpos de controlo correspondidos em espécies para a coloração de MUC1: ou normal de ratinho IgG-FITC (B), ou IgG normal de coelho-FITC (D). Anti-MUC1 SP mAb (SPmAb-2.1) foi usado para determinar a expressão de MUC1 SP; expressão de domínio MUC1 TRA foi determinada com H23 mAb.

citotoxicidade dependente de Elogio Mediada pelo anti-MUC1 SP Anticorpos

A traduzibilidade de antigénio e tumorais especificidades de anticorpos anti-MUC1 SP para potencial imunoteraptico funcional foi demonstrada por lise eficaz das células que expressam MUC1 por R23IgG (Fig. 4A), e 2,1-SPmAb SPmAb-6 (Fig. 4B), indicando o seu potencial como efectores anti-tumorais. anticorpos R23IgG mediada 60-100% de lise das células ovarianas OVACAR-3 sólidos e dos parâmetros hematológicos, U266, RPMI 8226, MM, ARH-77 e células tumorais Ramos leucemia. De um modo semelhante, SPmAb-2.1 e SPmAb-6 desencadeada lise altamente específica de 90% e 60-80%, respectivamente, das mesmas linhas celulares. Em comparação, H23 induzida lise de 80-90% das populações de células testadas (Fig. 4B). A lise induzida por todos os anticorpos anti-MUC1 foi altamente significativa (p 0,001 em teste t de Student) em linhas celulares tumorais que expressam MUC1, quando comparado com a linha celular de ovário ES-2, a linha celular de melanoma SK-MEL-1 e NHEC, três linhas de células de MUC1-negativo. Geralmente, CDC eficácia lise fortemente correlacionado com os níveis de expressão na superfície celular de MUC1, avaliados por análise de citometria de fluxo (Tabela 2), com a excepção de SPmAb-6 mAb, que demonstrou a presença de células de superfície elevada mas moderada CDC.

A propriedades citotóxicas do anti-MUC1 SP policlonal R23IgG (a) e monoclonal SPmAb-2.1, SPmAb-6 mAb (B) foram avaliados por análise CDC usando vários tumores sólidos, não sólidos, MUC1 positivos e negativos e HMEC. O domínio específico MUC1 TRA mAb H23, NMS e NRS e sem (E /S W) anticorpos foram avaliados como controles.

Discussão

Apesar de extensa pesquisa sobre o potencial imunoterapêutico de MUC1 , ainda não há um produto licenciado contra esse alvo. A falha para isolar, epitopos MUC1 insolúveis ligados às células tem impedido o desenvolvimento de um agente imunoterapêutico relacionada-MUC1 eficaz. avanço significativo foi feita por Rubinstein e colegas [37] e, mais recentemente, por Pichinuk e colaboradores [24], que produziu anticorpos contra o cruzamento alfa /beta de MUC1s celulares. Estes anticorpos mostraram altamente selectiva de ligação de MUC1 e citotoxicidade induzida por tumores de MUC1-positivo, quando ligadas a uma toxina [24]. Com base em nossas observações anteriores de naturalmente gerados auto-anticorpos anti-MUC1 SP em pacientes com MM, mas não em dadores saudáveis ​​ingênuos, [34] o presente estudo adotou uma estratégia diferente para atingir o domínio MUC1 SP insolúvel. Os R23IgG, SPmAb-2.1 e SPmAb-6 anticorpos que levantamos, especificamente ligados MUC1 SP, sem ligação SPs (Fig. 1A) e MUC1-tra epitopos independentes (Fig. 1B-E). Os epitopos reconhecidos por estes mínimas anticorpos foram localizados no terminal carboxilo da proteína MUC1 SP (Fig. 1C e 1E).

Após observações sugerem que os domínios SP proteínas poderia potencialmente directa a qualquer da membrana celular ou o compartimento extracelular [33]. domínios SP não clivada, como é o caso de inibidores de protease, tais como activador de plasminogénio inibidor-2 [38], ou o seu homólogo de pintainho, ovalbumina [39], orientar a proteína para o ER e não para suportar de ancoragem membrana, obtendo-se a secreção do proteína intacta. No caso do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV) precursor da glicoproteína C, a inserção da proteína para a membrana do RE é mediada por uma 58 amino-ácido SP longo incomum tendo uma região N-terminal prolongada. Embora o SP é clivada por Spase, permanece não covalentemente ligados à glicoproteína sem ser processada por spp.