Abstract
A metástase para o fígado é um fator principal na mortalidade por câncer colorretal. Estudos anteriores sugerem que o stress psicológico crónica é importante na progressão do cancro, mas o seu efeito sobre a metástase do fígado não foi investigada. Para resolver isso, nós estabelecemos um modelo de metástases hepáticas em camundongos BALB nus /c para investigar o papel do estresse crônico na metástase do fígado. Nossos dados sugerem que o estresse crônico eleva os níveis de catecolaminas e promove metástase hepática. O stress crónico também foi associada com o aumento da infiltração de macrófagos associados a tumores para o tumor primário e aumentou a expressão de genes metastáticas. Curiosamente, o tratamento β-bloqueador reverteu os efeitos do stress sobre a metástase do fígado crónica. Os nossos resultados sugerem que a via de sinalização β-adrenérgico está envolvido na regulação da progressão do cancro colo-rectal e metástases no fígado. Além disso, alegam que a terapia adjuvante com um β-bloqueador pode complementar terapias contra o câncer colorretal existente
Citation:. Zhao L, Xu J, Liang F, Li A, Zhang Y, Sun J (2015) Efeito da Crônica estresse psicológico no fígado metástase do cancro do cólon em camundongos. PLoS ONE 10 (10): e0139978. doi: 10.1371 /journal.pone.0139978
editor: Obul Reddy Bandapalli, da Universidade de Heidelberg, Alemanha |
Recebido: 30 de maio de 2015; Aceito: 18 de setembro de 2015; Publicação: 07 de outubro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela National Natural Science Foundation (81403350) e Projecto de inovação independente de Putuo District, Shanghai (2012PTKW004). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a incidência global e mortalidade do câncer colorretal (CRC) têm diminuído devido ao diagnóstico precoce e novos métodos terapêuticos [1]. No entanto, a metástase do fígado ainda continua a ser um desafio significativo no prolongamento da sobrevivência. Cerca de 50 ~ 60% dos pacientes desenvolvem metástases hepáticas, que tem resultados esperados pobres. Além disso, estratégias terapêuticas actuais não são eficazes [2]. A ressecção cirúrgica é o único tratamento curativo potencial para metástase hepática CRC. No entanto, é limitado pela indicação e contra-indicações, e apenas 10 ~ 20% dos pacientes com metástases do fígado receber tratamento cirúrgico. O prognóstico para pacientes com metástases hepáticas não tratada é pobre, ea taxa de sobrevivência de 1 ano esperado é inferior a 30% [3-4]. Para reduzir a morbidade e melhorar o prognóstico, é essencial para desenvolver novas terapias. Interessantemente, os estudos epidemiológicos sugerem que o tratamento com propranolol (um β-bloqueador não selectivo) reduz os riscos de alguns tipos de cancro, incluindo CRC [5-8].
estudos recentes sugerem que a um estado emocional afligido é um potencial fator de risco para a progressão do câncer. Como o diagnóstico de câncer pode causar grande sofrimento, os pacientes muitas vezes experimentam medo, ansiedade e depressão [9]. Estes sinais podem activar vias de estresse, incluindo o eixo hipotalâmico-pituitário-supra-renal (HPA) e o sistema nervoso simpático (SNS), e desencadear respostas fisiológicas. Estes percursos podem produzir neurotransmissores e hormônios que alteram o microambiente do tumor.
Hormonas da catecolamina, incluindo norepinefrina (NE) e adrenalina (E), são elevados durante o stress, e jogar o papel chave na resposta ao estresse. Estas hormonas activar os receptores em células tumorais e regulam uma grande variedade de funções biológicas envolvidas em progressão tumoral, incluindo a proliferação celular, migração, invasão, angiogénese e [10-12]. A activação do β
2-AR via de sinalização induzida por hormônios catecolaminas desempenha um papel fundamental na progressão do cancro [13, 14].
Estudos anteriores sugerem que a proliferação de células CRC-induzida hormônios do estresse é dependente adrenoreceptor e que o stress crónico pode promover o crescimento do tumor de células de carcinoma do cólon implantado por via subcutânea num modelo de ratinhos nus por meio da via de sinalização β-AR [15, 16]. Nossa hipótese é que o estresse crônico iria promover CRC metástase para o fígado. Aqui nós investigar como crónica estresse afeta metástase hepática usando um
in vivo
modelo metastática do câncer de cólon, e determinar se a via de sinalização β-AR é necessário para a progressão da CRC.
Materiais e métodos
cultura de células e animais
linha de células de cancro do cólon humano, HT-29, foi comprado de Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências. HT-29 foi cultivada em meio McCoy’5A (Invitrogen), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2.
machos com quatro semanas de idade BALB /c nu /nu foram adquiridos a partir de Xangai SLAC Experimental animal Co., Ltd (Não licença: SCXK [Hu] 2012-0002) e mantida sob condições SPF. Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal de Putuo Hospital filiado à Universidade Shanghai de Medicina Tradicional Chinesa.
modelo de metástases do fígado
Os ratos foram injectados com células cancerosas HT-29 de cólon no baço para produzir metástases do fígado. Os ratinhos foram anestesiados com pentobarbital de sódio a 2,5%, por injecção peritoneal. Após a esterilização da pele na área da cirurgia, uma incisão abdominal paralela à margem subcostal esquerda foi feita. As células de tumor (1 × 10
7) em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato foram injectadas no baço usando uma agulha de 29-L. Depois de premir o orifício 1-2 min com cotonetes assépticas para impedir que as células de vazar, o baço foi devolvido para a cavidade peritoneal. A ferida foi fechada com 5-0 Vicryl
O estresse crônico e administração de drogas protocolo
Os ratos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos:. Blank-Control (BC, n = 10), Blank- Tensão (BS, n = 10), propranolol de controlo (PC, n = 10), Propranolol-stress (PS, n = 10), ICI118,551-Control (CI, n = 10) e ICI118,551-stress ( IS, n = 10). Os ratinhos nos grupos de esforço experimentado contenção física durante 6 horas por dia durante 35 dias, com início 7 dias antes da injecção de células tumorais. Todos os ratinhos foram sacrificados 28 dias após a injecção das células tumorais, e o baço e o fígado foram colhidos e pesados.
Para estudos de antagonista P-adrenérgico, (±) -propranolol cloridrato (um não selectivo β-bloqueador, 10 mg /kg /dia, Sigma, P0884) e ICI118,551 (um β selectiva
2-bloqueador, 25 uM /30 uL, Sigma, I127) [17] foram entregues aos murganhos por via subcutânea por mini-bomba osmótica (Alzet, modelo 1004). Os medicamentos foram administrados durante a duração da experiência se inicia 7 dias antes da injecção de células de tumor (Fig 1).
(A) Os ratinhos nos grupos de stress foram contidos num espaço especial que as impedidas de se deslocarem livremente. (B) Os ratinhos nos grupos de esforço experimentado contenção física durante 6 horas por dia durante 35 dias, com início 7 dias antes da injecção de células tumorais. Um antagonista β-adrenérgico foi administrada por via subcutânea por mini-bomba osmótica. exposição à droga foi sustentado durante todo o experimento. Células HT-29 foram injectados no baço no dia 0.
ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)
sangue
Vinte e oito dias após a injecção das células tumorais, os ratos foram sacrificados e foi colhido a partir dos olhos e imediatamente colocadas em tubos de Eppendorf limpo revestidos com heparina. concentrações E e NE no soro foram medidos por ELISA (R D Systems). de acordo com as instruções do fabricante
cromatografia líquida de alta eficiência com detecção electroquímica
Os níveis de catecolaminas no tecido tumoral foram quantificadas utilizando uma coluna de cromatografia líquida de alta eficiência equipado com um detector electroquímico. Os tecidos tumorais foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato para remover o sangue restante. As amostras foram então sonicadas em /L de ácido perclórico a 1 mol frio. Os sobrenadantes foram recolhidos e centrifugados filtrada com uma placa de filtro de 0,22 um (Millipore). O sistema de HPLC-ECD composto numa coluna de fase reversa (Agilent 1100, 4,6 milímetros x 12,5 milímetros, EUA), e um detector electroquímico (Couloshem III, ESA, EUA). A fase móvel continha 5% de metanol em água desionizada, /L de ácido cítrico a 85 mmol, /L citrato de sódio 300 mmol, 0,2 mmol /L de EDTA, 1,2 mmol /L de octano sulfonato de sódio, e água destilada. A taxa de fluxo foi de 1 ml /min, e o pH foi ajustado para 4,0 com de potássio a 2 mol /L de sódio.
análise de citometria de fluxo
Para analisar a infiltração de macrófagos associados a tumores (TAM) e mielóides derivadas de células reprimidas (MDSCs) infiltração por citometria de fluxo, foram preparadas suspensões de célula única de tumores implantados no baço colhidas 28 dias após a injecção e incubadas com anticorpos directamente conjugados com marcadores de fluorocromo como previamente descrito [18]. Para obter suspensões de células individuais, o baço foi dissecado e homogeneizado em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen), suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Os eritrócitos foram eliminados por incubação com uma solução hemolítica (155 mmol /L de NH4Cl, 10 mmol /L de KHCO3, pH 7,2) durante 5 min. Para analisar TAM, esplenócitos (1 × 10
6) foram coradas com PE anti-rato F4 /80 (BioLegand, 123110) e FITC anti-rato /humano CD11b (BioLegand, 101206). Para analisar células supressoras derivadas mielóides monocíticas (M-MDSC) e células supressoras derivadas mielóides granulócitos (G-MDSC), esplenócitos foram corados com mouse MDSC Fluxo Cocktail2 com Isotype Ctrl (BioLegand, 147003). Os anticorpos foram diluídos 1: 100 em tampão de citometria de fluxo (solução salina tamponada com fosfato com 5% de soro fetal de bovino). Todas as análises foram conduzidas sobre o fluxo BD LSRII citómetro (Beckman Coulter).
quantitativo em tempo real da transcrição reversa-PCR (RT-PCR)
RT-PCR foi utilizada para quantificar a expressão de metástases genes relacionados com incluindo IL-6, o VEGF, MMP-9, e o TGF-β PTGS2. O ARN total foi extraído a partir de tecido de tumor no baço com reagente TRIZOL (Invitrogen), e a concentração e a pureza foram determinadas por um espectrofotómetro de UV. Em seguida, o RNA 1 ug foi submetido a transcrição reversa em cDNA com kit reagente PrimeScript RT ™ (Takara, Dalian, China). PCR quantitativo em tempo real foi realizada utilizando SYBR
® Premix Ex Taq ™ II (Takara, Dalian, China). As condições de reacção foram: pré-desnaturação a 95 ° C durante 30 s e um total de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 5 s, emparelhamento a 60 ° C durante 34 s e extensão a 72 ° C durante 30s. As amostras foram analisadas em triplicado e a expressão foi normalizado para a expressão de GAPDH. A amplificação foi efectuada utilizando os seguintes iniciadores: sentido GAPDH (5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 ‘) e anti-sentido (5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′), IL-6 sentido (5’-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3 ‘) e anti-sentido (5? -TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3 ‘), o VEGF sentido (5′-GCCAGACAGGGTTGCCATAC-3′) e anti-sentido (5’-GGAGTGGGATGGATGATGTCAG-3 ‘), MMP9 sentido (5′-CTGGACAGCCAGACACTAAAG-3′) e anti-sentido (5’-3-CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG ‘), TGF-β sentido (5′-AGACCACATCAGCATTGAGTG-3′) e anti-sentido (5’-GGTGGCAACGAATGTAGCTGT-3 ‘), PTGS2 sentido (5′-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3′) e anti-sentido (5’-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3 ‘) . Os iniciadores foram sintetizados por Shanghai Sangon Biotech.
Western blotting
A proteína total foi extraído a partir de tecido de tumor no baço como descrito anteriormente [15], e a concentração de proteína foi determinada pelo kit de ensaio de proteína BCA ( Beyotime, P0012). Western blot foi realizada com os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-IL-6 (1: 500, Abcam, ab154367), anti-VEGF (1: 1000, Abcam, ab46154), anti-MMP-9 (1: 500, Abcam, ab38898), anti-TGF-β (1: 1000, Abcam, ab31013), andanti-PTGS2 (1: 500, Abcam, ab62331), seguido de incubação com o anticorpo secundário anti-coelho de peroxidase de rábano conjugado (1: 1000) . As proteínas foram visualizadas por um sistema de detecção de quimioluminescência ECL. Detecção de GAPDH (1: 2000, Abcam, ab181602) serviu como controle de carga interna
Imunohistoquímica
As amostras de metástases hepáticas foram fixados em formalina a 10% tamponada e processados para exame histológico.. As secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários seguintes: anti-VEGF (1: 200, Abcam, ab1316), anti-CD31 (1: 200, Abcam, ab28364), ou anti-MMP-9 (1: 200, Abcam, ab38898). As lâminas foram lavadas e incubadas em anticorpo secundio biotinilado (1: 200). A intensidade da coloração para o VEGF, CD31, e MMP-9 de expressão foi medida por Image-Pro 6.0. A média de 3 valores integrados densidade óptica foi considerado como a intensidade de expressão de proteína neste campo.
Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 18.0 (SPSS Inc.). Os resultados foram expressos como a média ± SEM para todas as comparações estatísticas emparelhadas. A análise estatística foi realizada por meio de um estudante
t
-teste. Um valor de
P Art 0,05 foi considerado significativo.
Resultados
crónica induzida pelo estresse β-adrenérgico a ativação do receptor do fígado mediada metástase
HT-29 células (1 × 10
7) foram injectada no baço de 60 ratos para estabelecer metástases do fígado e sacrificados 28 dias após a injecção das células tumorais para análise. Todos os ratinhos que foram submetidos a injecção do tumor no baço desenvolvido metástase do fígado. Imagens representativas de baço e de fígado metastáticas são mostrados na Fig 2A e 2B. Para investigar o papel do stress crónico no crescimento do tumor primário e metástases do fígado, foram avaliados os pesos de baço e de fígado. O estresse crônico aumentou o peso do baço por 20,61% (BC
vs
BS:.. 0,13 ± 0,01 g
vs
0,15 ± 0,01 g,
P
= 0,1784), e um aumento significativo na metástase hepática foi observada em ratos expostos ao estresse crônico (variação de 1,6 vezes:. 2,73 ± 0,16 g no grupo BC
vs
4,30 ± 0,27 g no grupo BS,
P
0,0001, figura 2C). Estes achados sugerem estresse restrição crônica promove metástase hepática.
(A) Imagens representativas de baço tomada no dia 28 após a injeção de células tumorais. (B) Imagens representativas de fígado metastático tomado no dia 28 após a injecção das células tumorais. (C) Os dados representam o peso médio do baço dos seis grupos. (D) Os dados representam o peso médio do fígado a partir dos seis grupos. **
P Art 0,01 versus grupo BC,
#
P Art 0,05 em relação grupo BS.
Como estudos anteriores sugeriram que o estresse crônico acelerada progressão do câncer através de sinalização β-adrenérgico, que ratinhos tratados com propranolol ou ICI118,551 para inibir a sinalização β-adrenérgico. Como mostrado na Fig 2D, β-bloqueador de tratamento reduziu a metástase do fígado induzida por stress crónico. Em comparação com os ratinhos do grupo de BS, em ratinhos PS e grupos é tinham menos metástases do fígado. Os pesos metastáticas do fígado de ratos no PS e está grupos foram significativamente menores do que os dos ratos no grupo BS (PS
vs
BS:. 3,46 ± 0,28 g
vs
4,30 ± 0,27. g,
P
= 0,0482; IS
vs
BS: 3,35 ± 0,28 g
vs
4,30 ± 0,27 g,
P
= 0,0265).. . Não se observou diferença significativa na metástase hepática entre propranolol e tratamento ICI118,551 (
P Art 0,05).
O estresse crônico níveis de catecolaminas
Uma característica central up-regula a resposta de stress crónico é sobre-regulação da via de resposta ao estresse adrenérgico, o que resulta em perda de peso e um aumento dos níveis de catecolaminas [19]. O estresse psicológico foi confirmada por peso perder (Fig 3A) e exposição ao estresse crônico aumentou significativamente os níveis séricos de NE por 30,25% (BC
vs
BS:. 101,5 ± 1,78 ng /L
vs
. 132,2 ± 2,51 ng /L,
P Art 0,0001, Fig 3B), e moderadamente aumento dos níveis séricos de e por 14,24% (BC
vs
BS:. 37,43 ± 1,76 mg /L
vs
. 42,76 ± 1,82 mg /L,
P
= 0,047, Fig 3B). A análise por HPLC-ECD do tecido tumoral baço mostrou um aumento significativo de E 18,3 vezes (BC
vs
BS:.. /mL
vs
103,4 ± 25,08 pg /mL 5.657 ± 1.613 pg,
P
= 0,0177, Fig 3C e 3D).
(a) os pesos corporais foram monitorados durante todo o experimento. Células HT-29 foram injectados no baço, no dia 0. (B) Os dados representam os níveis séricos médios de NE e E no grupo BC e BS, *
P
0,05 em relação grupo BC, **
P Art 0,01 versus grupo BC. (C) Imagens representativas de HPLD-ECD impressão digital dos níveis de catecolaminas em tecidos tumorais baço em BC e grupo BS. (D) Os dados representam nível médio de NE e E no tecido tumoral do baço em BC e grupo BS, *
P Art 0,05 em relação grupo BC.
Efeito da via de sinalização β-adrenérgico no microambiente do tumor
Pesquisas anteriores indicaram que a sinalização β-adrenérgico regulamenta o microambiente do tumor através do recrutamento ou modificando a atividade de tumor macrófagos -associated [20]. Para determinar se o stress crónica afecta o microambiente do tumor, utilizou-se citometria de fluxo para quantificar a composição de células HT-29 em tumores primários colhidos a partir do baço
.
Como se mostra na Fig 4A, stress crónico aumento CD11b
+ F4 /80
+ macrófagos infiltração (variação 4,2 vezes:. 2,79 ± 0,43% de células vivas no grupo BC
vs
10,33 ± 1,01% no grupo BS,
P
= 0,0023 , Fig 4B). O estresse crônico também aumentou a infiltração M-MDSCs por 2,4 vezes (BC
vs
BS:.. 17,15 ± 0,38% de células vivas
vs
35,51 ± 4,27%,
P
= 0,0128, Figura 4C e 4D). O estresse crônico recrutamento de macrófagos associados a tumores e M-MDSCs principalmente induzida ao tumor primário, como G-MDSCs não estavam presentes (
P Art 0,05). Para confirmar que o tumor e macrófagos associados a infiltração H-MDSCs foram mediadas pela via de sinalização β-adrenérgico, analisou-se a composição de células de tecido de tumor de baço colhidas a partir de ratinhos stressados tratados com propranolol ou ICI118,551. Como mostrado na Figura 4, o tratamento β-bloqueador revogada significativamente o CD11b
+ F4 /80
+ macrófagos população no tecido do tumor primário (PS
vs
BS:. 6,71 ± 0,57% em directo células
vs
10,33 ± 1,01%,
P
= 0,0353; IS
vs
.BS:. 6,60 ± 0,68% de células vivas
vs
. 10,33 ± 1,01%,
P
= 0,0374). No entanto, não foi observada significância com o CD11b
+ Gr
loLy6C
oi MDSC populações (PS
vs
BS:. 28,08 ± 0,80% de células vivas
vs
. 35,51 ± 4,27%,
P
= 0,2722; IS
vs
.BS:. 26,77 ± 0,57% de células vivas
vs
35,51 ± 4,27%,
P
= 0,2116).
(a) CD11b
+ F4 /80
+ células foram quantificadas por citometria de fluxo em HT-29 tumores do baço principal colhidas 28 d após a injeção. (B) Os dados representam média CD11b
+ F4 /80
+ composição em tumores colhidos a partir do baço. **
P Art 0,01 versus grupo BC,
#
P Art 0,05 em relação grupo BS. (C) MDSCs foram quantificadas por citometria de fluxo em HT-29 tumores primários de baço colhidas 28 d após a injecção. (D) Os dados representam CD11b média
+ Gr
loLy6C
composição oi em tumores colhidos a partir do baço. *
P Art 0,05 em relação grupo BC.
Efeito da via de sinalização β-adrenérgico na metástase hepática
Estudos anteriores sugerem que o estresse crônico altera o microambiente do tumor e pode contribuir para a metástase do câncer
em vivo
[21]. Para determinar se o stress crónico promovido metástases do fígado, examinámos a expressão de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, e VEGF em tumores de baço por RT-PCR e análise de Western blot. Descobrimos que TGF-β (aumento de 9,4 vezes,
P
= 0,0040), IL-6 (aumento de 7,6 vezes,
P
= 0,0005), PTGS2 (aumento de 8,1 vezes,
P
= 0,0002), MMP-9 (aumento de 9,4 vezes,
P
= 0,0081) e VEGF (aumento de 7,6 vezes,
P
= 0,0005) mRNA expressão aumentada significativamente nos ratos do grupo de BC, em comparação com os ratinhos do grupo de BS. Os ratinhos tratados com beta-bloqueadores tinham significativamente diminuída de TGF-β, IL-6, expressões PTGS2, MMP-9, e VEGF mRNA em tumores do baço em comparação com os ratinhos do grupo de BS (Figura 5A). Não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos propranolol e ICI118,551 (
P Art 0,05).
(A) a expressão do mRNA de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 e VEGF em relação aos ratos do grupo BC em tumores do baço **
P 0,01 versus grupo BC,
#
P Art 0,05 em relação grupo BS,
##
P Art 0,01 versus grupo BS. (B) A expressão de proteínas de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, e VEGF em tumores do baço. GAPDH foi usada como um controlo de carga.
Observou-se também um aumento da expressão da proteína de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, e o VEGF proteína em ratinhos expostos a stress crónico, que foi revogada pelo tratamento com beta-bloqueadores (Fig 5B).
estudos anteriores sugerem que o estresse psicológico crônico promove a metástase pelo aumento da regulação da neovascularização do tumor e invasão dos tecidos. Aqui nós mostramos que o VEGF, CD31 e MMP9 expressão da proteína aumenta em tecido hepático indicativo de angiogênese e invasão. A expressão foi significativamente aumentada em ratinhos no grupo BS comparação com os ratinhos do grupo BC (VEGF: 2,5 vezes aumento,
P
= 0,0014; CD31: aumento de 2,1 vezes,
P =
0,0004; MMP9: aumento de 2,2 vezes,
P
= 0,0028). A inibição da sinalização de β-adrenérgico diminuiu VEGF (PS
vs
BS:.. 0,3091 ± 0,04158
vs
0,5340 ± 0,04043,
P
= 0,0179; IS
vs .
BS:. 0,2854 ± 0,02639
vs
0,5340 ± 0,04043,
P
= 0,0067), CD31 (PS
vs
BS:. 0,3053 ± 0,03593
vs
0,4333 ± 0,01677,
P
= 0,0320; IS
vs
BS: 0,3040 ± 0,02751
vs
0,4333 ± 0,01677,
P..
= 0,0160) e MMP9 (PS
vs
BS:.. 0,3338 ± 0,01203
vs
0,5277 ± 0,04289,
P
= 0,0121; IS
vs
BS:. 0,3187 ± 0,01987
vs
0,5277 ± 0,04289,
P
= 0,0115) expressão da proteína (Fig 6).. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a activação da sinalização de β-adrenérgico é necessário e suficiente para aumentar a angiogénese tumoral, invasão e metástase na presença de stress crónico.
amostras de tumor metastático (A) do fígado foram coradas para VEGF por imuno-histoquímica. amostras de tumor metastático (B) do fígado foram coradas para CD31 por imuno-histoquímica. amostras de tumor metastático (C) do fígado foram coradas para MMP9 por imuno-histoquímica. Todas as fotografias foram tiradas em 200 ×. (D) média da densidade óptica (OD) de VEGF, CD31, e MMP9 em tumores metastáticos do fígado de ratinhos no aC, de PC, IC, BS, PS, e IS grupos. **
P Art 0,01 versus grupo BC,
#
P Art 0,05 em relação grupo BS,
##
P Art 0,01 versus grupo BS.
Em conjunto, nossos resultados sugerem que o estresse crônico promove CRC metástase hepática através de sinalização β-adrenérgico, e enfatiza a importância do microambiente do tumor na regulação da invasão de células tumorais.
Discussão
Apesar das melhorias na terapia abrangente para CRC, os médicos enfrentam desafios em pacientes tratar com metástase hepática devido à eficácia limitada. Neste estudo, verificou-se que o estresse crônico aumentou o crescimento ea metástase do CRC através de β-adrenérgico de sinalização (Fig 7).
Sinalização significativamente maior difusão de células tumorais
β-adrenérgico para o fígado, e inibição farmacológica do β- sinalização adrenérgico reduzido de metástases do fígado. Nossos estudos também sugerem que o propranolol podem complementar as estratégias terapêuticas existentes para retardar ou prevenir a metástase hepática de CRC, melhorando a sobrevida dos pacientes que sofrem de estresse psicológico.
O impacto negativo do estresse crônico sobre o resultado do câncer está bem estabelecido. O estresse crônico ativa o SNS e o eixo HPA para incentivar a liberação de catecolaminas, e continuar a regular o microambiente do tumor e afetar a progressão do tumor [19]. As catecolaminas são estimuladores potentes de neovascularização. Estudos anteriores mostram que o estresse restrição crônica leva ao aumento dos níveis de catecolaminas tecidos e angiogénese tumoral melhorada através da regulação do VEGF e expressão MMPs [22]. Além disso, beta-bloqueadores tinha sido demonstrado para inverter a angiogénese pelo stress [23]. Outros estudos mostram que o estresse crônico eleva estresse hormônios que aumentam o crescimento CRC
in vivo
[16]. Aqui, nós expandir esses estudos, investigando o papel de catecolaminas no CRC metástase para o fígado. Nossos resultados demonstram que o estresse crônico eleva significativamente os níveis de E e NE no soro e no tecido tumoral.
Para determinar se o estresse crônico foi suficiente para regular a angiogénese
in vivo
, mapeamos a densidade de vasos sanguíneos de fígado tumor metastático através de VEGF e CD31 imunocoloração e encontrou um aumento significativo de angiogênese em ratos estressados, respectivamente. Consistente com estudos prévios demonstrando que SNS regula a angiogénese, os nossos dados sugerem tratamento β-bloqueador vascularização induzida pelo stress revogada. Mostramos também que a exposição estresse crônico regula a expressão MMP9 no tumor metastático de fígado. Coletivamente, nossos dados sugerem que a sinalização β-adrenérgico regula a vascularização do tumor e invasão.
O estresse crônico também pode alterar o microambiente do tumor e promover a progressão do tumor através da supressão de imunidade do hospedeiro [2, 24]. TAM e MDSCs são dois principais células imunossupressores no microambiente tumoral. TAM suprimir células imunitárias anti-tumorigénica, promovendo assim a metástase [25]. No entanto, o mecanismo de envolvimento TAM na metástase do fígado durante a exposição ao stress psicológico crónica não foi definida. MDSCs também se acumulam em pacientes que relataram altos níveis de estresse psicológico [26-27]. Nossos dados confirmam descobertas anteriores de que o estresse crônico molda o microambiente do tumor através do recrutamento de mais macrófagos e MDSCs em tumor primário, o que pode facilitar a metástase.
Nossos dados mostram que a exposição ao estresse crônico altera significativamente o microambiente do tumor primário, que pode facilitar metástases para órgãos distantes. Importante, a inibição farmacológica da sinalização β-adrenérgico pode ser uma nova estratégia para minimizar CRC metástase para o fígado. Os nossos resultados são consistentes com achados epidemiológicos que ligam o uso de β-bloqueador para reduzir a metástase e mortalidade do cancro do cólon [28, 29]. Nossos dados levanta a possibilidade intrigante de que o tratamento β-bloqueador pode ser uma nova estratégia para a gestão de estresse crônico em pacientes com CRC. Além disso, nossos resultados sublinham a importância de se considerar a psicologia do paciente no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para limitar a progressão do câncer e minimizar as taxas de metastáticos no CRC.
Reconhecimentos
Os autores agradecem técnico Yuejin Gao na Divisão de Zootecnia Laboratório de Putuo Hospital filiado à Universidade Shanghai de Medicina tradicional chinesa para excelente orientação sobre experiências com animais e cuidados mouse.