Abstract
miRNAs desregulado desempenham papéis críticos durante a carcinogênese e progressão do câncer. No presente estudo, a função de miR-1228 * na progressão do cancro regulação foi investigada em cancro gástrico. A diminuição foi observada expressão de miR-1228 * em tecidos de cancro gástrico humano em comparação com tecidos normais. Subsequentemente, o papel de miR-1228 * foi avaliada
In vivo
utilizando o modelo de xenoenxerto de tumor. Neste modelo, o miR-1228 * superexpressão suprimida a formação de tumor de xenoenxerto. Além disso, demonstramos miR-1228 * regular negativamente a actividade de NF-kB em células de câncer gástrico SGC-7901 e descobriu que CK2A2 foi alvo de miR-1228 *. A sobre-regulação de miR-1228 * diminuiu a expressão de marcadores mesenquimais e aumentou o marcador de E-caderina epitelial, sugerindo o seu papel potencial na supressão da transição epitelial-mesenquimal. Colectivamente, estes resultados fornecem a primeira evidência de que o miR-1228 * desempenha um papel importante na regulação do crescimento do câncer gástrico e sugerem que a restauração seletiva de miR-1228 * pode ser benéfico para a terapia de câncer gástrico
Citation:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, D Zhong, Xu S, et al. (2013) Restauração de miR-1228 * Expressão Suprime epitelial-mesenquimal Transição no câncer gástrico. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10.1371 /journal.pone.0058637
editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão
Recebido: 25 de outubro de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 12 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de curta duração ( 20-23 nucleótidos de comprimento), endógenos, RNAs de cadeia simples que regulam a expressão do gene, fazendo com que a repressão ou de translação de mRNA degradação [1], [2]. Através destes mecanismos moleculares, miARNs possuem funções biológicas normais, tais como a regulação da proliferação celular, a diferenciação e a apoptose. Além disso, miARNs desreguladas foram mostrados para desempenhar papéis críticos na regulação da carcinogénese e progressão do cancro [3], [4]. expressão Abberant miARNs têm sido observados em muitos tipos de doenças malignas, incluindo o cancro gástrico [5].
epitelial-mesenquimal transição (EMT) é um evento biológico que permite a reprogramação de células epiteliais de sofrer várias alterações bioquímicas para adquirir uma célula mesenquimatosa fenótipo. Enquanto EMT é crítico para o desenvolvimento embrionário adequado, uma evidência crescente sugere que a activação aberrante de EMT leva à progressão do tumor maligno [6]. Demonstrou-se que EMT é um processo chave contribuindo para o desenvolvimento do cancro, caracterizada pela perda do marcador epitelial de E-caderina, um aumento do marcador mesenquimais vimentina, e um aumento no comportamento migratório e invasiva [7], [8].
no nosso estudo anterior, analisando a matriz de esferas de miARN cancro do pâncreas, o miR-1228 * foi encontrada como um dos miARNs relacionadas com o cancro (dados não mostrados). Aqui, fornecemos evidências de que o miR-1228 * foi regulada para baixo em tecidos com câncer gástrico em comparação com tecidos normais. Restauração da expressão de miR-1228 * em células de cancro gástrico inibe significativamente a migração celular e crescimento tumoral. Mecanicamente, demonstramos que miR-1228 * inibe a activação de NF-kB e potencialmente suprime EMT.
Materiais e Métodos
Cultura de Células
linhas celulares de cancro gástrico humano SGC-7901 , AGS e BGC-823 foram comprados do Instituto de Bioquímica e Biologia celular (Academia chinesa de Ciências). Um gástrica linha de células epiteliais normais GES-1 foi comprado de Pequim Instituto de Pesquisa do Câncer. Estas células foram mantidas a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% em meio RPMI-1640 (SGC-7901 e BGC-823), F-12K (AGS) ou DMEM (GES-1) meio suplementado com soro de bovino fetal a 10% [ ,,,0],9], [10].
amostras clínicas
Cinquenta pares de câncer gástrico e amostras de tecido não-cancerosas adjacentes foram obtidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica no Segundo Hospital Filiado, College of Medicine , Universidade de Zhejiang. Os tecidos adjacentes não cancerosas correspondentes foram obtidos pelo menos, 5 cm de distância do local do tumor. Nenhum dos pacientes tinham sido submetidos a radioterapia ou a quimioterapia antes da cirurgia. As amostras de tecidos foram recolhidos, congelados instantaneamente em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C até serem usadas [11]. Todos os tecidos foram histologicamente confirmado para ser adenocarcinomas gástricos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Second Affiliated Hospital Ética da Zhejiang University College of Medicine. O consentimento informado assinado foi obtido de todos os participantes ou dos representantes dos pacientes se o consentimento direto não poderia ser obtida.
Extração de RNA e PCR em tempo real
O RNA total foi extraído das células cultivadas ou foi determinada tecidos utilizando Trizol (Invitrogen), e a concentração de ARN total. Síntese de cDNA e PCR em tempo real foram realizados utilizando o TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems) e o Kit de Ensaio TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems), respectivamente. PCR em tempo real foi realizada num ™ PCR System em tempo real da Applied Biosystems StepOnePlus de acordo com o protocolo. O nível de miR-1228 * expressão foi normalizada para RNU6B. As reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado. A expressão relativa de miARNs foi calculada usando o método comparativo Ct [12].
A inoculação do tumor em ratinhos nus Ensaio
fêmea BALB /c atímicos nu ratos com a idade de 4 semanas, foram adquiridos a partir de o Shanghai Centro de animais de Laboratório (Academia chinesa de Ciências). Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Experimental animal de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang. miR-1228 * ou miR-NC transfecção estável de células suspensões SGC-7901 (2,5 × 10
7 células /mL) em meio isento de soro de 200 ul foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus, respectivamente. O crescimento do tumor foi examinado duas vezes por semana durante 5 semanas e o volume do tumor (V) foi monitorizado por medição do comprimento (L) e a largura (W) do tumor com compassos e calculada com a fórmula V = 1/2 (L x W × W) [13].
A migração celular
A capacidade de migração de miR-1228 * ou células SGC-7901 transfecção estável miR-NC foram detectadas utilizando Transwells (tamanho de poro de 8 mm, Corning). Os Transwells foram colocadas em placas de 24 poços. células recentemente tripsinizadas e lavadas foram suspensas em RPMI1640 isento de soro contendo 100 uL de soro fetal de bovino a 1%. Cerca de 1 × 10
5 células /poço foi colocado na câmara de topo de cada molde de inserção. 200 ul de RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 20% foi adicionado para dentro das câmaras inferiores. Após incubação durante 24-48 h a 37 ° C em 5% de CO
2 incubadora humidificada, as células foram fixadas com 95% de álcool absoluto e coradas com violeta de cristal [14]. As células na câmara interior foram removidos com uma cotonete e as células ligadas ao lado inferior da membrana foram contadas e fotografadas sob um microscópio invertido a 200 × ampliação ao longo de cinco campos aleatórios em cada poço. Cada experiência foi realizada em triplicado.
Western Blot
Total de proteínas foram medidas utilizando o kit BCA (Pierce), de acordo com o protocolo do fabricante. As proteínas de células foram fraccionados por electroforese em membranas de 12% de gel de poliacrilamida SDS e transferidas para nitrocelulose (NC-electro) durante 2,5 horas a 200 V. O NC membranas foram incubadas com tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por tratamento durante a noite com o anticorpo primário a 4 ° C, e, em seguida, com um anticorpo secundário conjugado com HRP (MBL). Após lavagem, as bandas reactivas foram detectadas utilizando um kit de detecção por transferência de ECL Western (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos utilizados nesta experiência foram de anticorpo monoclonal de coelho anti-E-caderina (Epitomics), anti-vimentina (Epitomics), anti-β-catenina (Epitomics), anti caracol-(Cell Signaling), anti Slug-(Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) e rato anti-GAPDH (Kangchen Biotech).
imunohistoquímica
As secções de parafina, 3- um de espessura, foram cozidos durante 2 h a 60 ° C e desparafinizados. A recuperação de antígenos foi realizada utilizando tampão de citrato de sódio (pH 7,2) a 95 ° C durante 15 minutos e, em seguida, as lâminas foram arrefecidos à temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois de ser tratada com peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 minutos para bloquear a peroxidase endógena, as secções foram tratadas com o líquido de soro de cabra normal a confinar durante 30 minutos, para reduzir a ligação não específica e em seguida, policlonal de coelho anti-caderina-E (Santa Cruz) ou monoclonal de coelho anti-vimentina (Epitomics) foi incubada as secções durante 12 h a 4 ° C. Após reaquecimento, durante 1 h e lavar por 5 vezes, as secções foram incubadas com anticorpo secundário por 30 minutos à temperatura ambiente. Diaminobenzidina foi utilizada para reacções de cor.
plasmídeo Construção e transfecção celular
O miR-1228 * vector de expressão (miR-1228 *) ou controle negativo (miR-NC) foi construído por clonagem de oligonucleótidos emparelhados que continham a otimizado miR-1228 * haste-laço (oligonucleotídeos foram concebidos como: top vertente, 5′-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TGG TTT CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ‘ ;. cadeia inferior, 5’- CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ‘) ou controle de haste-laço negativo em pcDNA6.2-GW /EmGFP vetor ( Invitrogen) [15]. A região do promotor * miR-1228 2-kb foi amplificado (iniciadores foram concebidos como: para a frente, 5’-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG CCA CAC AGA AG-3 ‘; reverso, 5’-TGA GAC AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 ‘.) e coloned para pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], como o nome pGL3-miR-1228 * -promoter. O vazio pGL3-Enhancer Vector agiu como um controle negativo (pGL3-controle). A região alvo de miR-1228 * da sequência 3’UTR CK2A2 foi quimicamente sintetizado por Shanghai Biotech e inserida a jusante do plasmídeo PMIR-RELATÓRIO luciferase (Applied Biosystems), nomeada como PMIR-CK2A2. O clone pReceiver-c-rel ORF com GFP-tag foi comprado de GeneCopoeia. Para gerar células transfectadas estáveis, o miR-1228 * e construções de expressão de miR-nc foram transfectados para a linha celular de SGC-7901 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 horas, blasticidina (14 ug /ml) foi adicionado ao meio. O pGL3-miR-1228 * -promoter /controle, GFP-c-Rel /controle, PMIR-CK2A2 /controlo ou NF-kB repórter vector (Promega) foram transitoriamente transfectados em células SGC-7901 usando Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) foi utilizado como a normalização interna [17].
luciferase Reporter Assay
ensaio de repórter de luciferase foi realizada em células SGC-7901. As células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas em tampão de lise passiva (Promega) e as actividades de luciferase foram medidos a partir de 20 ul de lisado usando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega) em GloMax 20/20 Luminómetro (Promega). Todos os dados foram obtidos por cálculo da média dos resultados de pelo menos três repetições independentes.
Análise estatística
As diferenças entre os níveis de expressão do miR-1228 * em doentes com cancro gástrico foram determinados por teste de Wilcoxon -rank assinado teste. Os dados clínicos foram analisados utilizando o teste do qui-quadrado. O teste t de Student e ANOVA foram utilizados para analisar os
in vitro Comprar e
In vivo
dados. Todos
P valores
eram dois lados e as diferenças foram definidos como estatisticamente significativa para
P Art 0,05. Os resultados foram analisados usando o software V.16.0 SPSS (SPSS Inc). * P 0,05, ** P 0,01.
Resultados
miR-1228 * é frequentemente regulada no câncer gástrico humano
Em primeiro lugar, para determinar se o miR-1228 * é diferencialmente expressos em humanos primários cancros gástricos, o nível do madura miR-1228 * expressão foi examinada utilizando TaqMan-PCR em tempo real em 50 pares de tecidos de cancro gástrico humano e tecidos gástricos não cancerosas adjacentes correspondeu-par. Os nossos resultados mostraram que o nível de miR-1228 * expressão foi significativamente diminuída nos tecidos de cancro gástrico em comparação com os tecidos adjacentes não cancerosas gástricos (Fig. 1a). Cerca de 72% das amostras de tumor eram inferiores expressos com miR-1228 * (Fig. 1B). Usando 2
-ΔΔCT valores, mudança dobra de miR-1228 * 1.0 foi considerado baixo, enquanto ele 1,0 foi considerada como uma expressão elevada [18]. miR-1228 * expressão também foi avaliado em linhas celulares de cancro gástrico e uma linha imortalizada da mucosa gástrica normal de célula epitelial (GES-1). Como mostrado na Fig. 1C, miR-1228 * foi significativamente baixa expressão em todas as linhas de células de cancro, em comparação com GES-1. Tomados em conjunto, estes resultados fornecem fortes evidências de que o miR-1228 * foi regulada no cancro gástrico.
(A) Em tecidos de câncer gástrico humano em comparação com os tecidos adjacentes emparelhados não cancerosas (normais) gástricas, o miR-1228 * foi regulada para baixo. A expressão de miR-1228 * foi analisada por PCR em tempo real e normalizado para RNU6B. Os resultados são apresentados numa escala logarítmica. As diferenças estatísticas entre as amostras foram analisadas com o teste de Wilcoxon-rank assinado (n = 50). (B) A expressão relativa de miR-1228 * em 50 tecidos de cancro gástrico em comparação com os tecidos normais correspondentes. Os dados são mostrados como 2
valores -ΔΔCT. (C) A expressão do miR-1228 * em 3 linhas celulares de cancro gástrico e uma linha imortalizada da mucosa gástrica normal de célula epitelial (GES-1) foi realizada por PCR em tempo real e normalizado para RNU6B. Os resultados são médias ± SEM, n = 3.
Além disso, o miR-1228 * expressão foram avaliados no que diz respeito às características clinicopatológicas dos pacientes. Todos os pacientes não tinham metástases à distância e todos os tecidos foram histologicamente confirmado com adenocarcinomas gástricos. Todos os casos (n = 50) foram estratificados em dois grupos: o miR-1228 * baixa expressão (n = 36) e miR-1228 * expressão elevada (n = 14). O grupo de baixo-expressão de miR-1228 * tinha inclinações para maior tamanho do tumor. No entanto, não houve relação significativa entre o miR-1228 * expressão e outras características clínico-patológicas, tais como idade, sexo, tipo histológico ou estágio TNM (Tabela 1).
Aumento miR-1228 * Expressão Suprime xenoenxerto formação de tumores
a fim de avaliar o papel funcional do miR-1228 * no câncer gástrico, o miR-1228 otimizado * haste-laço foi clonado em pcDNA6.2-GW /EmGFP vetor. linha celular gástrica células SGC-7901 foram transfectadas com /EmGFP-miR-1228 * ou pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC linhas vetoriais e celulares estáveis pcDNA6.2-GW foram gerados e chamado miR-1228 * ou miR-NC, respectivamente. Como esperado, a análise de RT-PCR demonstrou que as células estáveis * miR-1228 teve um aumento de madura miR-1228 * a expressão quando em comparação com células estáveis miR-NC (Fig. 2a). Não houve alteração morfológica em células estáveis transfectadas * miR-1228 em comparação com as células não transfectadas. células SGC-7901 com ou sem transfecção de miR-1228 * foram implantados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus para avaliar os efeitos potenciais de miR-1228 * sobre o crescimento do câncer gástrico
in vivo
. A sobre-expressão de miR-1228 * suprimiu significativamente o crescimento do tumor (Fig. 2B). Até ao final do período experimental, o tamanho e o peso húmido de tumores com miR-1228 * a sobre-expressão foi significativamente menor e menor do que a do grupo de controlo (Fig. 2C-D). Assim, os dados indicam que o miR-1228 * inibe o crescimento do tumor xenoenxerto de células cancerosas gástricas
in vivo
.
(A) miR-1228 * foi alterações mais de dez vezes no miR- 1228 * estável transfectada SGC-7901 em comparação com o NC. Os resultados são médias ± SEM, n = 3. (B) Aumento da miR-1228 * expressão suprime o crescimento de tumor de xenoenxerto. Transfecção estável de células SGC-7901 com miR-1228 * ou miR-NC foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. O volume de cada tumor foi medido duas vezes por semana. O volume médio dos tumores desenvolvidos em ratinhos nus é apresentado como médias ± SEM, n = 6 por grupo de tratamento. As diferenças estatísticas entre as amostras foram determinados pelo ANOVA de duas vias. (C) Em comparação com o controlo, os xenoenxertos com miR-1228 * sobreexpressão foram significativamente menores. Os ratinhos foram sacrificados 5 semanas após a inoculação. fotografia de tumores dois grupos ‘é mostrada. (D) Os tumores de cada grupo foram pesados imediatamente após a remoção. O peso do tumor é indicado como meios ± SEM, n = 6.
NF-kB ativação é Responsável pela menor expressão de miR-1228 * em Câncer Gástrico
Um trabalho recente tem demonstrou que a maioria dos miRNAs têm fator de transcrição (TF) sítios de ligação e muitos estudos têm relatado que miRNAs poderia ser regulada pela TFS [19]. Aqui nós utilizados programas de bioinformática (Promotor 2.0 e P-jogo) para identificar potenciais reguladores de miRNA-1228 * [16], [17]. Encontramos três c-Rel domínios de ligação no 2 kb miR-1228 * região promotora (Fig. 3A). Desde subunidade c-Rel é um membro da família NF-kB e hiperactivação de actividade de NF-kB foi mostrado estar associado com o cancro gástrico [20], [21]. Colocámos a hipótese de que a activação de NF-kB é atribuído à regulação negativa do miR-1228 * em cancro gástrico.
(A) representação esquemática da região de promotor de miR-1228 * (pontas de seta pretas é a ligação de c-Rel domínios), menor é o pGL3-miR-1228 * construto -promoter. (B) 24 horas após a transfecção com pGL3-miR-1228 * -promoter ou pGL3-controlo, as células SGC-7901 foram estimuladas com ou sem TNF-α e /ou PDTC durante 8 horas, em seguida, a actividade de luciferase foi medida relativa. A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla expressa pelo pRL-TK e, em seguida, em comparação com o nível de luciferase relativa de pGL3-controlo. *
P
0,05 como comparado com o controlo.
#
P Art 0,05 em comparação com o grupo de TNF-α tratado. células (C) SGC-7901 foram co-transfectadas com pGL3-miR-1228 * -promoter /pGL3-controlo e GFP-C-Rel /-GFP de controlo, e a expressão de luciferase relativa foi detectada 48 horas mais tarde. A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla expressa pelo pRL-TK e, em seguida, em comparação com o nível de luciferase relativa de GFP-controlo. Os dados foram expressos como média ± SEM, n = 3.
Para provar nossa hipótese, criamos uma luciferase construir com a região * promotor de miR-1228 e avaliada a sua actividade em resposta à ativação de NF-kB. Foi realizada uma experiência através da cultura de células SGC-7901 durante 8 horas na presença de TNF-α (50 ou 100 ng /ml, clássico NF-kB via de activador) e /ou pirrolidina ditiocarbamato (PDTC, 100 uM), um amplamente utilizados inibidor do factor de transcrição NF-kB [22]. células SGC-7901 foram transfectadas com pGL3-miR-1228 * -promoter ou pGL3-controlo, 24 horas mais tarde, as células transfectadas SGC-7901 foram expostas durante 8 horas para TNF-α com ou sem PDTC para investigar se regula activação de NF-kB miR-1228 * a actividade do promotor. Observou-se que o tratamento com TNF-α marcadamente inibida miR-1228 * a actividade do promotor e a inibição do NF-kB com PDTC impedido downregulation mediadas pelo TNF-α dos níveis de actividade (Fig. 3B), o que sugere que NF-kB pode regular negativamente miR- 1228 * expressão. Para determinar ainda se subunidade NF-kB c-Rel é responsável pela desregulamentação miR-1228 *, nós transfectadas células SGC-7901 miR-1228 * -promoter com ou sem GFP-c-Rel e observaram uma diminuição significativa da actividade da luciferase em GFP grupo -C-Rel de controlo (Fig. 3C). Colectivamente, os dados sugerem que o NF-kB subunidades c-Rel contribui funcionalmente à regulação baixa de miR-1228 * no câncer gástrico.
miR-1228 * Suprime NF-kB atividade e expressão CK2A2 no SGC-7901
a fim de investigar a influência de miR-1228 * na via de sinalização de NF-kB, o NF-kB construções repórter foram transfectados em qualquer miR-1228 * ou miR-NC estáveis transfectadas células SGC-7901 e a actividade de NF-kB de luciferase foi determinada após 48 horas. Os nossos resultados mostraram que a actividade de NF-kB foi significativamente diminuído por sobre-expressão de miR-1228 * (Fig. 4A), o que indica um ciclo de realimentação negativa entre o miR-1228 * expressão e a actividade de NF-kB. Para melhor identificar alvos a jusante de miR-1228 * na via de NF-kB, foi realizada a análise bioinformática e CK2A2 encontrada foi um dos genes alvo putativas que foram preditos. Usando Miranda e RNA22 [23], [24], nós localizado a um local de ligação potencial de miR-1228 * no 3’UTR de CK2A2 (Fig. 4B). CK2A2 é uma subunidade de cinase CK2 proteína que está envolvida na via de NF-kB [25], [26] e a sua expressão tem sido observado para ser regulados positivamente em vários cancros, incluindo o cancro gástrico [27], [28]. Outras investigações sobre a associação entre CK2A2 e miR-1228 * demonstraram que os níveis de proteína de CK2A2 foi concomitantemente regulada para baixo em cima de miR-1228 superexpressão * estável em células SGC-7901 (Fig. 4C). A fim de verificar se CK2A2 é um verdadeiro alvo de miR-1228 *, de um segmento da 3’UTR CK2A2 contendo o local de ligação foi clonado no 3’UTR do gene da luciferase no plasmídeo PMIR-REPORT [29]. A intensidade de fluorescência do gene repórter foi significativamente diminuída no grupo que foi co-transfectado com PMIR-CK2A2 e miR-1228 * em comparação com o controlo (Fig. 4D). Estes resultados sugerem que o miR-1228 * interage com o ARNm CK2A2 3’UTR.
(A) SGC-7901-miR-1228 * e SGC-7901-miR-NC foram transfectadas com o repórter NF-kB construir, respectivamente. 48 horas após a transfecção, a actividade da luciferase foi medida. A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. Os resultados são médias ± SEM, n = 3. (B) do gráfico esquemático do local de ligação putativo do miR-1228 * na CK2A2 previsto por Miranda. (C) análise de Western blot revelou que o nível de proteína de CK2A2 in * superexpressão estável células SGC-7901 miR-1228 diminuiu significativamente em comparação com o miR-NC. O nível de GAPDH foi usada como um controlo de carga. (D) o miR-1228 * reduziu significativamente a leitura de luciferase quando co-transfectado com o plasmídeo PMIR-CK2A2 3’UTR, indicando interacção entre o miR-1228 * e CK2A2 3’UTR neste local. A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla expressa pelo pRL-TK. Os dados foram expressos como média ± SEM, n = 3.
miR-1228 * Inibe EMT
Tem sido relatado que a activação de NF-kB desempenha um papel essencial na EMT a progressão do cancro [30], [31], e a inibição da actividade de NF-kB em algumas linhas celulares de tumor causou uma inversão de EMT [32]. Desde miR-1228 * parece negativamente regula a atividade de NF-kB, que, portanto, investigar se miR-1228 * também pode regular negativamente EMT no câncer gástrico. Western blot mostrou que a sobre-expressão de miR-1228 * em células SGC-7901 marcadores mesenquimais regulada para baixo (vimentina, β-catenina, Caracol, Lesma, e ZEB1 /2), enquanto que sobre-regulada marcador epitelial E-caderina (Fig. 5A ). Além disso, o miR-1228 * superexpressão causou uma diminuição da migração de células (Fig. 5B-C). coloração imuno-histoquímica foi utilizada para confirmar ainda mais proteínas relacionadas com alterações EMT de miR-1228 * células transfectadas SGC-7901 no modelo de xenoenxerto. Foi demonstrado que a diminuição da expressão de vimentina e expressão de E-caderina aumentada quando comparado com o que em células de controlo (Fig. 5D). Os resultados semelhantes foram observados em outra linha de células de câncer gástrico AGS (Fig. S1). Os dados fornecem a primeira evidência de que o miR-1228 * restauração no câncer gástrico regula negativamente a EMT.
(A) Análise de Western blot do marcador epitelial (caderina-E) e marcadores mesenquimais (Vimentin, β-catenina, Caracol , Slug e ZEB1 /2) no miR-1228 * estáveis transfectadas células e controle SGC-7901. ensaio de migração (B) Transwell mostraram que as células SGC-7901 estáveis transfectadas com miR-1228 * teve menor potencial migratório em comparação com o miR-NC (× 100). (C) O nível relativo da migração das células é apresentado como a média ± SEM, com base em três experiências independentes. (D) Expressão de marcadores relacionados com a EMT em tumor xenoenxerto. coloração imuno-histoquímica revelou um decréscimo no Vimentin e aumento da expressão de E-caderina em miR-1228 * tumor xenoenxerto em relação ao controle (× 400).
Discussão
O câncer gástrico é o quarto mais comum tumor maligno em todo o mundo e atualmente é a segunda principal causa de mortalidade relacionada com o cancro [33], [34]. Embora a prática corrente que combina quimioterapia ou radioterapia com ressecção cirúrgica aumentou significativamente a sobrevida global de pacientes com câncer gástrico, a taxa de sobrevida global em 5 anos ainda é baixo. carcinogénese gástrica é considerada como um processo multifactorial e múltiplos passos que envolve a activação de oncogenes e a inactivação de genes supressores de tumor [35].
miARNs são endógenas RNAs curtos que desempenham papéis importantes em celular não codificadora de proteínas fisiologia, desenvolvimento, e doenças regulando negativamente a expressão do gene. As análises de perfis de expressão de miARN têm mostrado que muitos miARNs são expressas de forma aberrante e correlacionada com a tumorigénese, progressão e prognóstico de vários tumores hematológicos e sólidos, incluindo o cancro gástrico [36]. Para identificar e explicar as funções biológicas dos miRNAs desregulamentação no câncer gástrico pode nos ajudar a entender melhor a patogênese desta doença mortal e proporciona novas oportunidades para desenvolver terapias baseadas em miRNA. Por exemplo, o miR-221 e miR-222 foram mostrados para ser regulando positivamente a proliferação de células de cancro gástrico e invasão, sugerindo que a inibição dessas seleccione miARNs ser benéfico para tratamentos contra o cancro gástrico [37]. miARNs desempenham um papel na etiologia e patogénese de vários cancros por alvo um número de oncogenes ou genes supressores de tumor. miR-21 é sobre-expresso na mucosa gástrica por H. pylori-infected e tecidos de cancro gástrico. expressão forçada de miR-21 aumenta a capacidade de invasão de células de cancro gástrico, RECK é o alvo directo de miR-21 [38]. miR-218 inibe a invasão e metástase de câncer gástrico, visando o receptor Robo1 [39]. Ueda et al [40] identificou 22 up-regulada e 13 miRNAs regulados negativamente em câncer gástrico contra mucosa não tumoral, baixa expressão de deixá-7g e miR-433 e alta expressão de miR-214 foram associados com resultado desfavorável em geral sobrevivência independente de co-variáveis clínicas, incluindo profundidade de invasão, metástase do nó de linfa, e palco. miR-375 é frequentemente sub-regulada no cancro e da função gástrica como um supressor de tumor, para regular a proliferação de células de cancro gástrico potencialmente alvejando o oncogene JAK2 [10]. Nosso outro estudo mostrou miR-1228 * foi um epitelial câncer relacionado ao miRNA (inédito). No entanto, apenas algumas pesquisas de miR-1228 * têm sido relatados. Guled et al [41] demonstraram que o miR-1228 * foi altamente expressa em amostras de mesotelioma maligno em comparação com amostras normais. Mas a função biológica desta miARN ainda não foi avaliado. No presente estudo, identificou-se que o miR-1228 * foi regulada para baixo em mais de 70% de amostras de cancro gástrico quando comparadas com os seus homólogos não tumorais e proporcionam evidência experimental de que ele pode funcionar como um supressor do tumor através da regulação negativa de EMT e inibir o NF -κB atividade.
Nossos dados indicam downregulation de miR-1228 * em tecidos de câncer gástrico e linhas celulares de cancro gástrico. Vários mecanismos moleculares levar a miRNA desregulação, como mutação genética, epigenética aberração e atividade transcricional desregulado [42]. TFs poderia regular a expressão miRNA por ligação a regiões promotoras, em contextos tanto fisiológicas ou patológicas [43]. Para investigar como miR-1228 * foi desregulamentado no cancro gástrico, analisamos a região promotora de 2 kb a montante do miR-1228 * e encontrou três domínios de ligação C-Rel putativos. Apesar de NF-kB é mais conhecido por sua função de activação da transcrição, o trabalho recente com a p65, RelB e c-Rel demonstrou que NF-kB pode regular negativamente genes específicos [17], [44], [45]. Usando um miR-1228 * construção do promotor-repórter que continham fragmentos de 2 kb do promotor * miR-1228, verificou-se que o NF-kB via activador de TNF-α diminuiu miR-1228 * a actividade do promotor. E NF-kB inibidor PDTC antagonizada notavelmente TNF-α mediada miR-1228 * promotor de baixa actividade. Os nossos dados também mostraram que c-Rel foi capaz de se liga directamente com * promotor de miR-1228 e regulam negativamente a sua expressão. Desde subunidade c-Rel é um membro da família NF-kB, a activação de NF-kB phenocopied os efeitos da c-Rel na regulação miR-1228 * expressão, sugerindo que o NF-kB via estava envolvido negativamente na downregulation de miR-1228 * no câncer gástrico. Além disso, o miR-1228 * superexpressão também resultou na regulação negativa da actividade de NF-kB. Portanto, nossos dados delinear um loop de feedback negativo dupla entre NF-kB e miR-1228 *. O mecanismo exato de como esse feedback negativo ocorre precisa ser mais estudada.
CK2A2 é uma subunidade da proteína quinase CK2, que é uma proteína ubiquitous serina /treonina quinase altamente conservado e. A sobre-expressão de CK2 tem sido observado num número de cancros, incluindo os da glândula mamária, próstata, rim, pulmão, cabeça e pescoço e do estômago [27], [46]. Superexpressão de CK2 nas glândulas mamárias de ratos transgénicos provoca hiperplasia e displasia que, eventualmente, levar a adenocarcinomas [47]. CK2 foram sobre-expressos em cabeça e pescoço escamosas linhas de carcinoma de células e tecidos. Knockdown de subunidades CK2 diferencialmente inibida degradação IκBα, localização nuclear de NF-kB, fosforilação, ligação de ADN, e a actividade repórter [25]. CK2 desempenha um papel importante na sua 2-sinalização /neu, promovendo a degradação de IkB e a activação de NF-kB [26]. Neste estudo mostramos que o miR-1228 * reduziu a expressão de CK2A2 ao nível da proteína. O ensaio de luciferase com um repórter que contém o miR-1228 * sequência de ligação à 3’UTR do mRNA CK2A2 sugeriu que miR-1228 * visa diretamente o 3’UTR de CK2A2. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a supressão da actividade de NF-kB por miR-1228 * pode ser através de expressão de segmentação CK2A2. EMT é agora todos conhecidos por ocorrer em uma variedade de doenças, incluindo a progressão de cancro. Reconhece-se que EMT é um processo importante para formar histologia difusa e iniciar a metástase através do aumento da motilidade de células tumorais [48]. EMT é regulada por diferentes vias de sinalização oncogénicos, tais como AKT e NF-kB [49], [50]. Especificamente, a activação de NF-kB foi mostrado para promover EMT enquanto que a inibição da actividade de NF-kB em células mesenquimais provoca uma inversão de EMT [30]. A perda da expressão de E-caderina e ganho de expressão de vimentina são considerados como sendo os mais importantes marcadores moleculares de EMT [51].