Sumário

A mortalidade por câncer de próstata (PCA) é devido à formação de doença metastática. A compreensão de como esse processo é regulado é, portanto, fundamental. Nós já demonstrou que endoglin, um tipo III transformando β do fator de crescimento (TGF) receptor superfamília, suprime a invasão humana de células CaP e metástase. Endoglin mediada por supressão de invasão também foi demonstrado por nós como sendo dependente do tipo do receptor de TGFp que, activina como receptor-quinase 2 (ALK2), e o efector a jusante, Smad1. Neste estudo, demonstramos pela primeira vez que dois receptores de tipo II de TGF-p são necessários para a supressão mediada por endoglina de invasão: Activina A AII tipo de receptor (ActRIIA) e morfogenética óssea do receptor de tipo II de proteína (BMPRII). sinalização a jusante através destes receptores é predominantemente mediado pela Smad1. ActRIIA estimula a activação Smad1 de um modo dependente-quinase, e este é necessária para a supressão de invasão. Em contraste BMPRII regula Smad1 de uma forma bifásica, promovendo Smad1 sinalização através de seu domínio cinase, mas suprimi-lo através de sua cauda citoplasmática. efeitos Smad1-regulação do BMPRII são dependentes de seu nível de expressão. Além disso, a sua capacidade para suprimir a invasão é independente de qualquer função quinase ou domínio cauda. Nós demonstramos que ActRIIA e BMPRII interagem fisicamente e que cada um também interage com endoglina. Os resultados actuais mostram que tanto BMPRII e ActRIIA são necessárias para a supressão mediada por endoglina de invasão de células de CaP humano, que têm efeitos diferenciais sobre a sinalização Smad1, que eles fazem contribuições separadas para regulação da invasão, e que eles funcionalmente e interagem fisicamente.

Citation: Breen MJ, Moran DM, Liu W, X Huang, Vary CPH, Bergan RC (2013) supressão mediada-Endoglin de Prostate Cancer Invasion é regulada por Activina and Bone Morfogenéticas Tipo Protein Receptores II. PLoS ONE 8 (8): e72407. doi: 10.1371 /journal.pone.0072407

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Setembro, 2012; Aceito: 15 de julho de 2013; Publicação: 13 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Breen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde para RCB, CA122985. Este trabalho é apoiado em parte pelos Malkin Scholars Programas do Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center da Universidade Northwestern via um prêmio para MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum ea segunda causa de mortalidade por câncer para os homens norte-americanos [1], com essencialmente todas as mortes resultantes de doença metastática [2]. A metástase é um processo altamente ineficiente em que as células têm de superar as barreiras numerosas, uma primeira das quais é uma fuga a partir do local de origem através da aquisição de um fenótipo invasivo [3]. A sinalização através da superfamília TGF-p e os seus receptores associados é um regulador chave do presente processo em numerosos tipos de cancro [4], incluindo CaP [5]

TGFp é o membro protótipo de uma família de ligandos extracelulares. – Dos quais existem 33 em mamíferos – que regulam vários processos de desenvolvimento e homeostático, e fazê-lo através de um mecanismo relativamente conservada sinalização [6]. Com a sinalização canônica TGF, a ligação do ligando induz oligomerização de dímeros de tipo serina /treonina quinase I e tipo II receptores (RIS e Riis, respectivamente), em que constitutivamente ativa Riis, em seguida, fosforilar RIS. Estes IR activados então fosforilar Smads associadas ao receptor a jusante (R-SMADs). O fosforilada R-Smad subsequentemente se liga ao mediador comum, Smad4, e os complexos resultantes afectam a transcrição de genes. Em termos gerais, a sinalização através desta superfamília pode ser subdividida em ligandos TGFp-like cujo IR cognato tendem a ser quinase do tipo receptor de activina (ALK) 4, 5, ou 7, tendendo para activar o R-Smads Smad2 ou 3, e morfogenética óssea proteína (BMP) -like ligandos de sinalização através cognato IR Alq1, 2, 3, ou 6, e R-Smads Smad1, 5, ou 8.

Endoglin (também referido como CD105) é uma proteína homodimérica transmembranar que actua como um receptor da superfamília TGF-p auxiliar, e é considerado um receptor tipo III [7] – [9]. Endoglin modula a sinalização a jusante de ligandos de TGF-p e BMP, que tende a promover a sinalização através de vias preferencialmente BMP-like, enquanto inibidores de TGFp-like vias [10] – [14]. Além disso, endoglina regula numerosos processos celulares através de vias dependentes não-Smad. Pertinente a invasão celular, endoglin interage através de seu domínio citoplasmático com as proteínas LIM-domínio contendo zyxin e zyxin relacionadas com a proteína 1 para regular a composição de adesão focal e do citoesqueleto de actina [15], [16]. Além disso, endoglina regula a activação de integrina e de sinalização em um número de processos celulares [17] – [21]. Endoglin também pode modular o potencial transformador da H-Ras [22].

O papel da endoglin no câncer é complexa, dada expressão e função diferencial através tipos de células [23], [24]. A maioria dos estudos de função endoglina foram realizados em células endoteliais. mutações da linha germinativa em endoglina causar a doença genética telangiectasia hemorrágica hereditária [25], com destaque para o papel da endoglina como um regulador chave da motilidade celular endotelial, invasão e proliferação. Em vários cancros, incluindo o APC, endoglina está sobre-expresso em células endoteliais da microvasculatura e está associado com a angiogénese [26] – [28]. É também altamente expresso no microambiente estromal [29]. Assim, ao nível dos tecidos em geral, é muitas vezes endoglina sobre-expresso em cancro. Em contraste e de grande importância, em células epiteliais de vários tumores sólidos – e no epitélio da próstata, em particular, – e que outros demonstraram que a expressão endoglina é perdida com a progressão da doença [30], [31]. Demonstrámos que este promove a perda de separação celular [31], a invasão de células [14], [32] e metástase [33]. Mecanisticamente, mostrámos que a endoglina suprime a invasão de um modo que é dependente do RI ALK2 e a jusante R-Smad Smad1 [14]. No entanto, os Riis envolvidos neste processo permanecem desconhecidos.

Dado o papel de ALK2 e Smad1 na supressão mediada por endoglin de invasão (EMSI) na APC, a hipótese de que um ou mais Riis estão envolvidos neste processo. Neste relatório nós identificamos que ActRIIA e BMPRII são obrigatórios. Curiosamente, eles têm efeitos opostos sobre a sinalização a jusante Smad1. ActRIIA promove o eixo de sinalização anteriormente identificado, enquanto BMPRII tem a função bimodal, a promoção de sinalização Smad1-dependente através da sua actividade de cinase, inibindo-o, através do seu domínio grande cauda citosólica. Juntos, estes resultados são os primeiros a identificar ActRIIA e BMPRII como reguladores importantes da EMSI e demonstrar que eles operam através de mecanismos ainda interdependentes distintas. Estes resultados novos caminhos abertos para a segmentação farmacológico da CaP potencial metastático

Materiais e Métodos

Cultura Celular Transfecção

A origem e condições de cultura para células CaP humanos PC3-M foram descritos [34]. A linha PC3-H é uma linha celular PC3-derivado altamente metastático. Eles foram mantidos em meio RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, tampão HEPES 10 mM, 50 unidades /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, e 10% de soro fetal de bovino (Life Technologies, Grand Island NY). As células são células DU145 CaP humanas derivadas de uma metástase cerebral e foram obtidas de ATCC (Manassas, VA). Estas células foram mantidas em meio DMEM suplementado com os produtos acima mencionados, além de piruvato de sódio 1 mM (Life Technologies). Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5% e ar a 95% sob condições de crescimento exponencial sub-confluentes com mudanças de meio de três em três semanas, e foram substituídas por células-passagem fixado sobre uma base regular.

as linhas celulares foram autenticadas de acordo com métodos descritos na American Type Culture Acervo Técnico Boletim No. 8, Cell Recomendações Linha teste de verificação [35]. Especificamente, as células de baixa passagem (ou seja,. 15 passagens) congelados stocks foram utilizadas e foram reabastecido após 20 passagens; As células foram submetidos a exame microscópico de rotina para confirmar uniforme e arquitetura celular padrão e nenhuma infecção microbiana; e as células foram testadas (dentro de três meses) e considerado negativo para a infecção por micoplasma.

transfecção transitória de células foi realizada como descrito anteriormente [36]. Resumidamente, 24 horas após o plaqueamento, as células foram transfectadas com transit-LT1 Transfection Reagent (Mirus Bio LLC, Madison, WI) para ensaios de invasão envolvendo apenas DNA plasmídeo, com Dharmafect Duo (Thermo Scientific, Lafayette, CO) para ensaios de invasão envolvendo entrega simultânea de DNA plasmídeo e siRNA, ou com Dharmafect2 (Thermo Scientific, anteriormente Dharmacon) para a invasão e luciferase experimentos envolvendo entrega de siRNA sozinho. Para as experiências de imunoprecipi tacão, as células foram transfectadas com ADN de plasmídeo utilizando Lipofectamina LTX (Life Technologies). As células foram então utilizadas nos ensaios indicados 24-48 horas após a transfecção. Todos os reagentes foram utilizados conforme as instruções do fabricante. Em algumas experiências, como indicado, as células foram lavadas duas vezes com PBS, privadas de soro em meio contendo 0,1% de albumina de soro bovino, durante 3 horas, e tratou-se com 2 ng /ml de TGF-p, 5 ng /ml BMP7, ou 20 ng /ml BMP9 durante 30 minutos antes da lise

Reagentes

anticorpo neutralizante para ActRIIA, Fc-ActRIIA e armadilhas de ligando Fc-BMPRII, e o TGF-p humano recombinante foram adquiridos a partir de R .; D Systems (Minneapolis MN) . Os anticorpos para as seguintes proteínas foram adquiridos: fosfo-Smad1 /5, fosfo-Smad1 /5/8, Smad1, e Myc-tag da Cell Signaling Technology (Danvers, MA), endoglina da BD Biosciences (San José, CA), de GAPDH Enzo de ciências da vida (Farmingdale NY), FLAG-tag e Myc-tag a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), α-tubulina de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), IgG conjugado com HRP de cabra anti-ratinho (H + L) F (ab?) 2 fragmento de KPL (Gaithersburg, MD), e anticorpo inteiro de burro anti-ECL coelho Biociências da GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Os siRNAs utilizados neste estudo foram todas as piscinas de quatro siRNAs individuais, ordenados da Thermo Scientific como ON-TARGETplus SMARTpools

Os plasmídeos

Foram utilizados os seguintes vetores de expressão:. PCDNA3 vazio vector comprado de Vida Technologies, endoglina num vector pcDNA3, foi construído e previamente descrito por nós [31], pCMV-β-galactosidase (β-gal) adquirido da Agilent Technologies (Santa Clara, CA), pCDNA3-ActRII, pCDNA3-ActRIIA-ΔKD- 5myc, pCDNA3-ActRIIB e pCDNA3-ActRIIB-ΔKD-5myc foram generosamente fornecidos pela Wylie Vale (Salk Institute, La Jolla, CA) [37], [38], pCDNA3-ActRIIA-myc foi gerado a partir de pCADN3-ActRIIA por ADN personalizado construções (University Heights, OH), pCMV5-BMPRII, -BMPRII-Ki e -BMPRII-Δtail construções foram generosamente fornecidos por Liliana Attisano (Universidade de Toronoto, Canadá) [39], pGL3-MLP-BRE

2-luciferase foi uma oferta generosa de Peter dez Dijke (Universidade de Leiden Medical Center, Holanda) [40], pRL-TK

Renilla

luciferase foi adquirido de Promega (Madison, WI).

Invasão Ensaios

ensaios de invasão foram realizados essencialmente tal como descrito anteriormente por nós [41], com as seguintes modificações. Resumidamente, as células foram co-transfectadas com o ADN indicada e β-gal, com ou sem siARN como indicado. Após 48 horas, as células foram plaqueadas em 8,0 de poro do Factor de Crescimento Reduzida-Matrigel Invasão secções (BD Biosciences) em meio isento de soro contendo BSA a 0,1%, em repetições de n = 4 poços para cada condição experimental. meios condicionados NIH-3T3 isento de soro foi colocada na câmara inferior como um quimioatractor, e as células foram deixadas a invadir durante 24 horas. As células no topo da membrana foram removidas a partir de três poços por condição (que permite a quantificação de células invadidas) enquanto que a quarta foi deixado (controlos de células totais) não perturbadas. Depois de fixar as células e coloração para a expressão β-gal utilizando in situ ß-galactosidase A coloração Kit (Agilent Technologies), nove campos microscópicos (de 100x) por poço foram fotografadas em um microscópio Olympus CKX41 equipado com uma câmera digital CCD QImaging RETIGA 1300 e software de imagem QCapture. células positivas β-gal foram contados em cada campo, utilizando o software Image J. e invasão normalizada foi determinada para cada poço como βgal

+ células na invasão bem /β-gal

+ células no poço total. invasão relativa foi calculada como uma fracção de uma condição de controlo (por exemplo, vector vazio /siNeg).

quantitativa da Transcriptase Reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase

O ARN foi isolado a partir de células utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia , CA), seguindo as instruções do fabricante. O ARN foi tratado com ARNase isenta de ADNase e a sua qualidade e quantidade avaliado por densidade óptica. O ADNc foi sintetizado utilizando um TaqMan transcrição reversa Reagentes (Life Technologies) ou qScript ADNc SuperMix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD), e qPCR realizados utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix e TaqMan pares de iniciador-sonda em tempo real PCR System 7500 (todos a partir de Life Technologies), tudo como previamente descrito por nós [33]. reacções RT foram de menos de controlo ser executado como um controlo negativo. genes validados exon abrangendo conjuntos específicos iniciador /sonda para ACVR2A, ACVR2B, BMPRII, TGFβRII, endoglin, Smad1, Smad5, Smad8 e GAPDH foram da Applied Biosystems. Os ensaios foram executados em repetições de 2 e os ciclos resultantes médios dos limiares (TC) foram utilizados para análise posterior. Os ensaios foram repetidos pelo menos uma vez num momento separado, também em réplicas de 2. O Ct para reacções individuais foi identificado através de Applied Biosystems 7500 software Tempo real PCR System. A expressão de genes foi normalizada para a da GAPDH, e a expressão do gene relativo foi calculado pela 2

-ΔΔCt método de [42].

luciferase Ensaios

As células foram transitoriamente transfectadas com pGL3 BRE

2-luciferase (induzível) e pRL-TK (plasmídeos constitutivos) numa proporção de 20:01, com plasmídeos adicionais ± siRNAs como indicado, como anteriormente descrito por nós [14]. Resumidamente, após 48 horas as células foram lisadas e a actividade de luciferase foi medida utilizando um Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). As medições foram efectuadas em ambos um leitor de placas Synergy HT (BioTek, Winooski, VT) ou um luminómetro Monolight 2010 (Analytical Luminescence Laboratory, San Diega CA). Depois de subtrair o sinal de fundo, a actividade da luciferase foi calculado como a relação de /

Renilla luciferase

luciferase de pirilampo.

Western Blotting

A lise celular e imunotransferência foram realizadas como anteriormente descrito por nós [ ,,,0],14]. Resumidamente, as células foram lavadas com PBS, lisadas com tampão de lise: PBS (137 mM de NaCl, fosfato de Na 10 mM, KCl 2,7 mM), 0,5% de Triton X-100, EDTA 1 mM, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, 1 mM de β-glicerofosfato com adição de cocktail inibidor de protease (# P8340), cocktail inibidor de fosfatase 1 e 2, fluoreto de sódio 10 mM, e ortovanadato de sódio 1 mM (todos de Sigma-Aldrich), e os lisados ​​clarificados por centrifugação, tudo a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), quantidades iguais foram separadas por SDS-PAGE sob desnaturantes e redutoras, transferidas para nitrocelulose (Bio-Rad), e coradas com Ponceau S (Sigma-Aldrich ) para verificar até mesmo carregamento e transferência. As membranas foram, quer bloqueada e sondada com o anticorpo primário (4 ° C durante a noite) e secundária (1 h temperatura ambiente) em leite 5% em TBS-T (Tris-HCl a 25, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) ou bloqueada e sondada com 0,5% de leite /TBS-T utilizando ID de SNAP tubagem de vácuo (Millipore), por sugestões do fabricante. As membranas foram então incubadas com ECL Western Blotting Detection Reagents e expostos a Amersham Hyperfilm ECL (ambos da GE Healthcare). Os filmes foram revelados usando um processador de filme SRX-101A (Konica Minolta, Wayne, NJ). As membranas foram retirados em Tris 62,5 mM (pH 6,8), SDS a 2%, e mm β-mercaptoetanol 100 durante 20 minutos a 50 ° C, lavadas brevemente em TBS-T, e re-sondada como acima. Todas as transferências de Western foram repetidas pelo menos uma vez, de cada vez separado.

A imunoprecipitação

As células foram lavadas com PBS e as proteínas de superfície foram reticulados com reagente de reticulação permeável à água, 2 mM de 3,3′- ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP; Thermo Scientific) em PBS. reacção de reticulação foi terminada pela adição de Tris, pH 7,5 a 20 mM. As células foram então lisadas como acima utilizando tampão composto do seguinte: Tris HCl 10 mM, pH 7,4; NaCl 145 mM; 10% de glicerol; 0,5% de NP-40; protease e inibidores de fosfatase como acima. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação e a proteína de concentração foi determinada pelo método de Bradford tal como acima. Uma quantidade igual de proteína foi pré-aclarados com contas de agarose conjugadas com proteína A recombinante (Life Technologies; usados ​​para IgG de coelho) ou Proteína G Plus (Thermo Scientific; usados ​​para IgG de ratinho) durante 1 hora a 4 ° C com rotação. Os lisados ​​pré-aclarados foram transferidos para novos tubos e incubaram-se com IgG durante a noite a 4 ° C com rotação. complexos anticorpo-antigénio foram recuperados por 2 horas de incubação com Proteína A ou Proteína G, em concordância com o passo preclearance. As pérolas foram recuperadas e o sobrenadante foi removido e guardado. As esferas foram lavadas três vezes com tampão de lise arrefecido com gelo. As amostras foram equilibradas com tampão 1X Laemmli contendo 5% β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) e incubado em bloco de calor a 95 ° C durante 6 min, redutoras e desnaturantes e as amostras de clivagem do agente de ligação cruzada. As amostras foram Ocidental apagados como descrito acima.

Análise Estatística

Para analisar ensaios de invasão testes t de uma cauda de Student não pareado foram calculadas com base no fenótipo avaliado de reverter a supressão da invasão. Para ensaios de luciferase e qRT-PCR, foram utilizados os testes t de duas caudas de Student não pareado de Student. P values≤0.05 foram considerados significativos.

Resultados

supressão mediada-Endoglin de Invasion Requer ActRIIA e BMPRII

supressão mediada por Endoglin de invasão (EMSI) em CaP requer um RI, ou seja, ALK2 [14]. Além disso, a sinalização canónica através da superfamília TGF-p de receptores requer a activação dependente do ligando do RI por um [6] RII. Nós, portanto, a hipótese de que EMSI exigiria um ou mais Riis. Nós avaliamos isso por transfecção PC3-M e DU-145 células CaP humanos com endoglin, juntamente com siRNA específico para subtipos RII individuais: ativina A do receptor de tipo II (ActRIIA), activina Um tipo de receptor IIB (ActRIIB), tipo de receptor de proteína morfogenética óssea II (BMPRII), ou factor de crescimento transformante β do receptor de tipo II (TGFβRII). Para tanto PC3-M e células DU-145, endoglina suprime significativamente a invasão de 60% e 50% das células de controlo, respectivamente, e este é revogada pelo siRNA alvejando ActRIIA ou BMPRII mas não ActRIIB ou TGFβRII (Figura 1A). A fim de investigar o mecanismo de ActRIIA e BMPRII em afetar EMSI, estudos focado em células PC3-M CaP humanos. Eles constituem um fenótipo metastático [34] e são conhecidas por expressar a níveis muito baixos de linha de base de endoglina [14].

a) o efeito de tipo II receptores na supressão mediada endoglina de invasão (EMSI). PC3-H (esquerda) ou DU-145 (à direita), as células foram transfectadas transientemente com o vector vazio (Vec) ou com endoglina juntamente com siARN, como indicado. Foram utilizados os seguintes siRNAs: siNeg – non-alvo de controlo negativo, si2A – alvo ActRIIA, si2B – alvos ActRIIB, siBMP – alvos BMPRII, siTGF – alvos TGFβRII. Após 48 horas, a invasão de células foi medida. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes, cada uma em réplicas de 3. *, p £ 0,05 em comparação com Vec /siNeg. Micrografias são imagens representativas de células que invadiram através de Matrigel, foram coradas para βgal, e fotografada (100X). B) ActRIIA e BMPRII siARN é específico. células PC3-M foram transientemente transfectadas com endoglina juntamente com os ARNsi indicados como em (A). Após 48 horas a expressão de ARNm foi avaliada por meio de qRT-PCR, normalizadas para GAPDH e expressos relativamente às células transfectadas siNeg-(normalizado para 1,0). Os dados representam a média ± desvio padrão de uma única experiência, realizada em réplicas de n = 2; resultados semelhantes foram observados durante uma experiência independente (n = 2 repetições). *, P £ 0,05 em comparação com siNeg. C) ActRIIA e BMPRII siARN suprime a proteína alvo. células PC3-M foram transfectadas com ActRIIA-myc (painéis superiores) ou BMPRII-bandeira (painéis inferiores), assim como com os ARNsi indicados, seguido por Western blot das proteínas indicadas. Os dados são de uma experiência representativa (n = 2 experiências separadas). D) O bloqueio ActRIIA ou BMPRII ligação inibe EMSI ligando. células PC3-M foram transientemente transfectadas com vector vazio ou endoglina como acima. Após 2 dias, as células foram pré-tratadas durante 5 horas armadilhas de ligandos constituídos por ActRIIA ou BMPRII domínio extracelular fundidas com a região Fc da imunoglobulina (Fc-Fc ou A2-B2, respectivamente). O tratamento continuou durante a realização posterior de ensaios de invasão celular. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes, cada um em réplicas de N = 3 *, p≤0.05 comparação com Vec /-.

Existe uma estreita homologia entre os receptores da superfamília de TGF-p. Por conseguinte, é particularmente importante para abordar a especificidade siARN, que demonstram na Figura 1B. Utilizando iniciadores de sequência específica para cada receptor, que mostram por qRT-PCR que o receptor específico siARN bate significativamente o receptor alvo por ≥60% em cada caso, sem modulação significativa de receptores não-alvo. A eficácia e a especificidade de ARNsi segmentação ActRIIA e BMPRII foi demonstrado pelo seguinte efeitos ao nível da proteína de medição. Um problema endémico no campo refere-se ao fato de que os anticorpos produzidos contra um determinado subtipo de receptor da superfamília TGF-p tendem a ter níveis relativamente elevados de reactividade cruzada. Nós abordou este por células co-transfecção com qualquer ActRIIA marcado com myc ou BMPRII, juntamente com siRNA para Riis individuais marcado com FLAG, seguido por Western blot específica-tag (Figura 1C). Desta maneira podemos demonstrar a supressão mediada por siRNA específico de receptor de expressão da proteína aos níveis quase indetectáveis ​​para ambos ActRIIA e BMPRII.

ligação de ligandos extracelulares para ActRIIA BMPRII e constitui um determinante principal da sua função de sinalização. Por conseguinte, a hipótese de que se ActRIIA e BMPRII são verdadeiramente importantes reguladores da EMSI, em seguida, a sua modulação do presente processo deverá ser dependente de ligandos cognatos, pelo menos em parte. Determinou-se que este é de facto o caso por células com endoglina, seguido por medição do efeito sobre a invasão transfecção quando ligandos cognatos extracelulares foram bloqueadas de ligação do receptor (Figura 1D). Isto foi realizado por tratamento de células com construções de proteínas recombinantes, o FC-A2 ou B2-Fc, que consiste na ActRIIA ou domínios extracelulares BMPRII, respectivamente, fundido com um domínio constante de imunoglobulina, assim, servir como uma armadilha ligando. Como se pode ver na Figura 1D, o bloqueio da ligação do ligando para qualquer um dos receptores inverte EMSI. Estes estudos de bloqueio de complemento do ligando nossos estudos knockdown. Tomados em conjunto, os nossos resultados implicam ActRIIA e BMPRII como importantes reguladores fisiológicos de EMSI.

ActRIIA e BMPRII têm efeitos opostos sobre Downstream Smad1 Sinalização

Temos anteriormente demonstrado que endoglin aumenta a fosforilação de Smad1, que Smad1 suprime a invasão de células, e que é necessário para Smad1 EMSI [14]. Por isso, avaliou o efeito da ActRIIA e BMPRII sobre a regulamentação da Smad1 fosforilação. Isso foi feito por derrubando ActRIIA ou BMPRII via transfecção de células PC3-M com siRNA, enquanto co-transfecção com vector vazio ou endoglin. A fosforilação de Smad1 foi então avaliada por Western blot (Figura 2A). Independentemente do status endoglin, knockdown de ActRIIA diminui os níveis de fosfo-Smad1. Surpreendentemente, knockdown de BMPRII tem o efeito oposto; aumenta fosfo-Smad1. Tal como acontece com os nossos estudos anteriores [31], a expressão endoglina endógeno em células PC3-M é tão baixa que se aproxima do limite de detecção.

células PC3-M foram transientemente transfectadas com vector vazio ou endoglina e o indicado siRNA como na Figura 1. Dois dias mais tarde as células foram lisadas por Western blot (a) ou um ensaio de luciferase do promotor (B). A) e ActRIIA BMPRII diferencialmente regular a fosforilação da proteína Smad1. Western blot em lisado de células resultante foi realizado para Smad1, fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5), endoglina e GAPDH. Os dados são de uma experiência representativa (N = 4 experiências). B) ActRIIA e BMPRII diferencialmente regular BRE activação

2-luciferase. As células foram adicionalmente co-transf ectadas com BRE

2-luciferase e

Renilla luciferase

construções, e a actividade da luciferase (normalizados para

Renilla

actividade da luciferase) foi medida. Os dados são a média ± DP a partir de um único teste efectuado em repetições de n = 2, realizado três vezes separadas com resultados semelhantes (também N = 2). *, P £ 0,05 entre os grupos indicados. C) BMP7- e estimulou-BMP9 fosforilação Smad1 é diferencialmente regulada por ActRII e BMPRII. As células foram transfectadas tal como acima, privadas de soro, e tratou-se com BMP7 ou BMP9 como indicado. Western blot em lisado de células resultante foi realizado para fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5) e Smad1 total. Os dados são de uma experiência representativa (n = 2 experiências).

Temos demonstrado anteriormente no mesmo sistema que estamos usando atualmente que os principais induziu aumentos em estado de expressão endoglin induzir aumentos tanto Smad1 fosforilação bem como na actividade transcricional Smad1, tal como medido pelo ensaio de repórter de luciferase utilizando o BRE Smad1-responsivo repórter construto

2-luciferase [14]. É importante salientar, neste mesmo sistema, temos também demonstrou como várias perturbações diferentes têm efeitos discordantes sobre a fosforilação Smad1 e sua atividade transcricional funcional. No entanto, em todos os casos, as alterações na função da transcrição Smad1 reflectida concordantes efeitos sobre a função biológica, tal como avaliado por estudos de knockdown Smad1 associados, bem como ensaios de invasão [14], [32]. Embora o mecanismo subjacente a este fenómeno não é completamente claro, parece que de modo a reflectir o facto de as células da próstata humanos contêm níveis muito elevados de fosfatase ácida, e que durante a lise da célula que tem efeitos específicos de proteínas que não podem ser adequadamente trazido de verificação ainda com alta níveis de inibidores de fosfatase [43]. Consideramos, portanto, a avaliação da função transcricional Smad1 ser o ensaio informativo. Como tal, fomos para avaliar o efeito da ActRIIA e BMPRII knockdown no BRE activação

2-luciferase (Figura 2B). Mais uma vez mostramos que, independentemente do seu estatuto endoglin, knockdown de ActRIIA diminui significativamente a função Smad1 enquanto knockdown de BMPRII aumenta significativamente. Estes achados são consistentes com os dados de fosforilação Smad1 na Figura 2A, e demonstrar que as alterações na fosforilação Smad1 está associado a alteração da transcrição mediada por Smad. No entanto, eles também demonstram que os efeitos induzidos BMPRII sobre a função de transcrição Smad1 não são congruentes com efeito de BMPRII sobre EMSI.

Para investigar BMPRII mais, nós examinamos os efeitos sobre a sinalização em condições de proteína morfogénica do osso (BMP) estimulação ligante . ActRIIA e BMPRII foram derrubados como na Figura 2A, as células foram privadas de soro, simulada ou com BMP7 ou BMP9, e Smad1 /5 fosforilação avaliada por Western blot (Figura 2C). Com qualquer uma das BMP7 ou BMP9, knockdown de ActRIIA atenua estimulada pelo ligando Smad1 /5 fosforilação, enquanto knockdown de BMPRII aumenta-lo. Ao demonstrar um perfil de resposta de sinalização semelhante sob condições de estimulação do ligando BMP em comparação com a de condições de cultura padrão, é ainda apoiada a importância de BMP. Estes achados corroboram na Figura 1D, o que demonstra que o ligando BMP é necessário para EMSI.

Nem a

sistema promotor 2-luciferase BRE nem os anticorpos fosfo-Smad disponíveis atualmente são capazes de distinguir completamente entre Smad1 , Smad5 e Smad8 isoformas. Nós, portanto, avaliada a medida em que essas outras isoformas Smad poderia explicar os efeitos observados atualmente. Especificamente, dado que BMPRII knockdown inesperadamente levou para o que parecia ser aumentada de sinalização Smad1, queríamos examinar a possibilidade de que BMPRII knockdown foi aumentando sinalização Smad5 ou Smad8, potencialmente mascarando uma diminuição funcionalmente importante na sinalização Smad1. Utilizando a análise de qRT-PCR específica para o gene, que demonstram que a primeira siRNA para as isoformas Smad individuais é altamente específica e eficaz, silenciando significativamente a isoforma alvo de ≥90% em cada caso, não tendo qualquer efeito significativo sobre as isoformas não-alvo (figura 3A). A seguir, procurou determinar quais Smads foram ativados durante a superexpressão endoglin. Knockdown de Smad1 resulta na perda quase total de sinal específico de um anticorpo que reconhece a fosfo-Smad1, 5, e 8 (Figura 3B). Verifica-se que a expressão da proteína Smad1 é eficazmente suprimida por siRNA para Smad1, mas não é suprimida por siRNA alvejando Smad5 ou Smad8. Usando um anticorpo que reconhece tanto fosforilada Smad1 e Smad5, demonstramos que Smad5 também é fosforilado na presença de endoglina. Depois, fomos para demonstrar que knockdown de Smad1 provoca uma redução de 90% do aumento induzido por endoglin no BRE

2-luciferase (Figura 3C). Em contraste, o aumento induzido por endoglin no BRE

2-luciferase atividade é diminuída em apenas 30%, após Smad5 knockdown, e não a todos por Smad8 knockdown. Finalmente, como mostramos na Figura 2 que BMPRII knockdown aumenta a ativação Smad1, examinamos o efeito da supressão isoforma Smad em face da BMPRII knockdown em células repletas endoglina (Figura 3D). Semelhantes aos encontrados na Figura 3C, Smad1 knockdown revoga significativamente o aumento da BRE actividade

2-luciferase alcançado por BMPRII knockdown, enquanto Smad5 ou Smad8 knockdown não têm nenhum efeito significativo. Todos juntos os resultados acima demonstram que ActRIIA aumenta a fosforilação e função Smad1, enquanto BMPRII diminui.