Abstract

Os microRNAs são uma classe de ocorrência natural pequenos RNAs não-codificantes que visam mRNAs codificadores de proteínas ao nível pós-transcricional e regular os padrões complexos de expressão do gene. Os nossos estudos anteriores demonstraram que no cancro da próstata humana miARN

miR-125b

é altamente expressa, que conduz a uma regulação negativa de alguns genes supressores de tumores. Neste estudo, nós estendemos ainda mais nossos estudos mostrando que

miR-125b

reprime o produto de proteína do INK4a /lócus ARF, p14

ARF, em duas linhas celulares de cancro da próstata, LNCaP (wild-tipo p53) e 22R

v

1 (tanto de tipo selvagem e o mutante p53), bem como no modelo de xenoenxerto de cancro da próstata PC-346C que lentivirally overexpressed

miR-125b. Os resultados indicam que

miR-125b

modula a rede p53 por dificultar a regulação das proteínas MDM2, afectando assim p53 e sua genes alvo p21 e Puma a um grau suficiente para inibir a apoptose. Por outro lado, o tratamento de células cancerosas da próstata com um inibidor da

miR-125b

(anti-

miR-125b

) resultou em aumento da expressão de p14

ARF, diminuição do nível das proteínas MDM2, e indução de apoptose. Além disso, a sobre-expressão de

miR-125b

em células PC3 deficientes em p53 induzida a sub-regulação de p14

ARF, o que leva a um aumento da proliferação celular por meio de um modo independente de p53. Assim, podemos concluir que

miR-125b

atua como um oncogene que regula p14

sinalização ARF /Mdm2, estimulando a proliferação de células cancerosas da próstata através de uma função dependente de p53 ou independente de p53. Isso reforça a nossa convicção de que

miR-125b

tem potencial como um alvo terapêutico para o tratamento de pacientes com câncer de próstata metastático

Citation:. Amir S, Ma AH, Shi XB, Xue L, Kung HJ, deVere Branco RW (2013) Oncomir

miR-125b

Suprime p14

ARF para Modular p53-dependente e p53-Independent apoptose em câncer de próstata. PLoS ONE 8 (4): e61064. doi: 10.1371 /journal.pone.0061064

editor: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Outubro, 2012; Aceito: 06 de março de 2013; Publicação: 09 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Amir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por CA136597 concessão NCI eo Departamento de Defesa PC080488 concessão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro da próstata metastático (PAC), progredindo para Cap resistente à castração (CRPC), representa uma grande ameaça para a vida dos homens americanos, resultando em estimativa de 28,170 mortes por esta doença em 2012 [1]. Os pacientes com CaP metastático são habitualmente tratados com terapia de privação de andrógeno (ADT). Infelizmente, a falha de ADT inevitavelmente ocorre e tumor do paciente torna-se CRPC. Sabe-se que durante a progressão CRPC células CaP utilizar uma variedade de receptor de androgénio (AR) e dependente de vias independentes para sobreviver e crescer num meio empobrecido-andrógeno [2]. Apesar de várias tentativas têm sido feitas para caracterizar a assinatura molecular de CRPC, os mecanismos precisos que levam ao CRPC não são completamente compreendidos. Nos últimos anos, a descoberta de microRNAs (miARNs) revelou uma nova camada de complexidade que regula os mecanismos envolvidos na regulação da CRPC [3], [4].

MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que funcionam como reguladores específicos de sequência de expressão do gene através da repressão translacional e /ou clivagem transcrição [5]. Estudos têm mostrado que miARNs desempenham papéis importantes em processos celulares da diferenciação, proliferação, apoptose e homeostase metabólica [6]. Além disso, miARN pode funcionar como supressores de tumores ou oncogenes, dependendo se eles têm como alvo especificamente oncogenes ou genes supressores de tumores [7]. A este respeito, supressores tumorais miARNs são geralmente sob-expresso, enquanto que miARNs oncogénicos tendem a ser sobre-expresso em cancro [8]. Estudos têm demonstrado que

miR-125b

é oncogênico. Superexpressão de

miR-125b

foi relatada em câncer de cólon [9], o cancro da bexiga [10], câncer de ovário [11] e leucemia [12]. Nós relatado anteriormente que os tumores expressam CaP clínicos aumentou os níveis de

miR-125b

em comparação com tecidos benignos [13]. Além disso, vários estudos têm indicado que

miR-125b

é altamente expresso no PAC, particularmente em tumores metastáticos CaP e invasivos [14], [15]. Recentemente, nós investigamos a função do

miR-125b e observou que a sobre-expressão de

miR-125b

promoveu o crescimento do tumor xenoenxerto em ratos intactos e castrados [16]. Além disso, foi demonstrado que

miR-125b

visa diretamente vários supressor tumoral e genes pró-apoptóticos incluindo p53, BAK1 e Puma [13], [16].

A nível celular ea atividade da p53 é mantida por um circuito complexo composto de p14

ARF /Mdm2 /p53 [17]. p14

ARF foi verificado para ser um supressor tumoral potente ambos

in vitro

e

in vivo

[18] e foi proposto para ser o membro mais importante deste circuito de vigilância. Expressão de p14

IRA é induzida em resposta a oncogenes activados, tais como Ras [19], c-Myc [20], Abl [21] e E2F-1 [22], bem como durante a senescência replicativa [23]. p14

IRA medeia o sequestro e a subsequente degradação do Mdm2 p53 do antagonista por meio da via da ubiquitina /proteassoma, o que resulta na estabilização (aumento da meia-vida) do p53 [17] e a consequente activação dos seus genes alvo a jusante, tais como p21 (dependente de ciclina inibidor de cinase 1A), Puma (mediador p53-regulada positivamente de apoptose), e Bax (associada-BCL2 proteína X) [24], [25]. Uma vez que estas moléculas são componentes-chave na rede de p53, a modulação de sua expressão pode perturbar o equilíbrio normal entre a apoptose e proliferação celular. Esta observação é confirmada por nossos estudos que mostram que a inativação ou para baixo-regulação de p53, Puma e BAK1 pelo

miR-125b

está associada com CRPC [13], [16].

Para melhor elucidar o papel de

miR-125b

no desenvolvimento de CRPC e os seus mecanismos moleculares subjacentes, neste estudo nós investigamos o envolvimento de

miR-125b

na modulação da rede de p53 por segmentação p14

ARF, que é apoiado pela nossa identificação de um potencial

miR-125b local

ligação na 3’UTR de

p14

ARF

gene. Esperamos que os nossos estudos para fornecer uma nova visão sobre os mecanismos moleculares relacionados à tumorigênese e crescimento resistente a castração da PAC e contribuir para facilitar a aplicação da

miR-125b como um alvo para o tratamento da PAC.

materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

Para a análise de transferência de Western, o anti-p14

ARF (sc-8340), anti-Mdm2 (SC-965), foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anti-BAK1 (3814), anti-Mcl-1 (4572), anti-Bcl-X

L, anti-caspase 3 (9662), anti-SMAC (2954) e anti-p21 (DCS60) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-Puma (PC686), anti-p53 (OP43) a partir de Calbiochem (Billerica, MA); -Anti-actina β (clone AC-15) a partir de Sigma (St. Louis, MO). Sintética

miR-125b

mímica (miR-125bm), controle negativo miRNA (miR-NC), anti-

miR-125b Comprar e controle negativo anti-miRNA (anti-miR-NC) bem como o vector PMIR-RELATÓRIO luciferase foram adquiridos da Ambion (Grand Island, NY). Ambos

p14ARF

siRNA (sip14) e

BAK1

siRNA (Sibak) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

linhas de células e transfecção

CaP humano linhas celulares PC3, 22R

v

1 e LNCaP foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas as linhas celulares foram rotineiramente mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% contendo antibióticos e multivitaminas. Para a transfecção transiente, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços um dia antes da transfecção e mantidas em meio contendo soro, sem antibióticos. No dia seguinte, as células foram transfectadas com ARNsi de miARN ou utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY) de acordo com as instruções do fabricante.

análise Western blot

As células foram cultivadas até 70-80 % de confluência e lisadas usando o tampão de lise celular (Cell Signaling Technology) suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonilo (1 mmol /L). Após 20 minutos de incubação no gelo, os lisados ​​foram centrifugados a 13.000 rpm durante 20 min e proteínas as concentrações no sobrenadante foram determinadas utilizando o kit BCA (Pierce, Rockford, IL). A proteína total (50 ug por amostra) em 3 tampão de amostra × proteína [50 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 2% de SDS, 10% glicerol, 0,25% β-mercaptoetanol, azul de bromofenol (1 mg /mL)] foram separadas em SDS-poliacrilamida gel (Bio-Rad, Hercules, CA), e, em seguida, transferidas para Immobilon PVDF membrana (Millipore, Billerica, MA). Após bloqueio com 5% de leite seco não gordo, em solução salina tamponada com Tris /0,05% de Tween 20 (TBST), a membrana foi incubada com um anticorpo específico primário, seguido pelo anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. As bandas de proteína foram exibidos por quimioluminescência aumentada. O nível de expressão de proteína foi medida por análise densitométrica quantitativa.

luciferase ensaio

O humano

p14

ARF

seqüência 3′-UTR contendo a putativa

miR-125b

local de ligação foi amplificado por PCR a partir de cDNA de LNCaP e clonados no vector de luciferase PMIR-RELATÓRIO a jusante do gene da luciferase. O

p14

ARF

3′-UTR falta neste site

ligação

miR-125b foi utilizado como controle. Os produtos de PCR clonados no plasmídeo foram verificadas por sequenciação de ADN. Para o ensaio de luciferase, as células (4 × 10

4 por poço) foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas durante 24 horas. As células foram depois co-transfectadas com plasmídeos repórter e 100 nM sintético miR-125bm ou miR-NC. O plasmídeo de luciferase de Renilla pRL-SV40 (Promega, Madison, WI) foi utilizado como um controlo interno. Dois dias mais tarde, as células foram colhidas e lisadas com tampão de lise passiva (Promega). A actividade de luciferase foi medida utilizando um ensaio de repórter duplo de luciferase (Promega). A actividade da luciferase foi normalizada pela atividade luciferase Renilla.

Co-imunoprecipitação ensaio

A interação proteína p14 entre

ARF e Mdm2 foi detectada por ensaio de co-imunoprecipitação. Os lisados ​​de proteína total de miR-125bm- ou miR-NC-transfectadas 22R

células

v 1 foram preparados em tampão de lise celular. Proteína (1,0 mg /0,5 ml) foi pré-aclarado por mistura com 20 ul de esferas de uma proteína e o sobrenadante foi imunoprecipitada a 4 ° C durante a noite com um anticorpo de coelho anti-p14

IRA anticorpo policlonal ou IgG normal de coelho (Cell Signaling Tecnologia). As proteínas precipitadas foram fraccionados num gel de SDS-PAGE a 12%, seguido por detecção de transferência de Western de proteína Mdm2 utilizando o anticorpo anti-Mdm2.

ensaio TUNEL

ensaio TUNEL foi realizado utilizando uma

in situ

kit de detecção de morte celular (Roche, Indianapolis, IN) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, o p53-positiva 22R

v

1 ou células PC3 p53-null (1 × 10

5 /po) foram semeadas em poços individuais de lâminas de câmara 4 poços. Após 24 horas, as células foram transfectadas com 50 nM de

miR-125b

, 50 nM anti-

miR-125b e 100 nM sip14, sozinho ou em combinações diferentes. As células não tratadas e irradiadas foram utilizadas como controlos negativos e positivos. O meio foi removido 72 horas após a transfecção e as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em solução de fixação (4% de paraformaldeído em PBS, pH 7,4) durante 1 h à TA. Após a fixação, as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas em solução de permeabilização (0,1% de Triton X-100) durante 2 minutos em gelo. 50 ul da mistura reaccional de TÚNEL (50 ul de solução de enzima + 450 ul de solução de marca) foi adicionado a cada lâmina. Para o controlo negativo, foi adicionado a 50 ul da solução de marca. DAPI foi utilizado como um corante de contraste nuclear. As lâminas foram incubadas em atmosfera húmida durante 60 minutos a 37 ° C no escuro. A microscopia de fluorescência foi realizada para visualizar as células e adquirir imagens digitais utilizando um comprimento de onda de excitação na gama de 450-500 nm, e detectado na gama de 515-565 nm.

WST-1 de ensaio

As células (4,5 x 10

3 /poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços em meio de RPM1 contendo 10% de FBS. Depois de ser cultivadas durante 24 horas, as células foram transfectadas com 50 nM

miR-125b

ou anti-

miR-125b. Depois de cinco horas, as células foram tratadas com meio fresco. -Tetrazólio baseado ensaio de proliferação celular (WST-1, Promega) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante.

Colónia ensaio

22R

v

1 (3 × 10

3 /poço) e LNCaP (4 × 10

3 /poço) foram plaqueadas separadamente em placas de seis cavidades e foram transfectadas com

miR-125b ou

anti-

miR-125b

a uma concentração de 100 nm, utilizando lipofectamina 2000. depois de duas semanas, as colónias de células foram contadas após coloração em 20% de metanol e cristal violeta.

Resultados

miR-125b

down-regula p14

ARF nas células CaP

estudos anteriores demonstraram que o gene p14 supressor tumoral

ARF é significativamente regulada para baixo em tecidos PAC [26]; no entanto, como p14

ARF é regulada permaneceu mal compreendida. Usando o algoritmo TargetScan, um potencial

miR-125b

ligação local foi identificado no 3-‘UTR de

p14

ARF

mRNA. Nós investigamos, assim, o efeito de

miR-125b sobre a regulamentação da p14

ARF nas células PAC. Para fazer isso, LNCaP e 22R

v

1 células foram transfectadas com miR-125bm sintética para elevar o

miR-125b

abundância celular, ou com anti-

miR-125b

reprimir

miR-125b

atividade. Como mostrado por Western blot e densitométrica análises quantitativas, em comparação com o tratamento de miR-NC, miR-125bm redução induzida de p14

expressão IRA por 80% em células LNCaP (Figura 1A, painel superior) e de 60% em 22R

v

1 (Figura 1A, o painel inferior). Por outro lado, anti-

miR-125b

aumentou a

nível ARF p14 em 40% em LNCaP (Figura 1A, painel superior) e 30% em 22R

v

1 (Figura 1A, painel inferior) em comparação com anti-miR-NC. Nosso estudo anterior demonstrou que o andrógeno-se regula

miR-125b

em células PAC [13]. Assim, as células LNCaP e 22R

v

1 foram tratados com 5,0 nM de R1881 andrógeno eo nível de expressão da p14

foi determinada ARF. Verificou-se que o tratamento R1881 induzida uma redução de 80% do p14

ARF em LNCaP e 20% de redução no 22R

v

1 (Figuras 1A). Também examinamos o nível de p14

ARF em um

miR-125b

PC-346C tumor -overexpressed rato xenotransplante [16], e descobriram que o nível de p14

proteína ARF foi reduzido em 60 % no

miR-125b

tumor -overexpressed comparação com miR-NC tumor controle (Figura 1B). Para determinar se o

miR-125b local putativo

obrigatório em 3′-UTR de p14

ARF mRNA é responsável pela regulação da p14

ARF pelo

miR-125b , vectores repórter da luciferase contendo o fragmento 3′-UTR de

p14

IRA

genes foram co-transfectadas com o miR-125bm em células LNCaP. Como mostrado na Figura 1C, co-transf ecção resultou numa redução de aproximadamente 50% da actividade da enzima em células LNCaP. Nós também realizada de ensaio de luciferase em 22R

v 1

células e um resultado semelhante foi observada (dados não mostrados). Tomados em conjunto, os resultados apresentados na Figura 1 validar a regulação de p14

ARF pelo

miR-125b

em células PAC.

A

) Análise de Western blot de níveis de p14 expressão

ARF em LNCaP (

topo

) e as células 22Rv1 (

parte inferior

). Células cultivadas em 10% de meio de FBS foram transfectadas com 50 nM de miR-125bm ou anti-

miR-125b

(anti-125b) durante 72 horas ou tratadas com 5,0 nM de R1881 androgénio durante 48 horas. Em seguida, 50 ug de proteína por amostra foi analisada. Ambos controlo miR-negativa (miR-NC) e controlo negativo anti-miR (anti-NC) foram utilizados como controlos, e β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

B

) Análise de Western blot dos níveis de p14 expressão

ARF, mdm2 e p53 em lenti-

miR-125b

tumor -overexpressed xenotransplante PC-346C. Tanto o xenoenxerto não tratado (untreat.) E infectadas com o vector de controlo lenti-miARN PC-346C xenoenxerto (vector) foram utilizados como controlos. Em ambos

A

e

B

, os números sob os géis são as mudanças médias vezes de p14

proteína ARF de três géis independentes em relação aos controles correspondentes. Dobram alterações foram calculadas pela digitalização dos p14

bandas IRA ea normalização para as bandas de beta-actina.

C

) ensaio de luciferase de

miR-125b

ligação ao 3′-UTR de

p14

ARF

mRNA em células LNCaP. O ensaio foi repetido três vezes em cada ensaio a ser realizado em três poços e foram obtidos resultados semelhantes de cada vez. Os resultados representativos são mostrados como média ± SD (n = 3).

miR-125b

-p14

ARFsignaling regula a

rede p53

estudos têm demonstrado que p14

ARF acelera a degradação Mdm2, resultando em p53-regulação [27]. Nós, portanto, perguntou: faz a regulação negativa da p14

ARF pelo

miR-125b

afetar a expressão das proteínas MDM2 e p53 em células PAC? Para abordar esta questão, as células LNCaP e 22R

v

1 foram tratados com miR-125bm e os níveis de Mdm2 e p53 foram então examinados. Comparado com o miR-NC, o tratamento de células LNCaP com

miR-125b

induziu um aumento dramático na expressão de MDM2 e uma redução significativa do nível de p53 (Figura 2A, painel superior). Da mesma forma, em 22R

v células

1,

miR-125b

tratamento também aumentou a expressão de MDM2 e redução do nível de p53 (Figura 2A, painel inferior). Como esperado, o miR-125bm mediada por sub-regulação de p53 induzida significativa redução de dois efectores p53, p21 e directos puma. Da mesma forma, no

miR-125b

tumor -overexpressed xenotransplante PC-346C, expressão de MDM2 foi aumentado três vezes e proteína p53 foi regulada para baixo em 83% quando comparado com o controle de vetores (Figura 1B). Para confirmar os resultados a jusante da inibição da p14

ARF, usamos

p14

ARF

siRNA (sip14) para silenciar p14

ARF em LNCaP e 22R

v

1 células. Como mostrado por imunotransferência, o tratamento sip14 diminuíram significativamente a expressão de p14

IRA proteína e, subsequentemente, regulada positivamente nível Mdm2 e regulados negativamente a expressão de p53 (Figura 2B). Desde p14

ARF se liga diretamente para o C-terminal das proteínas MDM2, que examinou o efeito de

miR-125b sobre a interação da proteína p14 entre

ARF e Mdm2 por co-imunoprecipitação em 22R

células v

1 PAC. Observou-se que Mdm2 pode ser detectado a partir de anti-p14

proteínas precipitadas com anticorpo ARF, a partir de proteínas não-acoplado IgG de controlo, indicando que p14 endógena

IRA é capaz de formar um complexo com Mdm2. O tratamento com

miR-125b

p14 regulada

ARFprotein, resultando em uma redução de Mdm2 imunoprecipitado (Figura 2C). Tomados em conjunto, os dados apresentados na Figura 2 fornecem evidências de que

miR-125b

regula p14

ARF /via de sinalização Mdm2 /p53.

A

) análise de Western blot das proteínas MDM2 e p53 em LNCaP tratados com miR-125bm (

topo

) e 22R

v

1 células (

parte inferior

). As células foram transfectadas com 50 nM de miR-125bm ou miR-controlo negativo (miR-NC) durante 72 horas. Quantidades iguais de proteína (50 ug) foram utilizados para detectar os níveis de proteínas MDM2, p53, p21 e Puma expressão.

B

) Análise de Western blot de p14

ARF, Mdm2 e p53 em

p14

ARF

siRNA (sip14) tenha sido tratada com LNCaP (

topo

) e 22R

v

1 células (

parte inferior

). As células foram tratadas com sip14 e os níveis celulares de p14 foram analisados ​​

ARF, o p53 e Mdm2. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

C

) Análise de Co-imunoprecipitação de proteína interação entre p14

ARF e Mdm2 em 22R

v

células 1. As células foram transfectadas com o miR-125bm e 1,0 mg de proteína foi imunoprecipitada com anticorpos anti-p14

IRA anticorpo ou o IgG de coelho. Os imunocomplexos resultantes foram usados ​​para detectar o nível de Mdm2 por análise de transferência de Western utilizando anticorpo anti-Mdm2. Entrada: 50 ug de proteína de lisado de células totais. IP: imunoprecipitação. IB:. Immunoblotting

miR-125b

estimula a proliferação de células CaP

Depois de ter decidido a regulação da p14

via ARF /Mdm2 /sinalização de p53 por

miR-125b

, nós próxima examinou o efeito de regulação da p14

ARF pelo

miR-125b

sobre a proliferação celular PAC. Para fazer isso, ambas as células LNCaP e 22R

v 1

células foram transfectadas com o miR-125bm e proliferação de células sintético foi determinada por ensaio de WST-1. Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, quando comparado com o tratamento de miR-NC, transfecção com miR-125bm resultou num aumento de 1,5 vezes na proliferação de células em ambas as linhas celulares testadas. Além disso, foram realizados ensaios de formação de clones. Similar aos WST-1 resultados,

miR-125b

estimulou um aumento de 1,0 vezes na sobrevivência clonogênica de células LNCaP e melhoria de 2,5 vezes na 22R

v

células 1, e da adição de anti-

miR-125b

causou uma redução dramática no número de colónias em comparação com as células não tratadas e anti-miR-NC (dados não mostrados). Estes dados suportam que a regulação baixa de p14

ARF pelo

miR-125b

facilita o crescimento de células PAC.

As células foram transfectadas com 50 nM de miR-125bm ou 50 nM de controle de miRNA negativo (miR-NC) durante 5 dias. A proliferação celular foi medida por ensaio de WST-1.

p14

ARF

siRNA (sip14) foi usado como um controle. Os resultados são expressos como a proliferação em relação à de células tratadas com o miR-NC, e apresentados como média ± DP (n = 4).

Anti

miR-125b

Induzida apoptose em células CaP que expressam p53 funcional

Desde

miR-125b

regula p14

ARF /Mdm2 sinalização e, posteriormente, afeta a rede de p53, que avaliou o efeito da regulação negativa da p14

ARF pelo

miR-125b

sobre a apoptose em células CaP p53 positivo. Em primeiro lugar, testou-se a libertação de SMAC mitocondrial (segundo activador derivado de mitocôndrias de caspase) e caspase 3 activado (CAS-3) em LNCaP e 22R

linhas v

1 de células que expressam p53 funcional. Quando comparado ao tratamento miR-NC, miR-125bm causou redução de 10% da SMAC e redução de 40% das activado Cas-3 em células LNCaP, ea redução foi de 20% e 30% em 22R

v

células 1 , respectivamente (Figura 4A). Estas linhas de células foram também tratadas com anti-

miR-125b

. Comparado com o tratamento anti-miR-NC, a regulação negativa do

miR-125b

actividade induzida pelo aumento de aproximadamente um vezes na SMAC e activado CAS-3 (Figura 4A). Desde anti-

miR-125b

regula positivamente SMAC e caspase ativada 3, que, assim, analisados ​​anti-

miR-125b

induzida por morte celular por apoptose, utilizando um ensaio de TUNEL. 22R

células v

1 foram transfectadas com miR-125bm ou anti-

miR-125b. Nenhuma morte celular por apoptose foi observada em 22R

células v

1 tratados-miR-125bm. Em contraste, o tratamento de 22R

v 1

células com anti-

miR-125b causou 63% de células a sofrer apoptose (Figura 4B). Para validar que

miR-125b

modula a apoptose dependente de p53 através de p14

ARF, 22R

células v

1 foram tratados com anti-

miR-125b

, seguido pela

p14

ARF

silenciamento. Verificou-se que antisense para

p14

ARF

(sip14) diminuiu drasticamente morte apoptótica em

miR-125b

-inactivated 22R

v

1 células (Figura 4C) . Como esperado,

p14

IRA

silenciamento proliferação estimulada destas células 22R

v

1 (dados não mostrados). Além disso, os níveis de vários factores pró-apoptóticos de expressão foram avaliados por análise de Western blot. Na verdade, o tratamento com anti-

miR-125b

induzida uma regulação positiva de p14

proteína ARF em 22R

v

células 1, enquanto a adição de sip14 resultou em downregulation óbvia de p14

ARF (60%), p53 (30%) e BAK1 (70%), em comparação com a precipitação siARN tratamento (Figura 4D). Estes dados sugerem fortemente que

miR-125b

/p14

ARF alvos de sinalização da rede p53, regulação da proliferação dependente de p53 e apoptose em células PAC.

A

) Detecção de SMAC e caspase ativada 3 (Cas-3) em LNCaP (

esquerdo

) e 22R

v

1 (

direito

) células. As células foram transfectadas com 50 nM de miR-125bm ou 50 nM anti-

miR-125b

(anti-125b), durante 5 dias, e os níveis de SMAC e CAS-3 foram medidos por análise de Western blot. p-actina foi utilizado como controlo de carga. Os números sob os géis são as variações médias de dobragem de SMAC e CAS-3 a partir de três géis independentes em relação aos controlos correspondentes.

B

) Detecção de anti-

miR-125b

apoptose induzida em 22R

v

células 1. As células foram transfectadas utilizando 50 nM anti-

miR-125b durante 72 horas e morte celular por apoptose foi detectada utilizando um ensaio de TUNEL. A fluorescência nuclear verde indica a clivagem apoptótica de DNA nuclear (

esquerda). Para a quantificação da morte celular por apoptose, 400 células foram contadas e a apoptose é expresso como% de apoptose (células apoptóticas /400 × 100%). A análise quantitativa foi realizada três vezes e resultado foi expresso como média ± SE (n = 3) (

direito

). As células tratadas com irradiação (IR, 6 Gy) foram usados ​​como um controlo positivo.

C

) TUNEL da morte apoptótica de 22R

v

1 células que foram tratados com anti-

miR-125b

seguido de

p14

ARF

anti-sentido (sip14). O resultado foi expresso como média ± EP (n = 3).

D

) análises de Western blot de p14

ARF, os níveis BAK1 p53 e 22R

v 1 células

.

Esquerda

: 22R

células v

1 foram transfectadas com anti-

miR-125

;

direito

: anti-

miR-125

-transfected 22R

v

células 1 foram tratados com sip14. Ambos os anti-miR-NC (anti-NC) e mexidos siRNA foram utilizados como controle.

miR-125b

/p14

sinalização ARF medeia a inibição do crescimento independente de p53

nas experiências anteriores, nós validado que

miR-125b

/p14

sinalização ARF está envolvida nos mecanismos dependentes de p53 em células PAC. No entanto, os estudos demonstraram que a inactivação da função de p53 ocorre numa porção de pacientes com CaP metastático [28], [29].

miR-125b

/p14

ARF sinalização regular o crescimento celular e apoptose nestas tampas de p53 deficiente? Nós usamos células PC3 CaP p53 para resolver este problema. Foi examinada a influência da alteração

miR-125b

atividade sobre os níveis de p14

proteínas IRA e Mdm2 expressão. Semelhante ao de LNCaP p53-funcional e 22R

células v

1, miR-125bm transfecção diminuição da expressão da p14

ARF em 36% e aumentou Mdm2 em 43% em células PC3, enquanto anti-

miR-125b

induzir uma regulação positiva óbvia de p14

ARF e um ligeiro repressão das proteínas MDM2 (Figura 5A). Estamos próximos testaram se

miR-125b

afeta a proliferação e apoptose das células PC3. Para este fim, as células PC3 foram tratadas com anti-

miR-125b

e células apoptóticas foi detectada com o ensaio TUNEL. Verificou-se que o tratamento com anti-

miR-125b

causou 50% destas células a sofrer apoptose (Figura 5B). Uma vez que foi relatado BAK1 para mediar p14

apoptose induzida por IRA em células deficientes em p53 [30], avaliou-se o efeito de

BAK1

silenciamento sobre a proliferação de células PC3 miR-125bm-transfectadas. Verificou-se que o miR-125bm induziu um aumento de 1,6 vezes na sobrevivência destas células PC3 (figura 5C), suportando a observação prévia de que p14

sinalização IRA /Mdm2 contribui para um mecanismo independente de p53 [31]. Para confirmar a regulação de apoptose independente de p53 pela

miR-125b

/p14

ARF sinalização,

miR-125b

atividade foi suprimida com anti-

miR-125b

e

p14

ARF

foi silenciado por RNAi. Observou-se que

p14

ARF

silenciamento diminuiu significativamente a morte apoptótica de

miR-125b

células PC3 -inactivated (Figura 5D), e também estimulou a sua proliferação (dados não mostrados). Além disso, os níveis de expressão de p14

ARF e BAK1 foram analisados. Verificou-se que

miR-125b

inactivação induzida uma regulação positiva de p14

ARF, enquanto

p14

ARF

silenciamento reverteu a regulação positiva de p14

ARF (60%) e também uma regulação negativa induzida de BAK1 (Figura 5E). Um estudo anterior relatou que tanto Bcl-X

L e Mcl-1 mediato p14

ARF-induzida apoptose independente de p53. Estes dois factores anti-apoptóticos foram assim analisados. Nós não observamos a sua alteração em

miR-125b

-inactivated,

p14

ARF

-silenced células PC3 (Figura 5D). Tomados em conjunto, estes dados mostram que

miR-125b

/p14

sinalização ARF é capaz de regular o crescimento e apoptose em células CaP p53 deficiente.

A

) detecção de p14 níveis

ARF e Mdm2 em células PC3 p53. As células foram transfectadas com 50 nM de miR-125bm ou anti-

miR-125b durante 72 horas. Os níveis de ambas p14

ARF e Mdm2 de expressão foram analisados ​​por ensaio de mancha de Western. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

B

) Detecção de anti-

miR-125b

apoptose induzida em células PC3. As células foram transfectadas utilizando 50 nM anti-

miR-125b durante 72 horas e morte celular por apoptose foi detectada utilizando um ensaio de TUNEL. A fluorescência nuclear verde indica a clivagem apoptótica de DNA nuclear (

esquerda). Para a quantificação da morte celular por apoptose, 400 células foram contadas e a apoptose é expresso como% de apoptose (células apoptóticas /400 × 100%). A análise quantitativa foi realizada três vezes e resultado foi expresso como média ± SE (n = 3) (

direito

). As células tratadas com irradiação (IR, 6 Gy) foram usados ​​como um controlo positivo.

C

)

miR-125b

promove o crescimento de,

BAK1

células PC3 -silenced p53. As células foram tratadas com 50 nM de miR-125m durante 5 dias e a proliferação celular foi medida utilizando o ensaio de WST-1. Os resultados são expressos como a inibição do crescimento em relação à de miR-NC (média ± DP, n = 4). Detalhe: expressão BAK1 em

BAK1

células PC3 -silenced.

D

) TUNEL da morte apoptótica de células PC3 que foram tratados com anti-

miR-125b

seguido de

p14

ARF

antisense (sip14). O resultado foi expresso como média ± EP (n = 3).

E

) análises de Western blot de p14

níveis IRA e BAK1 em células PC3.

Principais: células PC3 foram transfectadas com anti-

miR-125

;

parte inferior

: anti-

miR-125

células PC3 -transfected foram tratados com sip14. Ambos os anti-miR-NC (anti-NC) e mexidos siRNA foram utilizados como controle.

Discussão

As observações recentes de expressão miRNA aberrante em vários cancros humanos têm destacado a importância de miARNs em muitos processos biológicos [5].

miR-125b

é um miRNA amplamente conservada e foi encontrado para ser elevado em diversos tipos de cânceres, incluindo PAC [14], [15]. Nós relatado anteriormente que CAPS clínicos com altas pontuações Gleason altamente expresso

miR-125b [13], e que

miR-125b

visa diretamente p53, Puma e BAK1, mostrando um efeito anti-apoptótica na presença e na ausência de androgénios [16].