Abstract

Fundo

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a causa mais comum de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. O desenvolvimento de agentes terapêuticos mais eficazes NSCLC exigirá a elucidação das bases genéticas e bioquímicas para esta doença. células-tronco broncoalveolar (BASCs) são uma população putativo de células-tronco de câncer em modelos de rato oncogénico

K-ras

adenocarcinoma pulmonar induzida, um subtipo histológico do NSCLC. Os sinais ativados por K-ras oncogénico que medeiam expansão BASC não foram totalmente definidos.

Metodologia /Principais Achados

Nós usamos abordagens genéticas e farmacológicas para modular a actividade de fosfatidilinositol 3-quinase ( PI3K), um mediador chave da oncogênicos

K-ras,

em dois modelos genéticos rato de adenocarcinoma de pulmão. Oncogénica

K-ras

induzida por acumulação e o crescimento do tumor BASC foram bloqueados por tratamento com um inibidor de molécula pequena de PI3K e aumentada por inactivação de

fosfatase e tensina homólogo eliminado do cromossoma 10

, um regulador negativo de PI3K

Conclusões /Significado

Nós concluímos que PI3K é um regulador crítico da expansão BASC, apoiando as estratégias de tratamento para atingir PI3K em pacientes com NSCLC

Citation:.. Yang Y , Iwanaga K, Raso MG, Wislez H, Hanna AE, Wieder ED, et ai. (2008) fosfatidilinositol 3-quinase medeia broncoalveolar haste de expansão celular no mouse modelos de Oncogênicos

K-ras

Induzido por câncer pulmonar. PLoS ONE 3 (5): E2220. doi: 10.1371 /journal.pone.0002220

editor: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Dezembro, 2007; Aceito: 14 de abril de 2008; Publicado em: 21 de maio de 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. R01 CA117965 , R01 CA105155, CA105352 U01

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) é o líder. causa de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais e sua incidência está a aumentar na Ásia. Uma vez que tenha metastizado, não há terapias curativas para NSCLC. Uma melhor compreensão da patogênese e fatores de risco para esta doença irá contribuir não só para a melhoria da detecção precoce e prevenção, mas também para o desenvolvimento de terapias mais eficazes para isso.

Aproximadamente 10% das amostras de NSCLC carregam mutações ativadoras em

K-ras

[1]. O subtipo histológico de CPNPC que mais frequentemente tem

K-ras

mutações é adenocarcinoma; 30% de adenocarcinomas têm estas mutações.

K-ras

mutações também foram identificados hiperplasia adenomatosa atípica lesões (AAH), que são pensados ​​para preceder o desenvolvimento de adenocarcinoma do pulmão [2]. Um crescente corpo de evidências indica que

K-ras

mutações são importantes na iniciação do desenvolvimento de adenocarcinoma de pulmão. modelos de ratos têm sido desenvolvidos que expressam mutante

K-ras

condicionalmente, somaticamente, ou indutivelmente [3] – [7]. Estes ratinhos desenvolvem lesões AAH forma rápida e com alta penetrância, e um subconjunto destas lesões progredir para adenocarcinomas.

Uma célula candidato cancro do pulmão de células progenitoras (células-tronco broncoalveolar ou BASC) foi identificado em modelos murinos de

K-ras

cancro do pulmão induzida. BASCs têm um padrão específico do marcador com células-tronco expressão (Sca-1

pos CD34

pos CD45

neg PECAM

neg), estão localizados na brônquios terminal, e têm a capacidade de auto-renovação e sofrem diferenciação multi-linhagem [8]. Estas células podem ser o mesmo que a variante Clara (Clara ou

v) células, que estão localizados adjacentes a grupos de corpos em neuroendócrinos brônquios e bronquíolos. Semelhante a BASCs, Clara

células V são capazes de restaurar a população de células Clara após a lesão naftaleno [9]. Após a instalação intra-nasal de Cre adenoviral em Kras

camundongos LSL, que se desenvolvem adenocarcinoma de pulmão devido à ativação de um condicionais oncogênicos

K-ras

alelo [5], BASCs rapidamente proliferar antes do desenvolvimento da histológico anormalidades [8]. Os BASCs nestes ratinhos conter

K-ras

mutações idênticas às encontradas em tumores [8]. Com base nesta evidência, BASCs são postulados para ser progenitores de adenocarcinoma do pulmão em ratinhos. Os sinais bioquímicos que iniciam a expansão desta população celular não foram completamente elucidados. Esta deficiência é importante, dado que a elucidação desses sinais pode levar a um melhor tratamento para doentes com NSCLC.

lesões pré-malignas tipicamente submetidos a uma expansão transiente seguida de senescência programado, e apenas uma minoria de lesões precoces progride para uma totalmente transformado Estado. No caso de modelos de Ras-dependentes de ratinho do cancro, a senescência programado de lesões pré-malignas é activado pela proteína cinase cinase /extracelular de sinalização da cinase regulada por sinal activada por mitogénio, que inibe de Ras através de vias de re-alimentação que envolvem o aumento da expressão de proteínas Sprouty, Ras GTPase activar proteínas, e MAP quinase fosfatase-3 [10]. O programa de senescência em lesões pré-malignas pode ser bloqueada por 3-quinase (PI3K) activação fosfatidilinositol [10], o que indica que a PI3K é um determinante essencial da progressão maligna das lesões. Na verdade, a sinalização PI3K é constitutivamente ativados nas células NSCLC através de inativação de mutações somáticas no, ou silenciamento epigenético de,

fosfatase e tensina homólogo eliminado do cromossoma 10

(

Pten

), uma fosfatase lipídica que regula negativamente a cascata de sinalização PI3K [11] – [15]

neste estudo, avaliou-se a importância de PI3K na regulação da expansão da BASCs em dois modelos genéticos rato de oncogênico

K-ras-.

câncer de pulmão induzido. Os oncogênicos

K-ras

alelos nestes modelos são ativados somática em um (Kras

LA1) e condicionalmente no outro (Kras

LSL) (5, 7). Encontramos aumento do número de BASCs nesses camundongos com relação aos de ninhada de tipo selvagem. expansão BASC e progressão maligna no pulmão foram atenuados pela inibição farmacológica da PI3K e reforçada por inactivação genética da

Pten

. Nós especulamos sobre a base destes resultados que as estratégias farmacológicas para inibir PI3K será útil na prevenção e tratamento do NSCLC.

Resultados

PX-866 inibe tumorigênese pulmonar em Kras

LA1 camundongos

Nós postulamos que PI3K é necessário para progressão maligna do cancro do pulmão e testado esta hipótese usando ratos Kras

LA1 como um modelo de desenvolvimento de neoplasias de pulmão. Várias semanas após o nascimento, Kras

camundongos LA1 exibem lesões AAH multifocais que, por 2-3 meses de idade, se aglutinam em adenomas sólidos ou papilar, que aumenta e se submetem a transformação histológica em adenocarcinomas por 6-8 meses [7]. O primeiro avaliada a expressão de PI3K (p110α e p isoformas), em tecidos pulmonares em diferentes fases de tumorigénese (AAH, adenoma, adenocarcinoma) ou. Estas isoformas PI3K foram detectados e sua abundância aumentou com a progressão maligna (lesões AAH

contra

adenocarcinomas:

P

= 0,006 para p110α;

P Art 0,001 para p110β) ( Figura 1A).

(A) PI3K expressão aumenta com a progressão maligna. coloração imuno-histoquímica representante de lesões na microsséries de tecido e sua quantificação em gráficos de barras adjacentes. barra de calibração no painel inferior direito representa 100 m. Dezenas de (sólido /papilar) adenomas mistos estão incluídas na gráficos de barras, mas não em imagens de coloração PI3K. (B) PI3K é necessária para o crescimento tumoral. Significar mudanças na multiplicidade de tumores eo volume determinado por tomografia computadorizada de micro realizados antes e após o tratamento. (*

P

0,05 comparado com o veículo). (C) PX-866 inibe a PI3K nos tecidos pulmonares. Western blotting de AKT Ser473 fosforilada (P-Akt) e Ser21 /9-fosforiladas da GSK3 (P-GSK3α /β) em lisados ​​pulmonares inteiras a partir de murganhos (n = 7 em cada grupo de tratamento). As posições dos marcadores de peso molecular estão indicados à esquerda. (D) PX-866 diminui a proliferação de células tumorais. a coloração imuno-histoquímica representativas de histona H3 Ser28-fosforilada (P-H3) em adenomas na tissue microarray (x 20 ampliação, as áreas com as células positivas cercadas) e quantificação da coloração em 16 lesões de ratinhos tratados com veículo e 4 lesões do PX-866 camundongos tenha sido tratada com (gráfico de barras, *

P Art 0,05 em relação ao veículo). Inset ilustra células cercada pelo × 40 ampliação. Barras de calibração representam 200 mm.

Com base na sua maior abundância em células totalmente transformadas, nós próxima procuraram determinar se PI3K foi necessário para o crescimento do tumor. Tratamento de K-ras

LA1 volume de ratinhos com PX-866, um inibidor de PI3K [16], diminuiu pulmão lesão e multiplicidade (Figura 1B). Isto foi acompanhado por uma redução na actividade de PI3K como mostrado por Western blotting de lisados ​​de todo o pulmão para AKT fosforilado e glicogénio sintase quinase-3 (Figura 1C). As células tumorais foram submetidos a uma redução na proliferação causada por PX-866 baseado em intra-lesional histona H3 fosforilada (Figura 1E), mas não exibiram evidência bioquímica de apoptose como se mostra por transferência de Western para a caspase-3 clivada e poli (ADP-ribose) polimerase ( dados não mostrados). Assim, o tratamento com um antagonista PI3K profundamente inibiu o crescimento dessas lesões precoces.

BASCs são altamente sensíveis a PX-866

in vivo

e

in vitro

a seguir, determinar se o efeito anti-tumoral de PX-866 em Kras

camundongos LA1 foi em parte devido à inibição da expansão BASC. No brônquios terminais, um subconjunto de células epiteliais expressa ambas as proteínas de clara de células específicas (ccsp) e tensioactivo proteína-C (CCP) (Figura 2), que é uma característica da BASCs [8]. Quantificação de células dual-positivos em camundongos selvagens (com 83 brônquios) e K-ras

camundongos LA1 (com 66 brônquios) revelou que há camundongos selvagens tinha mais de 3 BASCs por brônquio terminal, enquanto que um subconjunto de brônquios terminal no K-ras

camundongos LA1 tinha 4 a 7 (

P

= 0,042, do tipo selvagem

contra

Kras

LA1) (Figura 2). Assim, um subconjunto dos brônquios terminais em Kras

camundongos LA1 teve expansão BASC. Além disso, os estudos de imunofluorescência revelou que triplos BASCs expressa p110α e tinha fosforilação de AKT detectável (Figura 3), um mediador a jusante de PI3K, proporcionando evidência de activação de PI3K nestas células. Usando cortes de tecido do Kras

camundongos tratados com LA1 PX-866 (com 88 terminais brônquios) ou veículo (com 81 terminais brônquios), determinou-se o número de BASCs por brônquios terminais nos grupos de tratamento. Os ratos tratados com veículo apresentaram um subconjunto dos brônquios terminal com 4 a 7 BASCs brônquio por terminal, enquanto que nenhum dos ratinhos tratados com PX-866 tinham mais do que três BASCs por brônquio terminal (

P = 0,025

, veículo

contra

PX-866-tratado) (Figura 4).

coloração de imunofluorescência para detectar células em brônquios terminais que co-expressam CCSP e SPC. BASCs cercadas em painéis de topo (x10 ampliação) ilustrados na painéis inferiores em maior ampliação (x40). gráfico de barras indica percentagens de brônquios terminais com os números indicados de BASCs. Barras de calibração em imagens de H E tecidos manchados representam 50 mm

coloração de imunofluorescência de secções de tecido para detectar triplamente corados células (CCSP /SPC /p110α ou pAKT) em brônquios terminal.. BASCs cercada (x40 ampliação). barra de calibração no painel inferior direito representa 50 um.

coloração de imunofluorescência para detectar células em brônquios terminais que co-express CCSP e SPC. BASCs cercadas em painéis de topo (10 × ampliação) ilustrados na painéis inferiores em maior ampliação (× 40). gráfico de barras indica percentagens de brônquios terminais com os números indicados de BASCS. Barras de calibração em imagens de H E tecidos manchados representam 50 mm

Para determinar se PX-866 teve efeitos diretos sobre Kras

LA1 derivado BASCs, usamos culturas BASC primárias, que eram. isolado dos pulmões de Kras

camundongos LA1 classificando para as células que estavam Sca-1

pos, CD34

pos, CD45

neg, e CD31

neg. Estas células separadas co-expressas ccsp e SPC (Figura 5A), as colónias formadas quando semeadas em culturas de alimentação (Figura 5b), e exibiram capacidade de diferenciação de vários potencial quando colocadas em matrigel (Figura 5C), o que são características de BASCs [8] . PX-866 tratamento levou a uma diminuição de destaque na formação de colónia atividade BASC (Figura 5D), indicando que PX-866 teve um efeito direto sobre BASCs.

(A) As células seleccionadas SPC co-express e CCSP. Kras

LA1 tecidos pulmonares inteiras foram dissociadas e classificado para isolar Sca-1

pos CD45

neg CD31

neg CD34

células POS (P4 e P5, em painéis da esquerda e média, respectivamente), que foram sujeitas a coloração de imunofluorescência (ampliação de X40, painel da direita). barra de calibração no painel da direita representa 10 mm. (B) BASCs formar colónias quando semeadas em culturas de alimentação. Fotografia de colônia (ampliação x10) formada após a colocação inicial (P1) e passagem 2 (P2). barra de calibração no painel à direita representa 50 um. (C) BASCs diferenciar quando plaqueadas em matrigel. As células foram coradas após 7 d em matrigel (ampliação x10) e o número de células com características de células alveolares tipo II (CCSP

neg SPC

pos), as células de Clara (CCSP

pos SPC

neg ), ou BASCs (CCSP

pos SPC

pos) foram contadas e expressas como as percentagens do total de 158 células contadas em um gráfico de pizza. Exemplos de células com características de células ATII (ATII) e células Clara (CC) estão indicados. barra de calibração no painel da direita representa 50 um. (D) PX-866 inibe a formação de colónia BASC. Fotografias (ampliação) x10 e quantificação das colónias por poço (5 poços por condição) formado após 6 d na presença ou ausência de PX-866. barra de calibração no painel à direita representa 50 um.

deficiência Pten

aumenta oncogênico

K-ras

induzida BASC acumulação

Como outro abordagem para avaliar o papel da via PI3K em expansão BASC, nós inactivado

Pten

, um regulador negativo da PI3K, em células que expressam CCSP.

Pten

foi geneticamente inactivada usando

Pten

flox /+ camundongos, que têm um

Pten

alelos que contém

LoxP

locais em torno da domínio de fosfatase PTEN codificado pelo exão 5 [17].

Pten

foi recombinado especificamente no pulmão através do cruzamento desses ratos com CCSP

cre /+ camundongos, que expressam Cre sob o controle do

CCSP

gene [18]. Além disso, avaliou-se

Pten

inativação cooperado com oncogénico

K-ras

para promover a expansão BASC.

camundongos -deficient PTEN

foram cruzado com K-ras

camundongos LSL, em que a expressão de oncogênico

K-ras

G12D

é controlada por um elemento de terminação da transcrição PARAR removível [5]. Usando essa abordagem, os ratos foram gerados com brônquios que são

Pten

-deficient (Pten

Δ5 /Δ5; CCSP

Cre /+), expressa oncogênico

K-ras

( Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+), têm

Pten

deficiência e oncogênico

K-ras

expressão (Pten

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) ou não têm nem (Pten

Flox /Flox; CCSP

+ /+). Os ratos foram sacrificados em 4 semanas ou 12 semanas, e os seus tecidos pulmonares foram submetidos a estudos de imunofluorescência para quantificar BASCs.

Como esperado, imunofluorescência coloração tripla (CCSP /SPC /PTEN) revelou perda de expressão de PTEN em BASCs de ratos que foram ambos

Pten

-deficient e

K-ras

-transformed (Pten

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) mas não em ratinhos que foram apenas

K-ras

-transformed (Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) (Figura 6). Quantificação de BASCs por brônquios terminais em 4 semanas revelou que

Pten

-deficiência sozinho (Pten

Δ5 /Δ5; CCSP

Cre /+) não foi suficiente para alterar BASC números em relação à de controle camundongos (Pten

Flox /Flox; CCSP

+ /+) (Figura 7). No entanto, a comparação de números BASC em Pten

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

cre /+ ratos para a de Kras

Lox /+; CCSP

Cre ratos /+ demonstrou que

deficiência Pten

notavelmente melhorada expansão BASC por oncogênico

K-ras

(

P

= 0,006, Pten

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+

contra

Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) (Figura 7). Além dessas descobertas no brônquios terminal, aglomerados de CCSP

pos SPC

células pos foram observados nos bronquíolos e brônquios pequena de Pten

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

cre /+ camundongos; estes grupos de células eram evidentes tão cedo quanto 4 semanas de idade e não estavam presentes nos brônquios e bronquíolos de Kras

Lox /+; CCSP

cre /+ ratinhos (Figura 8). Conclui-se que

Pten

inativação cooperado com oncogénico

K-ras

para reforçar a acumulação de BASC.

coloração de imunofluorescência de secções de tecido para detectar triplamente corados (CCSP /SPC /PTEN) células em brônquios terminais. BASCs (cercado) ilustrados no × 10 ampliação. barra de calibração no painel inferior direito representa 100 m.

coloração de imunofluorescência para detectar células em brônquios terminais que co-express CCSP e SPC. BASCs (cercado) ilustrados no × 40 ampliação. gráfico de barras indica percentagens de brônquios terminais com os números indicados de BASCS. barra de calibração no painel inferior direito representa 100 m.

imunofluorescência coloração para detectar células que co-express CCSP e SPC. BASCs (cercado) ilustrados no × 10 ampliação. gráfico de barras ilustra percentagens de brônquios com os números indicados de BASCS. barra de calibração no painel inferior direito representa 100 m.

Discussão

Aqui nós relatamos que PI3K foi necessária para a expansão BASC iniciada por oncogênico

K-ras

e, quando constitutivamente activado por

Pten

inactivação, PI3K cooperado com oncogênicos

K-ras

neste processo. Esta conclusão foi baseada em resultados de experimentos que incorporou abordagens farmacológicas e genéticas para direcionar PI3K em dois diferentes modelos de ratos genéticos e um

in vitro

modelo. Temos relatado anteriormente que

Pten

inativação coopera com oncogénico

K-ras

para acelerar tumorigênese pulmonar, causando tumores pulmonares que são mais histologicamente avançada e obstruem mais rapidamente do lúmen brônquico e substituir espaços alveolares do que aqueles de camundongos com oncogénico

K-ras

sozinho [18]. Juntos, estes resultados levantam a possibilidade de que PI3K promovido tumorigênese pulmonar através de seus efeitos sobre BASCs. No entanto, evidências conclusivas a esse respeito vai exigir prova de que adenocarcinomas surgem de BASCs. estudos de transplante para determinar se as injecções BASC são suficientes para recapitular o desenvolvimento de adenocarcinoma de pulmão em camundongos, até agora, não foram relatados. Uma população de células estaminais tem sido identificada nos pulmões de ratinhos e em tumores de doentes com NSCLC que expressa CD133, exposições resultam características celulares

in vitro (

forma esferas e podem ser induzidas a sofrer diferenciação terminal), e é tumorigénico em ratinhos nus [19]. Embora certas características dessa população de células estaminais são semelhantes aos de BASCs (ie resposta a lesão pulmonar induzida por naftaleno), a relação continua a ser elucidado.

Quando iniciado durante a embriogênese, condicional

Pten

inactivação no pulmão leva à hipoxia perinatal e morte, o que indica que

Pten

expressão é necessária para o desenvolvimento normal do pulmão [20]. Neste estudo, a expressão Cre no CCSP

ratinhos Cre começou no dia pós-natal 4, permitindo-nos avaliar

papel na manutenção da função pulmonar após o nascimento do Pten

. Embora não podemos excluir a possibilidade de que mudanças sutis na função pulmonar ocorreu, o

Pten

ratos -deficient neste estudo não teve alterações óbvias na sua estrutura pulmonar e exibiu nenhuma morbidade em até 12 meses de idade, sugerindo que, após o nascimento, os tecidos do pulmão pode funcionar normalmente sem

Pten

. Esta aparente resiliência dos tecidos pulmonares para

deficiência Pten

está em contraste com as células-tronco hematopoiéticas adultas, que são esgotadas dentro de 40 dias após a inactivação de

Pten

[21], indicando que a auto-renovação capacidades de células-tronco hematopoiéticas não pode ser mantida na ausência de sinais reguladores de crescimento negativo de PTEN. Embora as razões para esta diferença não são claros, pode ser relacionada, em parte, para a raridade relativa com que as células estaminais do pulmão, normalmente, dividir [9].

PI3K foi reportado para desempenhar um papel importante em tumorigénese iniciada pela oncogênicos

K-ras

. camundongos Kras

LA2 que têm um knock-in

PIK3CA

mutação que bloqueia a interacção de PI3K com K-ras desenvolver muito menos tumores de pulmão do que Kras

camundongos LA2 com o tipo selvagem

PIK3CA

[22], indicando um papel chave para a PI3K como um mediador a jusante de K-ras. Corroborando esse ponto, nós descobrimos que o tratamento PX-866 inibiu o crescimento do tumor de pulmão em Kras

LA1 ratos. No entanto, com base em outros resultados relatados aqui, a importância da PI3K em

K-ras

tumorigênese pulmonar induzida não pode ser restrita ao seu papel como mediador a jusante do K-ras. Em primeiro lugar, a expressão PI3K aumentada como Kras

tecidos LA1 pulmonares foram submetidos a progressão maligna de AAH para adenocarcinoma, sugerindo que PI3K foi ativado nestas lesões histologicamente avançados, em parte, através de mecanismos de K-ras-independentes. Em segundo lugar, os resultados relatados aqui e em outros lugares [18] indicam que

Pten

inativação reforçada oncogênico

K-ras

tumorigênese pulmonar induzida em ratos. Extrapolando a partir destes resultados, mutações somáticas em células NSCLC envolvendo genes que regulam a sinalização dependentes de PI3K (ou seja,

Pten, Egfr

, e

PIK3CA

, entre outros [ref. 23]) pode transformá-los células em parte por cooperar com oncogénico

K-ras

. A importância potencial de mutações somáticas secundárias na promoção oncogénicos

K-ras

tumorigénese pulmonar induzida é ilustrada pelos longos latências dos adenocarcinomas que surgem em ratos geneticamente modificados para expressar o mutante

K-ras

, que desenvolvem lesões pulmonares rapidamente e com elevada penetrância, mas apenas uma fracção das lesões progridem em adenocarcinomas e requerem vários meses para fazê-lo [3] – [7]

os resultados aqui relatados diferiam daqueles reportados previamente em um. diferente estirpe de ratinhos que sofrem condicional

Pten

supressão induzida pela expressão Cre SPC-driven [20]. Nesse relatório,

Pten

inativação foi suficiente para aumentar o número de BASC e induzir tumores de pulmão, que está em contraste com os resultados aqui apresentados e em outros lugares [18] que

deficiência Pten

não é suficiente para aumentar números BASC ou induzir tumores de pulmão. Esse relatório anterior também diferiam em relação aos eventos genéticos que cooperaram com deficiência

Pten

. Nesse estudo,

Pten

tumorigênese inativação acelerada pulmonar induzida por uretano, uma substância cancerígena que muitas vezes induz

K-ras

mutações, mas apenas 2 de 6 tumores avaliados tiveram

K-ras

mutações, o que deixa em aberto a possibilidade de que uretano coopera com

Pten

perda por induzir mutações somáticas de outros do que genes

K-ras

. Isso está em contraste com o nosso modelo em que os condicionais

K-ras

e

PTEN

alelos recombinados nas mesmas células (que expressam CCSP). Assim, os resultados díspares destes estudos pode estar relacionada a eventos genéticos secundárias nos ratos ou diferenças no desenho experimental, tais como as origens genéticas dos ratos ou os elementos promotores específicos de condução expressão Cre tratados com uretano.

métodos

Reagentes

Os anticorpos adquiridos para estes estudos incluem coelho anti-p110α (sc-7174), p110β (sc-7175), SPC (sc-13979), de cabra anti-CC10 (sc -9772) e PTEN (sc-6818) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de coelho anti-AKT total (9272), AKT Ser473 fosforilada (9271), Ser21 /9-fosforilada GSK3α /β (9331), total de GSK3 (9332), caspase-3 (9661), poli (ADP-ribose) polimerase (9542), H3 fosforilada-histona (9701), Ser28-fosforilada histona H3 (9713P) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) , de coelho anti-SPC (WRAB-SPC, Seven Hills Bioagentes, Cincinnati, OH), de coelho anti-CCSP (07-623, Upstate Biotechnologies, Lake Placid, NY), conjugado com FITC anti-Sca-1 (557405), biotina -conjugated anti-CD45 (553771) conjugado com biotina-CD31 (558,737), conjugado com PE anti-CD34 (12-0341-33, eBioscience), anti-IgG de coelho Alexa Flour 488 (A11008), e anti-IgG de cabra Alexa farinha 594 (A11058) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Outros reagentes adquiridos incluem estreptavidina-APC (554067, BD Pharmigen), kits de TSA 22 (T20932), 25 (T20935), e 27 (T20937), avidina /biotina bloqueio kit (00-4303) (Invitrogen), Dispase (354,235, BD Biosciences), colagenase /dispase (10269638001, Roche Biosciences), e 7-aminoactinomycin D (A1310, Invitrogen).

estudos mouse

Para testar se PI3K promove o desenvolvimento do tumor, 9 K- ras

ratinhos LA1 foram tratados durante 4 semanas com 2 mg /kg /d PX-866 intra-gástrico, uma pequena molécula inibidora de PI3K [12], e 12 receberam veículo começando aos 4 meses, uma idade em que pulmão lesões (AAH e adenomas) são mensuráveis ​​por tomografia computadorizada de micro. Os ratos foram submetidos a esses exames no início e término do tratamento para contar número de lesões e avaliar mudanças nos volumes de lesão ao longo do tempo conforme relatado anteriormente [24].

Antes de seu início, todos os estudos com ratos foram submetidos e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade do Texas-M. D. Anderson Cancer Center. Camundongos receberam padrões de atendimento e foram sacrificados de acordo com as normas estabelecidas pelo IACUC. Camundongos e células e foram obtidos através de colaborações com Dr. Tyler Jacks, MIT (ratos Kras

LA1 e Kras

camundongos LSL), Dr. Hong Wu, UCLA (Pten

flox ratos), e Dr. Francesco Demayo, Baylor College of Medicine (CCSP

Cre ratos).

Tissue microarrays e imuno-histoquímica

Foi realizada análise imuno-histoquímica de PI3K em um tissue microarray contendo AAH (n = 17) , adenomas sólidos (n = 31), sólidos mistos adenoma papilar /(n = 36), adenomas papilares (n = 45), e adenocarcinomas (n = 14) para determinar se os níveis de PI3K alterados durante a progressão maligna. Analisou-se a expressão das isoformas de PI3K (p110α e p).

Para coloração imuno-histoquímica, 4 uM secções embebidas em parafina foram cozidas a 60 ° C durante 30 min e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente. As secções foram incubadas sequencialmente em xileno (5 min, duas vezes), álcool 100% de acetato de (5 min, duas vezes), álcool etílico a 95% (5 min, duas vezes), e álcool etílico a 80% (5 min). Depois de se lavar com água, as secções foram recuperadas usando tampão de citrato-antigénio (pH 6,0, DAKO) num vaporizador durante 20 min e arrefecida até à temperatura ambiente. As secções foram então lavadas com TBS-T e extinguiu-se com 3% de peróxido de hidrogénio em TBS durante 10 min, bloqueados para a actividade de avidina /biotina, e incubadas com o anticorpo primário como se segue: Para p110α e coloração p110β, as secções foram bloqueadas com soro de cabra a 5% durante 1 h, incubados com anticorpos primários durante 1 h à temperatura ambiente, e, em seguida, lavada com TBS-T; para a coloração de histona H3 fosforilada-Ser28, as secções foram bloqueadas com soro de cabra a 10%, a 4 ° C durante a noite, incubada com anticorpo primário durante 30 min à temperatura ambiente, e lavada com TBS-T. A coloração foi desenvolvido usando o sistema de substrato DAB. Os controlos negativos incluíram omissão do anticorpo primário e pré-incubação do anticorpo primário com o bloqueio péptido. A coloração foi quantificada por um investigador (M.G.R.) cegos quanto ao grupo de tratamento. expressão intra-lesional foi pontuada com base na intensidade de coloração e extensão, como descrito anteriormente [24].

Detecção de BASCs em tecidos pulmonares

Antígenos foram recuperados a partir de tecidos do mouse pulmão com 0,01 mol /L de citrato tampão (pH 6; DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 25 min em um navio. As lâminas foram temperadas em peróxido de hidrogénio a 1,5% em solução salina tamponada com Tris, durante 10 minutos e bloqueadas em bloco de proteína livre de soro Dako (Dako) durante 1 h à temperatura ambiente. As lâminas foram então incubadas com anti-CCP (sc-7705, Santa Cruz Biotechnology; WRAB-SPC, Sete Hills Bioreagents) e anticorpos, a 4 ° C durante a noite anti-ccsp (07-623, Upstate Biochemicals). A imunofluorescência foi desenvolvido utilizando kits TSA 25 e 22 (Invitrogen) a partir das instruções do fabricante. Utilizou-se os péptidos de bloqueio e omitidos os anticorpos primários como controlos negativos para determinar a especificidade da imunocoloração os resultados. Imunofluorescência foi visualizado utilizando um microscópio de fluorescência com um sistema reflectida (Olympus Modelo IX71SIF-2). aquisição cor e fluorescência de fundo foram otimizados usando o software DPController e DPManager (Olympus).

isolamento BASC e da cultura

Os ratos foram mortos após 12 semanas, e os pulmões foram perfundidos com 10 mL de solução salina equilibrada de Hank através do ventrículo direito até que eles foram limpos de sangue. As traqueias foram injetados com Dispase (líquido não diluído, BD Biosciences), seguido de 0,5-1 mL de 1% LMP agarose em água. Os pulmões foram colocados em gelo, cortado em pedaços, incubadas com 0,001% de DNase (Sigma D-4527) e 2 mg /ml de colagenase /dispase (100 mg /mL, Roche) em solução salina tamponada com fosfato a 37 ° C durante 45 minutos, filtrada (100 uM, seguida de 40 uM de tamanho de poro do filtro-), e centrifugou-se. As peletes resultantes foram ressuspensas em 2 mL de PF10 (soro fetal bovino a 10% em solução salina tamponada com fosfato), o que produz tipicamente 1-2 milhões de células totais por ratinho. Os glóbulos vermelhos foram lisados. BASCs foram isolados por triagem do Sca-1

CD45 pos

neg PECAM

neg CD34

população de células pos em um classificador de células activadas por fluorescência de três a laser de cor 13-FACS Aria (BD Biosciences) que é capaz de separar sub-populações de quatro a uma pressão baixa, com uma taxa máxima de 20 milhões de células /hora. BASCs representado aproximadamente 0,1% do total da população de células classificadas.

A uniformidade ou a pureza das células separadas não foi verificado rotineiramente, porque as células de interesse teria sido consumido no processo. Dito isto, as células foram sort-purificado para o mais alto grau de pureza possível por gating em tamanho (de dispersão frontal e lateral), excluindo dobletes (por largura de dispersão para a frente

contra

área e largura de dispersão lateral

contra

área), e isolando as células com os marcadores de interesse. Além disso, a uniformidade das populações de células classificadas utilizados nestes ensaios foi reflectida pela reprodutibilidade das nossas descobertas;